Laskuharjoitus 1 palautus mennessä Juha-Matti Alakoskela, jmalakos@cc.helsinki.fi

Transkriptio

1 Laskuharjoitus 1 palautus mennessä Juha-Matti Alakoskela, jmalakos@cc.helsinki.fi Yleistä Kurssin maksimipistemäärä on 44. Kaikista mahdollisista pisteistä 36 on jaossa kurssin tentissä, 4 laskuharjoituksista ja 4 laboratoriotöiden työselostuksista Toisin sanoen nämä saatavat pisteet eivät ole ylimääräisiä lisäpisteitä, vaan osa kurssin pisteytystä siinä kuin tenttikin. Kurssin hyväksyttyyn suorittamiseen vaaditaan 24 pistettä, minkä jälkeen arvosana kasvaa neljän pisteeen välein. Laskuharjoitusten ja tentin tehtävät tullevat myös olemaan luonteeltaan erilaisia eli laskuharjoitustehtäviä eivät ole tarkoitettu tenttitehtävien malleiksi, vaan pikemminkin erillisiksi oppimista tukeviksi harjoituksiksi. Lisäksi ehkä parempi olisi puhua vain harjoituksista, sillä laskemista ei läheskään kaikkiin tehtäviin liity. Laskuharjoituksista jaetaan raakapisteitä, joiden kokonaissumman perusteella jaetaan lopulliset neljä laskuharjoituspistettä lineaarisen asteikon mukaan. Esim. näistä laskuharjoituksista enimmillään saatavat 36 raakapistettä vastaavat 1,0 lopullista pistettä ja 18 pistettä vastaa 0,5 lopullista pistettä. Vastauksia ei tarvitse laskea/kirjoittaa käsin, vaan kaikkien tekstinkäsittely- ja laskentaohjelmien käyttö on sallittua. Käsinkin toki saa vastauksensa kirjoittaa. Vastaukset voi joko lähettää sähköpostina osoitteeseen jmalakos@cc.helsinki.fi (jos tiedosto kooltaan alle 500 kb) tai toimittaa TKK:lla laatikkoon, jonka sijainti ilmoitetaan (toivon mukaan) sähköpostitse. Tehtävä 1: Termodynamiikan perusteista 0 9 p. Tarkoituksena ei ole nyt perusteellisesti opettaa termodynamiikkaa, vaan pikemminkin antaa sen verran puolivillaisesti puolusteltuja muistisääntöjä, että olisi helpompi hahmottaa Gibbsin vapaaenerian merkitys ja oppikirjan sisältöä. Varsinainen termodynamiikan opetus jääköön fysiikan ja kemian kursseille. Lehninerissä esitetään kaava G= H-T S eli Gibbsin vapaaenerian muutos jollekin tapahtumalle on tapahtumaan liittyvän entalpian muutos miinus lämpötila kertaa tapahtumaan liittyvä entropian muutos. Entalpia H sinänsä lienee tuttu jo lukion kemiastakin. H=U+PV, missä U on lukion fysiikasta tuttu sisäeneria. Muistutukseksi huomautettakoon, että sisäenerian muutos U=Q+W, missä Q on siirtynyt lämpömäärä ja W on systeemiin tehty tai systeemin tekemä työ. Vastaavasti on entalpian muutos H= U+P V+V P. Useimmissa bioloisissa systeemeissä paine on likimain vakio, jolloin H= U+P V (koska siis P=0). Jos systeemi tekee ainoastaan laajentumistyötä, on W=-P V ja H= Q. Entropia puolestaan kuvaa tilan todennäköisyyttä. Mitä todennäköisemmin tila saataisiin sattumalta sitä suurempi on tilan entropia. S=k B lnw, missä W on mahdolliset tavat toteuttaa kyseiset tilat. A. Kaasuista ja lipideistä Sinulla kaksi samankokoista kaasupulloa, jotka liittää toisiinsa ohut ja lyhyt kannas. Systeemissäsi sinulla on yhteensä 10 identtistä kaasumolekyyliä. Mitkä ovat systeemin mahdolliset tilat kaasumolekyylien jakautumiselle kahden pullon välillä ja mikä on kuhunkin kaasumolekyylien jakaumaan liittyvä entropia yllä esitetyn perusteella? Miten tämäntapaiset asiat mahdollisesti liittyvät vesimolekyyleihin lipidien ympärillä? Tulokset voi laskea yksinkertaisesti kombinaatioina. Jos ajattelemme pullojen olevan nimettyjä, siis pullot 1 ja 2, niin saadaan arvot = 1, = 10, = 45, = 120, = 210, = 252 ja symmetrian perusteella 6:lle tulee sama kuin 4:lle jne., siis loput ovat 210, 120, 45, 10 ja 1 tässä järjestyksessä. Entropia saadaan yksinkertaisesti kertomalla edellisten luonnollinen loaritmi k B :lla eli Boltzmanin vakiolla. Siis arvot 0k B, 2,3k B, 3,8k B, 4,8k B, 5,3 k B, 5,5k B jne. Vesimolekyyleihin lipidien ympärillä tämä liittyy siten, että vesimolekyylillä on vähemmän erilaisia mahdollisuuksia orientoitua rasvahappo-/muun alkyyliketjun ympärillä, mistä on seurauksena se, että lipidien hydrofobisten osien on enereettisesti edullista pakkautua siten, että ne eivät ole vedessä. Ts. se on ns. hydrofobisen efektin perusta.

2 B. Entropian muutos -tehtävä Useimmiten on kuitenkin käytännössä mahdotonta laskea entropiaa tuolla tavalla. Tiedetään, että johonkin muutokseen liittyvä maailmankaikkeuden entropian muutos S M = S+ S Y, missä S on systeemin itsensä entropian muutos ja S Y ympäristön entropian muutos. Toisaalta mille tahansa systeemille entropia on 1 S = S + dq T 0, missä dq on systeemiin tuotu pienen pieni lämpömäärä, jonka yli interoidaan. Ts. S= Q/T. Systeemi puolestaan tietysti ottaa tai luovuttaa vastaavan määrän lämpöä ympäristöstään, joten ympäristölle muutos on S Y =- Q/T. Lämmön tuominen systeemiin lisää entropiaa. Vaikkei yhteyden täsmällinen muoto olekaan ilmeinen, niin sinänsä lienee ymmärrettävää, että systeemin enerian lisääntyessä entropiakin kasvaa. Osoita edellä annettujen tietojen perusteella, että vakiopaineessa ja -lämpötilassa pelkästään laajentumistyötä tekevän systeemin johonkin tapahtumaan liittyvä G<0 vastaa sitä, S M >0 eli sitä, että maailmankaikkeuden kokonaisentropia lisääntyy. Tehtävän alussa annetuista tiedoista nähdään, että tällaisessa tilanteessa H= Q, joten G= Q-T S<0 vastaa sitä, että T S> Q siis S> Q/T. Näin ollen S M = S+ S Y = S- Q/T>0, koska S> Q/T. C. Tiettyyn reaktioon A B liittyvät systeemin entropian ja entalpian muutokset ovat seuraavanlaiset: a) H>0, S>0 b) H>0, S<0 c) H<0, S>0 d) H<0, S<0 Miten on reaktion spontaanisuuden laita lämpötilan funktiona tilanteissa a d? Kuvitellaan nyt, että eri tapauksissa olisi kyseessä jonkin molekyylin ei-kovalentti assosiaatio (sitoutuminen) esim. proteiiniin ja että pysyttäisiin lämpötilavälillä, jolla itse proteiinissa ei tapahdu merkittäviä muutoksia, esim. denaturaatiota. Mitä lämpötilakäyttäytyminen tuossa tilanteessa kertoisi sitovista voimista? Luettele, millaiset voimat tai vuorovaikutukset saattaisivat ylipäätään tällaisessa tilanteessa merkittävästi vaikuttaa (esim. ravitaation vaikutus lienee vähäinen). Reaktio on spontaani, jos G<0 ja toisaalta G= H-T S, missä T>0 eli suoraan nähdään, että a- kohdassa reaktio on spontaani, jos lämpötila on tarpeeksi korkea, b-kohdassa se ei ole koskaan spontaani, c-kohdassa se on aina spontaani ja d-kohdassa se on spontaani, jos lämpötila on tarpeeksi alhainen. Lämpötilakäyttäytyminen kertoisi jotakin sitovien vuorovaikutusten luonteesta eli siitä, ovatko ne pääosin entalpian vai entropian ajamia. Kaikkeen sitoutumiseen toki liittyy entropian kannalta haitallinen komponentti, kun sitoutuvan molekyylin vapausasteet vähenevät sen sitoutuessa. Toisaalta keskeisiä kyseeseen tulevia vuorovaikutuksia systeemissä ovat erilaiset sähköiset vuorovaikutukset (sis. van der Waals / dispersiovoimat) kuten ionien väliset, ionien ja dipolien väliset, dipolien väliset, ionien ja indusoitujen dipolien väliset, dipolien ja indusoitujen dipolien väliset ja indusoitujen dipolien väliset vuorovaikutukset, joissa entalpiakomponentti on sitoutumista edistävä komponentti. Lisäksi aivan keskeisiä ovat hydrofobiset vuorovaikutukset, jotka tyypillisesti ovat entropisia.

3 Tehtävä 2: Reaktioista ja Gibbsin vapaaeneriasta 0 9 p. A. Reaktiotasapaino Kyseessä on yksinkertainen reaktio, jossa A B ja toisaalta vastakkaiseen suuntaan B A. Nopeusvakiot reaktioille ovat k 1 ja k -1 (oheinen kuva). Millainen lauseke tulee tasapainovakiolle K nopeusvakioiden ja toisaalta tasapainossa saavutettujen pitoisuuksien perusteella annettuna? Tasapainossa erisuuntaisten osareaktioiden nopeudet ovat yhtä suuret. Siis v 1 =k 1 [A]=v -1 =k -1 [B], joten K=[B]/[A]=k 1 /k -1. Samaan tulokseen voi päätyä myös vaatimalla, että esim. A:n pitoisuuden muutos ajan funktiona on nolla eli d[a]/dt=k -1 [B]-k 1 [A]=0. Täytyy huomata, että K:n lauseke K=[B]/[A] pätee vain ja ainoastaan silloin, kun kyseessä ovat tasapainotilan pitoisuudet. B. Gibbsin vapaaeneria A-kohdan mallin mukaiseen reaktioon liittyväksi Gibbsin vapaaenerian muutokseksi annetaan Lehninerissä G= G 0 # +RTln([B]/[A]), missä G on vapaaenerian muutos reaktiolle tämänhetkisillä A:n ja B:n pitoisuuksilla ja tämänhetkisissä oloissa, G 0 # on standardivapaaenerian muutos, R on yleinen kaasuvakio, T on lämpötila absoluuttisella asteikolla ja [B] ja [A] ovat tietenkin reaktanttien konsentraatiot. Jos G 0 # =-10 kj/mol ja T=27 C, niin mikä on reaktion tasapainovakio? Mitä voit sanoa erisuuntaisten osareaktioiden suhteellisista nopeuksista alussa, jos sekä A:ta että B:tä on alussa sama pitoisuus? Tasapainossa G=0, joten G # 0 =-RTln([B] eq /[A] eq ), joten edelleen - G # 0 /RT=ln K. Näin saadaan K = e # G0 RT = e 10000J / mol 8,31J /( mol* K )*300K e 4 55 Tästä nähdään, että standardivapaaenerian muutos on tasapainovakiota vastaava vapaaeneria. Siis K 55. Toisaalta K=k 1 /k -1, joten k 1 =55k -1. Osareaktioiden nopeudet v 1 =k 1 [A] ja v -1 =k -1 [B], siis kun [A]=[B], on v 1 55-kertainen v -1 :een verrattuna. C. ATP:n eneria Miten ATP:sta reaktiossa ATP+H 2 O ADP+P i enimmillään saatava vapaaeneria riippuu ATP:n, ADP:n ja P i :n pitoisuuksista? Tapahtukoon reaktiomme koeputkessa, joten veden pitoisuudesta voi tehdä karkean oletuksen, että se on likimain sama kuin vedessä (mikä tosin ei päde solun sisällä). G '=-30,5 kj/mol ko. reaktiolle ja adenosiinifosfaattien yhteiskonsentraatio [ATP]+[ADP] on vakio = 5 mm ja [P i ]=[ADP]. o [ ADP ][ Pi G = G '+ RT ln ] [ ATP]. [H 2 O] on sisällytetty standardivapaaenerian arvoon, mutta sitä ei ole edellytetty tiedettäväksi. Tässä siis [ADP]=[P i ]=(0.005 M-[ATP]). Saadaan oheiset kuvaajat vapaaenerian muutokselle 2 o (5mM [ ATP] ) G = G ' + RT ln. ATP [ ]

4 ADP:n pitoisuuden suhteen saadaan luonnollisesti käänteinen kuvaaja, sillä kuvassa 5 mm-[atp]=[adp]. Tehtävä 3: Vedestä ja osmoosista 0 9 p. A. Osmoosista ja soluväliaineesta Nivelruston soluväliaineessa on nivelruston solujen tuottamia proteolykaaneja, neatiivisesti varautuneita kondroitiini- ja keratiinisulfaatteja, joiden voidaan katsoa olevan kiinni ympäristössään. Varauksien neutraloimiseksi nivelrusto sisältää runsaasti myös Na + -ioneja. Enimmäkseen näiden aiheuttama osmoottinen paine puolestaan imee vettä nivelrustoon kunnes tasapaino on saavutettu, mikä aiheuttaa nivelruston turpoamisen. a) Mitä tapahtuu jalan nivelten nivelrustoissa, kun makuulla ollut henkilö nousee seisomaan ja kohdistaa painonsa nivelrustojen varaan? Mikä paineita koskeva ehto siis toteutuu uudessa tasapainotilassa? (Nivelväliaineen makromolekyylien välinen repulsio ei ole vielä pystyssäkään merkittävä.) Nivelen rakenteista tarvitset ainoastaan oheisen kaavakuvan. b) Nivelrusto pystyy ajan mittaan jossakin määrin sopeutumaan pitkään jatkuneeseen rasitukseen, esimerkiksi lisääntyneeseen liikunnan harrastamiseen. Mikä mekanismi on tehtävässä annettujen ja omien tietojesi perusteella ilmeinen? c) Millaisista osista proteolykaanit muodostuvat? SELITYS:

5 a) Henkilön massa lepää paljolti nivelen varassa, joten niveleen kohdistuva paine on vakaassa tilassa enimmillään P m/a, missä A on nivelpinnan pinta-ala. Paineen takia vettä virtaa pois nivelväliaineesta, mutta nivelväliaine ja sen varausten paikallaan pitämät Na + -ionit pysyvät paikallaan painuen vain hieman kasaan veden poistuessa. Osmoottisesti aktiivisten aineiden pitoisuus kasvaa tilavuuden pienentyessä (veden pitoisuus pienenee) ja osmoottinen paine kasvaa. Tasapainotilassa, kun tarpeeksi vettä on puristunut ulos, on nivelväliaineen ja sen varausten puoleensa vetämien Na + -ionien aiheuttama osmoottinen paine yhtä suuri kuin ulkoinen nivelväliainetta kasaan puristava paine. Tehtävässä on hyvä ymmärtää, ettei osmoosiin välttämättä tarvita puoliläpäisevää kalvoa, vaan että jonkinlainen läpäisyeste tilojen välillä riittää. Tässä tapauksessa läpäisyeste muodostuu soluväliaineen kiinnittymisestä alustaan, ne eivät siis voi virrata pois, ja toisaalta soluväliaineen makromolekyylit neatiivisilla varauksillaan estävät Na + -ioneja poistumasta. Ts. puoliläpäisevän kalvon tapauksessa kalvo estää muita kuin liuotinmolekyylejä liikkumasta tilasta toiseen, tässä tapauksessa esteen muodostaa se, että muut molekyylit ovat joko kovalentisti tai muuten kiinni toisessa tilassa tai edellisten varauksien elektrostaattisesti tähän tilaan pidättämiä. Tämä on perusoppikirjatason selitys, joskin uudemmat tutkimukset korostavat kollaeenin ja muidne osien keskeistä merkitystä myös tässä tarkoituksessa, mutta siitä ei tehtävänannon mukaan tarvinnut huolehtia. (Näin pitkää sepustusta ei todellakaan ole vastaukseen edellytetty, siksi nämä olenkin nimennyt selityksiksi enkä vastauksiksi.) b) Syntetisoidaan lisää nivelväliainetta, jolloin puristuessa osmoottinen paine on suurempi samalla tilavuuden pienentymisellä kuin aikaisemmin. c) Proteolykaanit muodostuvat hiilihydraattiosista ja proteiiniosista. Sokeriosat ovat polysakkarideina kiinni proteiinirunossa. Sokeriosissa on useissa tapauksissa lukuisia neatiivisia varauksia. Hiilihydraattia on jopa 95 % massasta. Tämän monimutkaisempaa selitystä ei tässä vaiheessa välttämättä kaivattu, mutta olisi jokaisen hyvä vilkaista oppikirjasta, millaisia monimutkaisia supramolekulaarisia kokonaisuuksia soluväliaineen molekyylit muodostavat. B. Vesi ja biomolekyylit a) Hemolobiinilla on kaksi konformaatiota, joista toinen (R) sitoo happea hyvin ja toinen (T) huonosti. Happea hyvin sitovalla R- eli relaxed-muodolla on suurempi pinta-ala kuin T- eli tensemuodolla. R-muodon pinnalle on näin ollen ymmärrettävästi sitoutunut enemmän vettä kuin T-muodon pinnalle. Veden aktiivisuutta (jota voit pitää vapaan veden vaikuttavana tai tehollisena konsentraationa) voidaan alentaa lisäämällä liuokseen vettä sitovaa, melko inerttiä polyetyleenilykolia. Mihin suuntaan ja miksi muuttuu hemolobiiniin sitoutuneen hapen määrä, jos hemolobiiniliuoksen polyetyleenilykolipitoisuutta lisätään? Selitys: Kun polyetyleenilykoli lisää osmoottista painetta liuoksessa pääsemättä hemolobiinissa tiloihin, joihin vesi pääsee, niin Le Chatelier'n periaatteen mukaisesti systeemi vastaa muutokseen muuttamalla sitoutumisreaktion tasapainoa siihen suuntaan, jossa veden aktiivisuus kasvaa eli jossa vettä vapautuu hemolobiinista. Täten tapahtuu muutosta suuntaan R T, jolloin vapautuu vettä ja samalla happi sitoutuu huonommin. (Kommenttina mainittakoon, että kysymykseen liittyvät muutokset kartoittava kokeellinen työ julkaistiin 1990-luvulla Science-lehdessä.) Kyseessä on siis tavallaan reaktio R n(h 2 O) T + n H 2 O eli reaktio on karkeasti muotoa (unohtaen kertoimet, todellisuudessa muistaakseni n 32) A B + C, missä siis veden eli C:n konsentraatiota pienennetään. Näin ollen reaktion tasapaino siirtyy oikealla eli konformaation T suuntaan. T puolestaan sitoo happea (O 2 ) heikommin kuin R-muoto, joten happea vapautuu hemolobiinista. Asian voi ajatella myös vapaaenerian kannalta tehtävässä 2 esiintyneen yhtälön ( G= G 0 # +RTln([C][B]/[A])) avulla. Siitäkin näkee, että jos muuttaa tasapainotilasta ( G=0)

6 tuotteiden määrää pienemmäksi (=>loaritmin arvo pienenee), niin vapaaeneria muuttuu neatiiviseksi eli reaktio tapahtuu spontaanisti tuotteiden suuntaan. b) Amfifiiliset lipidit voivat muodostaa vesiliuoksessa erilaisia rakenteita, esimerkiksi kaksoiskalvoja tai misellejä. Jos lipidimolekyylimme on muodoltaan sellainen, että molekyylit puhtaassa vesiliuoksessa muodostavat vielä juuri ja juuri (lieriömäisen) misellin eivätkä kaksoiskalvoa, niin mitä olisi syytä olettaa kenties muodostuvan ja miksi, jos laitammekin lipidimme väkevään polyteleenilykoliliuokseen (katso a-kohtaa). SELITYS: Tärkeä vaikuttava tekijä sen suhteen, millaisia rakenteita lipidimolekyyleistä muodostuu, on niiden muoto. (Usein käytetty muotoa kuvaava ns. surface packin parameter p, p=v/(a l), missä V = molekyylin tilavuus, a = vaikuttava polaarisen pääryhmän pinta-ala ja l = molekyylin hydrofobisen osan pituus. Ks. oheista kuvaa, joka on peräisin Ian Hamleyn kirjasta Introduction to Soft Matter.) Osana polaarista pääryhmää ovat myös siihen sitoutuneet vesimolekyylit eli sen hydraatiovaippa. Kun veden aktiivisuutta laskemalla riistetään molekyylejä hydraatiovaipasta, niin pääryhmän tehollinen pinta-ala pienenee ja näin ollen molekyylin hydrofobisen osan tilavuus kasvaa suhteessa pääryhmän sille varaamaan alaan. Tällöin aluksi misellissä V:n muotoisena esiintynyt molekyyli alkaa suosia rakenteita, joissa ketjuille jää suurempi tilavuus eli kaksoiskalvorakenteita eli muutos tapahtuu misellistä kaksoiskalvoksi. Kurssityömonisteessa puhutaan lisää aiheen tiimoilta. c) Miten selittyy se, että pieni Na + -ioni ei pääse läpi kanavaproteiinista, josta suurempi K + -ioni pääsee läpi? SELITYS: Pieni Na + -ioni sitoo hydraatiovaippansa vesimolekyylit voimakkaammin (sillä on suurempi varaustiheys) ja näin ollen niiden irrottamiseen tarvitaan eneriaa enemmän kuin K + -ionin hydraatiovaipan vesimolekyylien irrottamiseen. Vuorovaikutukset kanavaproteiinin polaaristen ryhmien kanssa riittävät irrottamaan vesimolekyylit K + -ionista, mutteivät Na + -ionista. Hydraatiovaippansa menetettyään K + -ioni mahtuu kanavasta, josta kumpikaan ioneista ei mahdu hydraatiovaippansa kanssa. C. Veden anomaalinen käyttäytyminen Vedellä on tunnetusti anomaalista käyttäytymistä, esimerkiksi normaalipaineessa tiheyden maksimi lämpötilassa 4 C. Veden käyttäytyminen poikkeaa muutenkin yksinkertaisesta ideaalinesteestä. Tee jollakin hakukoneella haku veden anomaalisesta käyttäytymisestä ja luettele ainakin osa mielestäsi mielenkiintoisista anomalioista. SELITYS: Tämän jokainen voi tehdä Goolella itse. Esim. hakusanoilla water ja anomalies. Sieltä löytyy mm. sivu joka sisältää luettelon ja selitysehdotuksia. Tämän tehtävän tarkoituksena oli lähinnä havainnollistaa sitä, miten huonosti loppujen lopuksi pienen, kolmiatomisen molekyylin käyttäytymistä ymmärretään ja miten monimutkaista ja hämmentävää se voi olla. Niinpä jatkossa bioloisten makromolekyylien käyttäytymiseen liittyvät epävarmuudet eivät päässe enää yllättämään.

7 Tehtävä 4: DNA:sta 0 9 p. Coxin ja Nelsonin teoksen Lehniner Principles of Biochemistry luvuista 10, 24, 25 ja 29 pitäisi olla apua tehtävien ratkaisussa, mikäli se ei kylmiltään suju. A. DNA:n replikaatio Oheinen huonosti piirretty kuva esittää tyypillistä eukaryootin replikaatiokuplaa auki levitettynä. a) Merkitse kuvaan replikaation alkamiskohta. Merkitty a. (Alemmassa kuvassa.) b) Merkitse kuvaan kaikki leadin strand ja lain strand -juosteet. Merkitty (lain strand on Okazakin framentteina syntetisoitava, koska DNA on pakko syntetisoida aina samaan suuntaan (katso c-kohdasta)). c) Merkitse nuolilla replikaation suunta. Merkitty alempana olevaan kuvaan nuolilla. DNA:n synteesiin tarvitaan vapaa 3 -OH pää (eli runon deoksiriboosisokerin kolmannessa hiilessä oleva hydroksyyliryhmä), jonka kanssa nukleosiditrifosfaatti voi reaoida siten, että muodostuu esterisidos nukleosidisimonofosfaatin ja 3 -OH ryhmän välille ja samalla vapautuu difosfaatti, joka pilkkoutuu monofosfaateiksi. d) Merkitse nuolilla replikaatiohaarukan etenemissuunta. Merkitty. Kyseessä on eukaryooteille tyypillinen kaksisuuntainen replikaatiokupla, josta replikaatio lähtee etenemään oriosta molempiin suuntiin. e) Merkitse paikat, joissa tapahtuu DNA-synteesiä. Merkityt punaisilla palloilla. DNA-synteesiä tapahtuu leadin strandien päissä ja uusimpien Okazakin framenttien päissä ellei niitä juuri ole saatu loppuun syntetisoiduksi. (Toisaalta primaasi alkaa toimia vasta sen jälkeen, kun edellisen Okazakin framentin synteesi on valmis.) f) Merkitse Okazakin framenttien synteesijärjestys. Numeroitu 1 4. Ensimmäisenä on syntetisoitu tietenkin lähimpänä orioa eli aloituskohtaa olevat. ) Merkitse kohdat, jossa DNA-liaasi toimii tai tulee toimimaan. Merkitty -kirjaimin. DNA-liaasi on entsyymi, joka sulkee DNA:n aukkoa. Se ei siis lisää nukleotidejä DNA:han, vaan vain sulkee aukon kohdassa, jossa kaksi peräkkäistä nukleotidia ei ole fosfodiesterin toisiinsa liittämiä. h) Merkitse kohdat, jossa primaasi toimii. Merkitty vihreällä kolmiolla. Primaasia tarvitaan lain strandissa jokaisen uuden Okazakin framentin alkuun, leadin strandissa vain replikaation aloituskohdassa eli oriossa.

8 d 4 b) leadin b) lain a 2 1 b) lain b) leadin 3 4 B. DNA:n rakenteesta ja topoloiasta DNA:n topoloian säätely on keskeinen osa solujen toimintaa. Replikaatiossa ja transkriptiossa DNA:n kierteisyyttä täytyy superkierteisyyden aiheuttamia jännitteitä purkaa. Lisäksi on viitteitä siitä, että bakteerit osittain myös edesauttavat transkription aktiivisuutta tekemällä neatiivisesti superkierteisiä jaksoja runsaasti transkriboitavien eenien alueelle. Toisaalta joillakin arkkibakteereilla on ns. käänteisyraaseja, jotka synnyttävät DNA:han positiivista superkierteisyyttä. Tarkoituksena on mahdollisesti suojella DNA:ta denaturoitumiselta. Ohessa T. Devlinin kirjan Biochemistry taulukko: entsyymi tyyppi 1 Lk toiminnot E. colin topoisomeraasi I I +1 relaksoi neatiivisesti superkierteistä DNA:ta hiivan topoisomeraasi I I ±1 relaksoi positiivisesti tai neativiivisesti superkierteistä DNA:ta E. colin topoisomeraasi II (DNA-yraasi) II ±2 synnyttää neatiivista superkierteisyyttä DNA:han; relaksoi sekä positiivisesti että neatiivisesti superkierteistä DNA:ta E. colin topoisomeraasi IV II ±2 relaksoi positiivisesti tai neatiivisesti superkierteistä DNA:ta, ei voi synnyttää superkierteistä DNA:ta hiivan topoisomeraasi II II ±2 relaksoi positiivisesti tai neatiivisesti superkierteistä DNA:ta, ei voi synnyttää superkierteistä DNA:ta E. colin topoisomeraasi III I +1 relaksoi neatiivisesti superkierteistä DNA:ta, selvittelee limittäisten DNA-silmukoiden takertumia (=decatenation activity, catanae=ketjun renkaiden lailla toisiinsa lukittuneet renkaat) hiivan topoisomeraasi III I +1 spesifisenä substraattina heterodupleksien yksijuosteinen DNA 1 tyypin I topoisomeraasit eivät käytä ATP:ia, tyypin II topoisomeraasit käyttävät. a) Mikä olennainen ero yraaseilla on muihin topoisomeraaseihin verrattuna? Mitä hyötyä transkriptiossa voisi olla siitä, jos DNA on neatiivisesti superkierteistä?

9 Gyraasit voivat paitsi poistaa superkierteisyyttä, myös synnyttää sitä. Transkriptiossa DNA:n neatiivisesta superkierteisyydestä voisi olla sellaista etua, että DNA:n kaksoiskierre on helpommin avattavissa, sillä avoimen kuplan tekeminen DNA:han ei heti synnytä positiivista superkierteisyyttä, vaan ainoastaan poistaa neatiivista. b) Miten tavallisen (B-DNA:n) kierteisyyden vähentäminen (underwindin) vaikuttaa Z-DNA:n esiintymistodennäköisyyteen ko. molekyylissä? B- ja Z-DNA:ssa kierteisyys on eri suuntiin (katso oppikirjasta). Näin ollen kun yllä mainittuun molekyyliin syntyy pätkä Z-DNA:ta, niin vastaavasti muualla täytyy B-DNA:n kiertyä tiukemmalle. Jos B-DNA on valmiiksi alikiertynyttä, niin tuo tiukemmalle kiristyminen vain saa sen lähemmäs enereettisesti edullista muotoa eikä suinkaan muodosta estävää eneriakynnystä. Täten B-DNA:n kierteisyyden vähentäminen lisää Z-DNA:n syntymisen todennäköisyyttä. c) Miksi DNA:n kaksoiskierre ylipäätään kiertyy silmukoille, jos sitä kiertää tiukemmalle? Tähän jokin kierteinen johto kuten perinteinen puhelimenjohto on omiaan kokeellista testausta varten. C. PCR Sinulla on koeputkissasi potilaalta otettu DNA-näyte, josta haluat monistaa tiettyä sekvenssiä tutkiaksesi myöhemmin restriktioentsyymien avulla sitä, onko sekvenssissä tietty tuntemasi pistemutaatio. Luonnollisesti sinulla on myös kaksi vertailunäytettä: toinen, jossa DNA:ssa on mutaatio, ja toinen, jossa DNA:ssa ei ole mutaatiota. Ohessa DNA-näytteen oletettu sekvenssi. aactctc caccaaat ccacttc ctctttt ctaatc cacctct ttacata ccatcttc ctttt accatc acctatccc acacaat aaccaaact ttatataact ccctct tttttttttt ccccctcat ttcttca aaaatcataa cttaaat ccatt tattc caccatcca ctca cccacatca cttaat aaactctct aaccttcca tccccaa ctctccac cactatac cttccttat aattcaa atttctaat cact attttcaa aatctac ttaaaaaa ataaaac taaaaa tacaaatcac accatcca tctccaac ccaaaaata cattttctt aattatt acccattt cctcca ttccttac tacacacct cacaccttc caccttt tccctca ctatttttc ctttcct atcctcaat caccc tctcattca acctaaa aaaaaa aacaa aattcta tccacctt acacaca caaaaacta ccaaaat ccatcaa aaacctt atccta ctccaaaca aaaaaat ttaaaa aatacttc taaccta tccttact tcttttccc aaacctt cctccaac catcc acctcatc acact ctcttct tttatctaa acttcaa tatcaacct tctta cccaaa ctccttct ctact cactaat aatatctt aattcat atccct acaacca tctatc cctatcct acaat atttttaa attactcata aaaata taacatca ccttttctc accatctcca actaaa acttacaat actac caactaaa tccttttca tttctctttc tcttctttt tttccctca tcctcctc ccataccccc atcctta ttctcttcct tctctcct tatcatc tcattcctc acttcattc ccttacacct ataaca caacacca tcaccaaa actcacttt tctaactct catttca catcttac aaaattc tatcacca tactt ttctcaatt ctaactcaaa accacaaca tctcttc aattaaca caccactct taaccca attt tacaaata tcaaa ttttta caccaacca tcaaatat cttattaat actttatc accatccat cctcact actaattca cacacacac tcacacca cacacataca cacatcaca cacacatca cacaaacaca tacacacat cacacatact cacacacaca tacacacat cacacacaca cacacatca cacacacaca tcacacaca ccatcaca cacaccctc acccccacac catataaa atataaaat accctaat catccaaaaa catttt atcttt ctttcat cattcacta aaaaaccaa tttttaa aaactat ttttttttt taaccatttc acaataa aaacttc atcttatc tattttc ccacaaca aatccta ctataat ttataaaaa catctttcc ttttcaca ttctac tactcca aatcaat ccaact tcactatta taatca cttttcttt ccaaatt tccactaa caaac cttcctctt aacaaaa ttaat acaaaatat aacctactt cttctacc

10 ctcaattcca cttacaaaa ataccctt taaccaat cacctatcac ctaacacct catctccccc actcata aaatcaca taattttt atcacaaaa ttaaaaca tacacaat aaaacataca caaactaa aatatt attaaatc ctaatctct aataacaac aaccaaa aaactcat aacaaattta acctctttt caattc tttttattc actccaca attcttcc cacaccct attat ataacta tacccc cactaaa caacta taataca ctacttca tcttaatcc actcaaa taatcac tcaaata atccaact tctcttccc ctacaactt tcttcctc aacacacta acttacat aataataat catcat acttaaaat cattaaa ttatc tacaat cattccaaa cct a) Millaiset alukkeet tarvitset sekvenssiäsi varten PCR-monistukseen? Sekvenssi on annettu vakiintuneen käytännön mukaisesti 5 3 -suunnassa eli ensimmäinen emäs on 5 - pään emäs ja viimeinen 3 -pään emäs. Vastinjuosteineen (=alempi rivi) on DNA tietysti muotoa: 5 -aatacttc taaccta tacaat cattccaaa cct ttcatcaa atctacct atcttccca taatttc acc-5 Koska alukkeen päähän täytyy jäädä vapaa 3 -OH -ryhmä monistettavan pätkän suuntaan, täytyy alukkeiden olla juosteen ja vastinjuosteen 5 -päiden sekvenssiä vastaavia eli esim. 5 -aatacttc taaccta-3 ja 5 -ccacttt aataccct-3 PCR-sykli koostuu seuraavista toistettavista lämpötiloista: 95 C 54 C 72 C ( takaisin alkuun) b) Tehdessäsi tavalliseen tapaan PCR:ää, huomaat kuitenkin sellaisen kiusallisen seikan, että jostakin syystä alukkeesi tuntuu sitoutuvan epäspesifisesti muuallekin DNA:han. Kyse ei ole siitä, että DNA:ssa olisi muualla alukkeesi täsmällisiä vastinsekvenssejä, vaan siitä, että aluke sitoutuu sekvensseihin, jotka ovat lähellä sitä. Neuvoksi sinua kehotetaan kohottamaan PCR:n yhden vaiheen lämpötilaa. Mistä vaiheesta on kyse ja miksi lämpötilan nostaminen voisi auttaa? Tiedetään, että lämmittämällä voidaan irrottaa DNA:n juosteet toisistaan. Jos vuorovaikutukset juosteiden välillä ovat heikommat, riittää alempikin lämpötila irrottamaan juosteet. Ts. alukemolekyylille onnistuu pariutuminen korkeammassa lämpötilassa vain jos vuorovaitukset toisen juosteen kanssa ovat voimakkaimmat eli se pystyy muodostamaan parinsa kanssa kaikki mahdolliset vetysidokset eli ts. silloin kun sekvenssit ovat vastinsekvenssit eli kun pariutuminen on spesifistä. Siispä nostamalla pariutumisvaiheen eli annealin-vaiheen lämpötilaa 54 ºC:eesta jonkin verran saadaan epäspefinen pariutuminen vähenemään. c) Miksi synteesivaiheen lämpötila voi olla korkeampi kuin alukkeen sitoutumisvaiheen lämpötila? Hakemalla Goolella esim. hakusanoilla DNA, denaturation ja temperature, löytyy muutamien ensimmäisten dokumenttien joukosta sellaisia, joissa selitetään DNA:n denaturoitumiseen eli ds ss (double strand sinle strand) transitioon vaikuttavia seikkoja, joita ovat juosteen GC-pitoisuus, emäsjärjestys (esim. puriini-pyrimidiin-purini-pyrimidiini-... -jaksot), DNA:n topoloia ja tämän tehtävän kannalta ennen kaikkea DNA-juosteen pituus. Etenkin hyvin lyhyet pätkät irtoavat toisistaan paljon alemmissa lämpötiloissa kuin pitkät. Niinpä synteesin alettua jo annealin-vaiheen aikana on pariutunut juoste jo pitempi kuin pelkkä aluke (=primer) ja lisäksi DNA-polymeraasin sitoutuminenkin osittain toki stabiloi pariutumista, joten lämpötilaa voidaan nostaa ilman juosteiden irtoamista. Sitä taas halutaan nostaa siksi, että tyypillisesti PCR-monistuksessa käytettävän DNA-polymeraasin optimilämpötila on n. 72 C:een tuntumassa. d) Miksi sinun tarvitsee lisätä PCR-putkeesi ainoastaan lämmönkestävää DNA-polymeraasia eikä mitään muita replikaatiossa tarvittavia entsyymejä? Primaasia ei tarvita, koska DNA-alukkeet tarjoavat vapaan 3 ' -OH ryhmän eli RNA-aluketta ei tarvitse syntetisoida. Koska juosteet irrotetaan toisistaan kuumentamalla, ei tarvita tähän ja juosteiden erillään pitämiseen tarvittavia proteiineja kuten helikaaseja, topoisomeraaseja ja SSB-proteiineja (SSB=sinle strand bindin).

11 e) Pilkot tuottamasi DNA-pätkän restriktioentsyymillä ja teet saman käsittelyn myös molemmille kontrolleillesi. Ajat reaktiotuotteistasi aaroosieelielektroforeesin ja saat seuraavanlaisen kaavakuvan mukaisen tuloksen: Mistä on kyse? Onko potilaalla tauti vai ei? Voitko ylipäätään ratkaista sitä näillä tiedoilla? Mistä on kyse, jos potilaalla on tauti, ja mistä on kyse, jos potilaalla ei ole tautia? Kuvasta nähdään, että normaalieenissä ei ole restriktioentsyymin kohdesekvenssiä eli restriktioentsyymi ei pilko sitä. Mutanttieenissä mutaation tuloksena on syntynyt valitun restriktioentsyymin kohdesekvenssi ja restriktioentsyymi katkaisee sen tältä kohtaa saaden aikaan kaksi alkuperäistä palaa pienempää kappaletta. Potilasnäytteessä puolestaan näyttää olevan sekä mutatoitunutta eeniä että tavallista eeniä. Tämä voi selittyä joko sillä, että vain toinen potilaan kyseisen eenin kahdesta kopiosta (isältä tai äidiltä peritty) on mutatoitunut tau että kyseessä on mitokondriaalisen DNA:n heteroplasmia. Potilaan sairastumisesta ei monestakaan syystä voida sanoa mitään. Vaikka kyseessä olisi tavallinen Mendelöivästi periytyvä tauti, jonka penetranssi on täydellinen, niin sairastumisesta ei voitaisi sanoa mitään, koska sairaus voisi olla dominantisti tai resessiivisesti periytyvä. Lisäksi taudin penetranssi (todennäköisyys, että potilaalla on myös tauti, jos potilaalla on tautieeni) saattaa olla epätäydellinen. Epätäydellinen penetranssi aiheutunee vuorovaikutuksesta sekä muiden eenien toiminnan/tuotteiden että ympäristön kanssa.