Bioteknologian perustyökaluja

Transkriptio

1 Bioteknologian perustyökaluja

2 DNAn ja RNAn eristäminen helppoa. Puhdistaminen työlästä (DNA pestään lukuisilla liuottimilla). Myös lähetti-rnat voidaan eristää ja muuntaa virusten käänteiskopioijaentsyymin avulla komplementaariseksi DNAksi (cdna) = ei introneita!

3 Katkaisuentsyymit (restriktioentsyymit) Bakteerien luontainen puolustuskeino. Pilkkovat DNAn halutusta kohdasta. Samalla entsyymillä katkaistut DNAt voidaan liittää helposti yhteen. Liittäjäentsyymit (ligaasit) Liittävät katkaistut juosteet yhteen. Yhdistävät myös eri alkuperää (eri lajeista) olevaa DNAta.

4

5 Polymeraasiketjureaktio (PCR) Tutkimuksia varten DNAta tarvitaan usein paljon PCR on DNAn monistuskone. Hyödynnetään mm. DNAn emäsjärjestyksen selvittämisessä eli sekvensoinnissa ja yksilöiden tunnistuksessa. DNA:n juosteet erkanevat kun lämpötilaa nostetaan mukaan alukkeita (pieniä pätkiä kyseisestä DNAsta), DNApolymeraasi ja nukleotideja. polymeraasi kasaa uudet juosteet alukkeiden välille kun lämpötilaa lasketaan alukkeiden väli on nelinkertaisena. sama toistetaan DNAn pätkää silmin erottuva määrä

6

7 Elektroforeesi Nukleiinihapot DNA ja RNA lievästi negatiivisesti varautuneita = kulkevat sähkökentässä kohti positiivista napaa. Menoa voidaan hidastaa laittamalla liikkumisalustaksi geeli. Mitä pidempi DNAn pätkä, sitä hitaammin se liikkuu.

8

9 Sekvenssointi Sekvenssointi = DNAn emäsjärjestyksen määrittäminen. Perinteinen Sanger-sekvenssointi yhä käytössä: 1. Monistetaan tutkittavaa DNAta PCR:llä. 2. Lisätään mukaan normaalien nukleotidien sekaan rikottuja nukleotideja. Näiden kohdalta DNA-polymeraasi ei kykene jatkamaan juosteen rakentamista. 3. Esim. lisätään rikottuja ja värimerkittyjä adeniininukleotideja saadaan erimittaisia DNA-pätkiä jotka kaikki päättyvät adeniiniin. 4. Ajetaan pätkät elektroforeesissa. 5. Nykyisin automatisoitu: eri väreillä merkityt juosteet kulkevat lasikapillareissa, ja kamera kuvaa niiden järjestyksen.

10 DNA-sirujen käyttö Tutkitaan sairausgeenien aktiivisuutta (geeniekspressiota). 1. Kiinnitetään sirulle (lasinen tai muovinen levy) tunnettuja sairauksiin johtavia geenejä (DNAta). 2. Eristetään tutkittavista soluista l-rnata 3. Muutetaan l-rnat käänteiskopioijaentsyymin avulla cdnaksi (ei introneita). 4. Yritetään saada cdna hybridisoitumaan (pariutumaan) sirulla olevan DNAn kanssa. 5. Jos näin käy, tutkittavissa soluissa olevat sairauteen johtavat geenit toimivat (tuottavat l- RNAta) yksilö on sairas tai sairastumassa.

11 Geenien sijainti kytkentäkartoituksella Meioosin vähennysjaossa kromosomien käsivarret menevät ristiin ja kromosomit vaihtavat palasia = kiasma (ilmiö = tekijäinvaihdunta). Kiasman todennäköisyys on suhteessa geenien väliseen etäisyyteen. Tunnettujen merkkigeenien periytyminen yhdessä tutkittavan geenin kanssa kertoo näiden välisen etäisyyden = saadaan selville geenin sijainti kromosomissa. Kun paikka on saatu selville, voidaan alue sekvenssoida erot sekvenssissä voivat paljastaa esim. sairauteen johtaneen mutaation (vertaa sirppisoluanemia).

12 Ihmisen raitavärjätyt kromosomit

13 Geenien ja emäsparien määrät kromosomeissa

14 Tehtävä 2 Etsi seuraavasta yksijuosteisesta nukleiinihappomolekyylistä kahden katkaisuentsyymin tunnistus- ja katkaisukohdat. Entsyymit ovat EcoRI (g/aattc) ja TaqI (t/cga); niiden tunnistuskohdat on annettu suluissa ja katkaisukohta on merkitty vinoviivalla. 5`gtttacagagcccttaggatcgacagatgttctatatcagaagggacattcaagaatggaaagaattccccggattacgtcctgctg gtgaaaacagctgttactttaattcgatcttatacctctgtgtggaccccctactgcatcaagctaactagcaa -3` Minkä mittaiset dna-pätkät katkaisuentsyymeillä tuotetaan (kirjoita pätkien pituudet ao. koeputkiin geelikuvan viereen)? Piirrä pätkät oikeille kohdilleen oheiseen geelikuvaan.

15 Vastaus tehtävään 2 5 gtttacagagcccttaggatcgacagatgttctatatcagaagggacattcaagaatggaaagaattccccggattacgtcctgctggtgaaaacagctgttactttaattcgatcttatacctctgtgtggaccccctact- gcatcaagctaactagcaa 3 Koeputkien vasemmalle puolelle tulee allekkain: EcoRI TaqI EcoRI& TaqI Vastaavat pätkät piirretään geelikuvaan noin 8 mm pystyviivoina (kts. asteikko geelikuvan yllä) omaa katkaisuentsyymiä (oikean laidan kolme päällekkäistä suorakaidetta) vastaavalle kohdalle riviin. Suorakaiteiden oikealle puolelle merkitään katkaisuentsyymien nimet: Ylimmän EcoRI, keskimmäisen suorakaiteen oikealle puolelle TaqI ja alimman suorakaiteen+pipetti oikealle puolelle EcoRI & TaqI