Autoimmuunitutkimusten validointi. Markku Viander Turun yliopisto Lääketieteellinen mikrobiologia

Autoimmuunitutkimusten validointi Markku Viander Turun yliopisto Lääketieteellinen mikrobiologia

Validointia tarvitaan Uuden menetelmän kehittelyssä Kun vanha menetelmä korvataan uudella Menetelmän kliinisen merkityksen selvittämiseksi

Toimiiko menetelmä? Herkkyys analyyttinen funktionaalinen (CV% 10-20) Toistettavuus (precision) intra-assay/ assay/ interassay laadunvalvonta (mittausepävarmuus) Täsmäävyys (accuracy) kalibrointi, referenssiseerumit (WHO, IUIS, CDC) laadunvalvonta

Toimiiko menetelmä 2? Spesifisyys antigeenin puhtaus / rekombinantti vs. natiivi kliininen spesif.: autovasta-aineiden aineiden kliininen merkitys (specificity) Interferoivat tekijät ristireaktiot, vasta-aineiden aineiden laatu heterofiiliset vasta-aineet aineet hemolyysi, lipemia, hyperbilirubinemia, RF..

Toimiiko menetelmä 3? Lineaarisuus tulostusalue hook-ilmiö Drift Recovery

Toimiiko menetelmä 4? Vertailu referenssimenetelmään tai muihin saatavilla oleviin hyväksyttyihin testeihin Viitearvot (reference limits/interval) terveet verenluovuttajat (reference sample group) ikäryhmät Potilastulokset kliinisesti diagnosoidut potilaat muita tauteja sairastavat (diseased controls)

ELISA-menetelmän validointi 1 Antigeeni: puhdistaminen, kaupallinen (natiivi, rekobinantti) Antigeenin konsentraatio, kiinnitys ELISA-levy Entsyymileimatut vasta-aineet aineet Puskurit: kouttaus-,, blokkaus-,, näyte- ja pesupuskurit (tausta!) Levyn tasaisuus

Levyn tasaisuus (CV 9.76%) 3 2,5 2 2,5-3 2-2,5 1,5 1,5-2 1 1-1,5 0,5 0,5-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 S1 S5 0-0,5

ELISA-menetelmän validointi 2 Määritysolosuhteiden testaus: pesukertojen vaikutus Kinetiikka Drift, carry over Häiritsevät tekijät ja ristireaktiot: reumafaktori, hemolyysi, lipeeminen näyte Toistuvuus: intra- ja inter-assay CV%

Drift Näytteet lopussa (abs) 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 1,0271x R 2 = 0,9919 Drift 2 Linear (Drift 2) 0 0,5 1 1,5 Näytteet alussa (abs)

rttg-vert 2 1,8 1,6 y = 0,9454x R 2 = 0,9044 1,4 1,2 Eija 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,5 1 1,5 2 Liisi

10,300 10,300 11,200 11,200 23,600 23,600 47,100 47,100 CV% CV% 0,103 0,103 0,066 0,066 0,072 0,072 0,016 0,016 SD SD 1,001 1,001 0,590 0,590 0,305 0,305 0,034 0,034 Mean Mean 1,099 1,099 0,590 0,590 0,332 0,332 0,057 0,057 08.08 08.08 1,242 1,242 0,638 0,638 0,429 0,429 0,021 0,021 08.08. 08.08. 0,942 0,942 0,546 0,546 0,296 0,296 0,029 0,029 05.08. 05.08. 0,946 0,946 0,505 0,505 0,317 0,317 0,043 0,043 05.08. 05.08. 0,935 0,935 0,715 0,715 0,398 0,398 0,057 0,057 01.08. 01.08. 0,982 0,982 0,649 0,649 0,289 0,289 0,049 0,049 01.08. 01.08. 0,960 0,960 0,529 0,529 0,241 0,241 0,024 0,024 29.07. 29.07. 0,992 0,992 0,619 0,619 0,323 0,323 0,027 0,027 29.07. 29.07. 0,881 0,881 0,523 0,523 0,200 0,200 0,014 0,014 25.07. 25.07. 1,027 1,027 0,587 0,587 0,226 0,226 0,017 0,017 25.07. 25.07. K4 K4 K3 K3 K2 K2 K1 K1 rttg rttg Interassay Interassay CV CV

ELISA-menetelmän validointi 3 Kalibraattori: international standard? humaani seerumi? apinan seerumi? Cut-off raja: kontrolliaineisto, viitealue Vertailu toiseen menetelmään tai kaupalliseen kittiin Kliininen validointi: sensitiivisyys ja spesifisyys ROC (Receiver Operating Characteristic) kuvaajat

Referenssiseerumit WHO International Reference /batch 1066.01 (1( 1 IU RF / 0,171 mg) WHO Preparation for Antinuclear Factor 66/233 (ANA( homog., ndna, U/ml) IUIS-ANA subcommittee / AF- CDC: 10 erilaista ANA/ENA kontrolliseerumia Juvenile Diabetes Foundation (JDF reference serum for ICA JDF-U/ml)

ELISA-menetelmän validointi 3 Kalibraattori: international standard? humaani seerumi? apinan seerumi? Cut-off raja: kontrolliaineisto, viitealue Vertailu toiseen menetelmään tai kaupalliseen kittiin Kliininen validointi: sensitiivisyys ja spesifisyys ROC (Receiver Operating Characteristic) kuvaajat

Clinical decision limit operating point (Lusted, 1968) cut-off value (McNeil et al., 1975) referent value (Galen & Gambino, 1975) diagnostic treshold (Paukee & Kassirer, 1987) decision level (Statland, 1987) critical value (NCCLS, 1992) decision limit (Solberg & Gräsbäck 1989; NCCLS 1992; Solberg 1994)

The basic requirements for the evaluation of clinical decision limits (Sunderman, 1975) Clear-cut definitions for the disease Demarcation of the stage in the pathogenesis of the disease Knowledge of the degree of overlap of the health and illness related data Knowledge of the prevalence of the disease Knowledge of the clinical costs, i.e. the clinical consequences of negative or positive misdiagnoses

ELISA-menetelmän validointi 3 Kalibraattori: international standard? humaani seerumi? apinan seerumi? Cut-off raja: kontrolliaineisto, viitealue Vertailu toiseen menetelmään tai kaupalliseen kittiin Kliininen validointi: sensitiivisyys, spesifisyys, PPV, NPV ROC (Receiver Operating Characteristic) kuvaajat

ttg IgA ROC 0,6 µg/ml 0,8 µg/ml 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 S e n s itiv ity 0,3 0,2 0,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 Specificity

rttg (EU/ml) n >0.15 0.10-0.14 <0.10 True positive Endo+ (titteri >5) 79 74 3 2 Endo +/- (titteri 1) 10 0 6 4 True negative Endo - 105 0 1 104 rttg-testin cut off >0,15 Sensitivity 74/89 = 83,10 % PPV 100 % Specificity 105/105 = 100,00 % NPV 87,50 %

rttg (EU/ml) n >0.15 0.10-0.14 <0.10 True positive Endo+ (titteri >5) 79 74 3 2 Endo +/- (titteri 1) 10 0 6 4 True negative Endo - 105 0 1 104 rttg-testin cut off = 0,10 Sensitivity 83/89 = 93,30 % PPV 98,80 % Specificity 104/105 = 99 % NPV 94,50 %

Systeemiset autoimmuunitaudit: prevalenssi SLE (ARA 1982, 1997) 11 kriteeriä; tuma- va; DNA-va, Sm-va, LE-solu, väärä positiivinen syfilisserologia [prevalenssi 0.4-1:1000] SjS (ACR, San Diego Criteria, 1998) sicca, kserostomia, ja biopsia tai SS-A [prevalenssi 2-6:1000] 2 SjS (ACR, EEC Criteria,1998) sicca, kserostomia, ei biopsiaa tai SS-A [prevalenssi 20-30:1000]

1000 RA (RF) Test Population Diseased Non Diseas ed Sum Prev 1 Positive 8 149 157 Sens 80 Negat 2 842 844 Spec 85 Sum 10 990 1 000 PPV 5 % NPV 99.8 %

RF (CC) Population 1000 Test Diseased Non Diseas ed Sum Prev 1 Positive 7 50 57 Sens 70 Negat 3 941 944 Spec 95 Sum 10 990 1 000 PPV 12 % NPV 99.7 %

RA (RF) GP 1000 Test Diseased Non Diseas ed Sum Prev 30 Positive 240 105 345 Sens 80 Negat 60 595 655 Spec 85 Sum 300 700 1 000 PPV 70 % NPV 91 %

RF (CC) GP 1000 Test Diseased Non Diseas ed Sum Prev 30 Positive 210 35 245 Sens 70 Negat 90 665 755 Spec 95 Sum 300 700 1 000 PPV 86 % NPV 88 %

Systeemiset autoimmuunitaudit: oireista diagnoosiin Oireet usein lieviä, epäspesifisiä ja vaihtelevia Ensioireet: usein vuosia ennen diagnoosia SLE: 2 v Sjögrenin syndr.: 7-97 9 v Raynaud -> > perustauti selville 2 v:ssa Merkkivasta-aineet aineet vuosia ennen tautia ANA, RF, CCP, ICA, ttg, EMA, AMA

Testin diagnostinen sensitiivisyys ja spesifisyys Uusi kaupallinen testi usein hyvin herkkä, täten diagnostinen spesifisyys laskee Vertailu verenluovuttajiin tai muuhun terveeseen populaatioon ei riitä Testit on validoitava käyttäen vertailuaineistona muihin tauteihin sairastuneita (disease controls) Mahdollista käyttää 2 eri cut-off arvoa diagnostinen (spesifinen) taudin aktiviteetin seuranta (herkkä)