Vasta-ainemääritys. Johdanto.

Transkriptio

1 Vasta-ainemääritys Johdanto Vasta-ainemääritys (engl. immunoassay) perustuu spesifisen vasta-aineen (engl. antibody) sitoutumiseen mitattavaan antigeeniin (engl. antigen). Menetelmän etuja ovat suuri herkkyys ja spesifisyys. Reaktio voi tapahtua liuoksessa tai kiinteällä pinnalla. Sitoutuminen saadaan mitattavaksi signaaliksi esim. reagenssin värimuutoksen tai valontuoton ansiosta. Yleisiä leimamolekyylejä ovat mm. entsyymit, radioisotoopit ja erilaiset fluoresoivat fluoroforit. Immunomäärityksiä on kahta päätyyppiä: kilpaileva ja ei-kilpaileva. Kilpailevassa määrityksessä kuoppalevyn kuoppiin pipetoidaan samaan aikaan näyte (potilasmäärityksissä usein verinäyte) ja leimattu vasta-aine, jotka kilpailevat spesifisestä vasta-aineen sitoutumispaikasta. Esimerkkikuvassa 1 on leimamolekyylinä fluoresoiva europium, joka pitää irrottaa kompleksista ennen mittaamista. Kilpailevan määrityksen standardikuvaajasta tulee pulkkamäki, jonka y-akseli on muotoa B/B max. Kuvaajaa voi olla mahdoton tehdä tarkasti yleisillä taulukkolaskentaohjelmilla (kuva 2). Jos käytettävissä ei ole erikoislaskentaohjelmia niin perustaulukkolaskennallakin pärjää useimmiten. Kuvassa 3 on esimerkkikuva, jossa dataan on sovitettu logaritminen standardikuvaaja. Lopputuloksen saa karkeasti kuvaajasta piirtämällä ja tarkasti käyttämällä yhtälöä ja ratkaisemalla tekijän x. Selitysaste ei tässä tapauksessa ole kovin hyvä eli lopputuloksista tulee tämän ansiosta epätarkkoja. Tilannetta voi parantaa poistamalla viimeinen standardi ja käyttämällä tämän jälkeen toisen asteen polynomia sovitteena (kuva 4). Näin voidaan nyt tehdä kun näytteen osuvat standardikuvaajan etuosaan. Kuva 1 Kilpailevan (engl. competative assay) FIA-immunomäärityksen (engl. fluoro immuno assay, FIA) periaatekuva. 1

2 Kuva 2 Kilpailevan immunomäärityksen standardikuvaajia. y-akseli on kilpailevassa määrityksessä muotoa B/B max. Kuva 3 Standardikuvaaja ja logaritminen yhtälösovite. Näyttetulokset noin 50 ja 140 nmol/l. Kuva 4 Standardikuvaaja ja 2. asteen polynominen yhtälösovite. Näyttetulokset noin 50 ja 110 nmol/l. 2

3 Kuvassa 5 on ei-kilpailevan määrityksen periaatekuva, jossa reagenssit lisätään peräjälkeen reaktioon. Standardikuvaajasta tulee tuolloin suora eli signaali kasvaa antigeenimäärän kasvaessa. Immunomäärityssovellutuksia löytyy runsaasti esimerkiksi potilasdiagnostiikasta, tutkimustyöstä ja elintarvikeanalyyseistä. Vasta-ainemääritys on toimiva määritysmenetelmä kun vaikka tarvitsee selvittää elintarvikenäytteen sopivuus vilja-allergiselle keliaakikolle tai kun pitää tietää onko henkilön sairastelun syynä punkinpureman aiheuttama borrelioosi. Kuva 5 Ei-kilpailevan immunomäärityksen (engl. sandwish assay) IFMA-periaatekuva (engl. immune fluorometric assay). Europium-leimalla on iso Stokesin siirtymä eli pitkä eksitaatio -ja emissioaallonpituuden ero. Leima antaa signaalia virityksen jälkeen pitkään, noin 1 ms ajan. Signaalin on laaduton luku signaalia sekunnissa, CPS (engl. counts per second). Näiden ominaisuuksien ansiosta fluoresenssimittaus voidaan tehdä aikaerotteisena (engl. Time-Resolved Fluorescence, TRF), jolloin analyysiherkkyys on parempi epäspesifisen fluoresenssin (=tausta) sammuttua. Kuvassa 6 on esitelty aikaerotteisen mittauksen periaate. Nykyään voidaan samasta reaktiosta mitata jo useita eri signaaleja, esimerkiksi PCR-laitteilla voidaan periaatteessa mitata jo jopa kuutta eri leimaa. Yhdestä näytteestä saadaan selville siis kuusi eri näytetulosta. Samassa reaktiossa leimojen lisääntyminen tarkoittaa usein menetelmäherkkyyden huononemista kun leimojen viritys- ja mittausalueet menevät osin päällekkäin. Kaupallisia kaksoisleimaimmunomäärityksiä on tällä hetkellä markkinoilla. Tuplaleimamittauksissa laiteohjelmointi on työläämpää kuin yhden leiman 3

4 mittauksissa, koska signaalit saattavat mennä osittain päällekkäin ja tämä limitys pitää poistaa matemaattisesti tuloslaskuissa. Kuva 6 Aikaerotteisen fluorometriamittauksen periaate. 4

5 Laboratoriotyö: Immunomääritys Määritykset voivat olla kalliita, joten suunnittele työsi hyvin ennen pipetointeja, ettet tuhlaa vahingossa reagensseja. Käytä hyväksesi esim. kuvan 7 suunnittelupohjaa. Myytävissä immunomäärityskiteissä on yleensä kaikki tarvittavat reagenssit ja materiaalit mukana. Pipetoinnit ja pesut voi tehdä tarvittaessa käsin esim. jos pipetointiautomaattia tai levypesuria ei ole käytettävissä. Jos tyhjennät kaivot kopauttamalla pöytään väärinpäin, niin käytä voimaa melko runsaasti, ettei tippoja jää kaivoihin. Pesuvaiheissa varo naarmuttamasta kuoppalevyn pintaa jos levypesuria ei ole käytettävissä. Mittausteknologioita on lukuisia, fluorometria ja absorbanssimittaukset ovat yleisiä. Määrityskittejä myyvät lukuisat eri toimittajat, Suomessa mm. Perkin Elmer (Wallac), Orion Diagnostica, Immuno Diagnostic ja City-Lab. Immunomääritysmenetelmän voi myös rakentaa itse jos kaupallista systeemiä ei ole ostettavissa. Muista veriteitse leviävien tautien riski (HIV, hepatiitti yms.) jos käsittelet verinäytteitä. Vasta-aineiden valmistuksessa käytetään usein myös seerumia kasvatusliuoksissa eli reagensseissa voi olla näiden tautien leviämisriski. Voit mitata myös kontrollinäytteitä, jolloin saatujen tulosten oikeellisuus on helppo tarkistaa. Kuva 7 Pipetoinnin suunnittelupohja 96-kuoppalevylle. 5

6 Tulosten käsittely LH-hormonin (ei-kilpaileva määritys) mittaustulokset on kuvassa 8 kahdella eri laitteella mitattuna. Kuvassa näkyy selvästi miten erilaisia signaalitasot voivat olla samalla näytteellä käytettäessä eri laitteita. Signaalitaustasuhde on kuitenkin molemmilla laitteilla samankaltainen (kuva 9). Kuva 8 LH-standardikuvaaja. Kuva 9 Signaali-tausta -suhteet LH-määrityksessä kahdella eri mittalaitteella. 6

7 Kysymyksiä/tehtäviä 1. Työturvallisuus. Mitä pitää näissä töissä huomioida? 2. Mitä tarkoittaa termi CV ja miten se lasketaan? 3. Mitä tarkoittaa termi B 0 tai B max? 4. Mitä tarkoittavat termit IFMA ja FIA? Mitkä ovat näiden merkittävimmät erot? 5. TRF, aikaerotteinen fluorometria. Mitä se tarkoittaa käytännössä ja mitä etua tällä tekniikalla saavutetaan verrattuna fluorometriaan? 6. Selvitä leimojen: samarium, terbium ja europium eksitaatio- ja emissioaallonpituudet. Mikä on mielestäsi leimoista paras? 7. Laboratoriossa mitataan säännöllisesti erilaisia potilasmäärityksiä. Laboratorio osallistuu kuukausittain kontrollimittauksiin ja tulokset tallennetaan valvontakorttiin. Selvitä minkälaisia matemaattisia rajoja valvontakorteissa on ja laadi alla olevan esimerkkikuvan mukainen valvontakortti saaduista tuloksista taulukkolaskentaohjelmalla. 8. Vertaa saatuja tuloksia kirjallisuuteen. 7