KROMOGEENISET MALJAT, PERIAATE, TAUSTA Pauliina Kärpänoja Laaduntarkkailupäivät 2007
Yleinen periaate Kromogeenisella maljalla tarkoitetaan elatusainetta, joka sisältää väriyhdisteen (kromogeenin). Kromogeeni on liitetty substraattiin. Bakteeri kasvaessa maljalla se tuottaa entsyymiä, entsyymi-substraattireaktiossa kromogeeni vapautuu ja bakteeripesäke näkyy värillisenä. Substraatin valinnalla ja elatusaineeseen lisättävällä selektiolla (esim. antibiootit) kromogeenisesta maljasta saadaan haluttuun tarkoitukseen soveltuva selektiivinen malja. Bakteeripesäkkeen värillisyys voi perustua myös muihin elatusaineen ominaisuuksiin (esim. ph:n muutos, rikkivedyn tuotto); tämän tyyppiset elatusaineet eivät ole kromogeenisia
Esimerkki: useita kromogeenisia substraatteja sisältävä virtsaviljelymalja
Kromogeenisten maljojen historia Suomessa kliinisen mikrobiologian alalla käyttö on ollut toistaiseksi melko vähäistä, keskeinen syy vähäiseen käyttöön lienee ollut elatusaineiden korkea hinta Ensimmäinen kliininen julkaisu vuodelta 1989 (J Clin Microbiol 27:778-779), virtsan primaariviljelymalja (kromogeeninen substraatti E. colin β glukuronidaasille) 1994 Salmonellan erottaminen Proteuksesta ulostenäytteistä (Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13:257-261) sekä hiivojen tunnistaminen CHROM-agar maljalla (J Clin Microbiol 32:1923-1929) 1990 kromogeeninen versio Uricult alustasta Staphylococcus aureus ja MRSA vuonna 2000 (J Clin Microbiol 38:1587-1591 ja 2378-2380) ESBL 2007 (J Clin Microbiol 45:501-505)
Virtsaviljely 1. Kromogeenista maljaa voidaan käyttää näytteiden primaariviljelyyn ja/tai bakteereiden tunnistukseen Saatavana useilta valmistajilta sekä valmiina maljoina että pulvereina Hyödyt: 1. bakteereiden tunnistaminen ei vaadi erillisiä tunnistustestejä (E. coli, Enterococcus sp.) 2. alustava tunnistus tarkempaa kuin esim. Cled-maljalta 3. sekakasvun määrittäminen helpottuu ( työmäärä vähenee) Haitat: hinta? Labqualityn virtsaviljelykierroksella 2/2006 < 10 % ilmoitti käyttävänsä kromogeenista primaariviljelymaljaa)
Virtsaviljely 2. Esimerkki kromogeenisen virtsaviljelymaljan periaatteesta: Kaksi kromogeenia: 1. X-glukosidi, toteaa β glukosidaasi-aktviisuutta, enterokokit muodostavat sinisiä pesäkkeitä (huom! vain sukutason tunnistus; jos tarvitaan lajitason tunnistus, esim. mahd. VRE, lajimääritys muilla menetelmillä) 2. Red-galaktosidi, toteaa E. colin β-galaktosidaasi-aktiivisuutta, kasvaa vaaleanpunaisena pesäkkeenä (eri valmistajilla erilaisia suosituksia siitä, tuleeko E. colin tunnistusta täydentää esim. indolitestillä) Koliformiset sauvat pilkkovat molempia e.m. substraateista, pesäkkeet violetteja (ei tarkempaa lajitason tunnistusta) Elatusaineessa lisäksi tryptofaania, TDA-aktiivisuus näkyy kehänä pesäkkeen ympärillä (Proteus, Morganella, Providencia, ei tarkempaa tunnistusta)
Candida-viljely Syvissä hiivainfektioissa tärkeää erottaa nopeasti: 1. Candida albicans muista hiivoista (yleensä herkkä sienilääkkeille) 2. Alustavasti ne hiivat, joilla resistenssi yleistä (C. krusei on aina resistentti flukonatsolille, C. glabrata kannoista lähes 50 % resistenttejä flukonatsolille) Kromogeenisilla elatusaineilla alustava lajimääritys saatavissa nopeasti laajakirjoisten ja toksisten sienilääkkeiden käyttö saadaan minimoitua Saatavissa useilta valmistajilta (valmiita maljoja sekä pulvereita)
Esim. kromogeeninen hiivamalja 1. Vihreä pesäke Candida albicans tai Candida dubliniensis (heksosaminidaasi positiivinen) Valkoinen pesäke C. glabrata, C. kefyr, C. parapsilosis tai C. lusitaniae; kokenut käyttäjä voi erottaa nämä pesäkemorfologian ja värin vivahteiden perusteella) 2. Ruskea pesäke C. krusei (alkaalinen fosfataasi positiivinen)
MRSA-viljely Määrällisesti suurin seulontatutkimus mikrobiologian laboratorioissa Ongelmana nykyisillä elatusaineilla: 1. hitaus 2. huono spesifisyys työllistävä tutkimus Saatavilla useilta valmistajilta (valmiita maljoja ja pulvereita)
MRSA-viljely 2. Valmistaja Malja Selektio (tiedot perustuvat julkaisuihin, eivät valmistajien antamiin tietoihin, pitoisuuksia ei ilmoiteta liikesalaisuuteen vedoten) Kromogeeni - entsyymi CHROMagar, Becton Dickinson CHROMagar MRSA Kefoksitiini Liikesalaisuus biomerieux MRSA ID Kefoksitiini biomerieuxin patentti Oxoid Chromogenic MRSA Kefoksitiini Liikesalaisuus - fosfataasi Bio-Rad Laboratories MRSA Select Kefoksitiini Liikesalaisuus
MRSA Select maljan validointi (PHKS) Willey B.M. et. al. Abstrakti O216, ECCMID 2006: BR: Bio-Rad MRSA Select, MOD: Oxoid Modified MSF, BD: Becton_Dickinson CHROMAgar, MSF: Oxoid Mannitol Salt Cefoxitin
Materiaali 28 aiemmin eristettyä MRSA kantaa (PFGE tyyppejä FIN-4,FIN-7, FIN-10, FIN-11, FIN-15, FIN-17, FIN-25, omanlainen, laaduntarkkailunäytteitä, joissa tyyppi tuntematon) 24 herkkää S. aureus kantaa (PHKS veriviljelyt) 5 oksasilliiniresistenttiä S. aureus kantaa, joissa ei meca geeniä (BORSA) (PHKS märkä- virtsa- ja MRSA-seulontanäytteet) 11 oksar S. epidermidis kantaa (PHKS veriviljelyt) 7 oksas S. epidermidis kantaa (PHKS veriviljelyt) 11 muuta koagulaasinegatiivista oksar stafylokokkia (PHKS veriviljelyt) 15 muuta koagulaasinegatiivista oksas stafylokokkia (PHKS veriviljelyt) 9 erilaista ATCC -kantaa (sauvoja, oxa R aureuskontrolli, enterokokkeja
Tulokset 24 h 48 h Pes. väri MRSA-kannat 28/28 - Viininpunainen MSSA 0/24 0/24 - BORSA 0/5 1/5 Valkoinen OxaR S.epid. 11/11 - Valkoinen OxaS S. epid. 0/7 0/7 - OxaR stafylokokit (muut) OxaS stafylokokit (muut) 8/11 8/11 Valkoinen 0/15 0/15 - ATCC43300 (MRSA) 1/1 - Viininpunainen Gramnegatiiviset ATCCkannat 0/6 0/6 ATCC35667, E. faecium 1/1 - Valkoinen 1 vrk Viininpunainen 2 vrk ATCC29212, E. faecalis 1/1 - Valkoinen
MRSA Select maljan kustannukset Kahden viikon MRSA-näytteet (n=276) viljeltiin rikastusviljelyn jälkeen rinnan MSO maljalle + verimaljalle ja MRSA Select maljalle Kirjattiin ylös kaikki suoritetut jakotutkimukset ja laskettiin kummankin menetelmän välittömät kustannukset Päädyttiin menetelmään, jossa käytetään rikastusviljelyä, sen jälkeen MRSASelect malja (vain), luku 1 vrk kuluttua, tässä säästöä jo primaariviljelyssä 0,35 / näyte aiempaan verrattuna (MSO malja + verimalja) Erilaisten jatkotestien määrä (pv, herkkyysmääritys, koagulaasitesti) 96 (MSO) vs. 39 (MRSASelect) Hyödyt: vastaus nopeammin, kustannukset vähenevät, vähemmän työtä MRSASelect maljalta S. aureuksen tunnistus tulee edelleen varmistaa (ei 100 % spesifinen)
ESBL -seulonta J Clin Microbiol 2007, 45:501-505: Evaluation of a new chromogenic agar medium for detection of extended spectrum β lactamase producing Enterobacteriaceae. BioMerieux:n prototyyppi (ESBL-Bx) Tarkoitettu ESBL-seulontaan ja alustavaan tunnistukseen suoraan potilasnäytteistä Selektiivinen antibiootti kefpodoksiimi Tutkimuksessa verrattu itse tehtyyn McConkey-maljaan, jossa keftatsidiimi
Näytteet (n=644): 561 ulostenäytettä, 63 alahengitystienäytettä, 20 sekalaista märkänäytettä 460 sairaalapotilaasta (erilaisilta osastoilta) Alustava bakteerilajin tunnistus kromogeeniselta maljalta pesäkkeen värin perusteella Lopullinen tunnistus VITEK 2:lla ESBL varmistus kaksoiskiekonmenetelmä (CLSI) ESBL-entsyymien luokittelu (TEM, CTX-M, SHV, OXA), AmpC, K1
Kaikki enterobakteerit ESBL-Bx-maljalla tuottivat odotetun värisiä pesäkkeitä (Klebsiella-Citrobacter-Enterobacterryhmä sinivihreä, E. coli punainen, Proteus-Morganellaryhmä ruskea) Herkkyydet (näytekohtaisesti) Bx 97.3 % ja McC 86.5 % (p=0.09, ei merkitsevä); kefpodoksiimi keftatsidiimi? (CTX-M kannat tavallisesti keftatsidiimille herkkiä, enemmän Bx-maljalla) Molemmilla elatusaineilla valtaosa vääristä positiivisista löydöksistä AmpC tuottavia Enterobacter ja Citrobacter lajeja molemmilla maljoilla ESBL-Bx maljalla enemmän K1-penisillinaasia tuottavia K.