Moderni diagnostiikka, nopeampi vastaus Kokemuksia Puijon laboratoriosta. Sairaalamikrobiologi Jaana Pentikäinen

Transkriptio

1 Moderni diagnostiikka, nopeampi vastaus Kokemuksia Puijon laboratoriosta Sairaalamikrobiologi Jaana Pentikäinen

2 ISLAB Liikelaitoskuntayhtymä Neljä aluelaboratoriota, yhteensä 7 sairaalaa Kuopio Iisalmi Varkaus Pieksämäki Joensuu Mikkeli Savonlinna

3

4 Puijon mikrobiologian laboratorio Henkilökunta Apulaisylilääkäri Kaksi erikoislääkäriä Sairaalasolubiologi Sairaalabiologi Sairaalamikrobiologi Erikoistuva sairaalamikrobiologi sivuvirkaisia: Professori/ylilääkäri ja kaksi erikoislääkäriä Laboratoriohoitajia ym. n. 30 Laboratorio auki arkena , viikonloppuisin työaika 7-15, lauantaina 3 hoitajaa, sunnuntaina 2 Samba-Multilab

5 Viljelyt Bakteeri- ja sieniviljely, mykobakteeriviljely elatusaineet tehdään itse, paitsi kromogeeniset virtsamaljat joitain maljoja tehdään vain yhdessä aluelaboratoriossa BacTAlert veriviljelyautomaatti MGIT mykobakteereille Virusviljely Herpes- ja Sytomegalopikaviljely

6 Muut laitteet Vitek MS (Maldi-Tof) Vitek 2 XL (virtsan E.coli herkkyys) GRAM-värjäysautomaatit 2 kpl GeneXpert Vidas (C.difficile toksiini) Avoin ELISA-automaatti Evolis: Mycoplasma-, HSV-, VZV-vasta-aineet Analysaattorit Architect: HIV ja hepatiittitutkimukset Liaison: Borrelia-, Sytomegalo-, Epstein-Barr-vastaaineet

7 Laitteet ym. MagnaPure LC DNA/RNA eristys-automaatti (Roche): HLAB27 DNA-eristys kokoverestä 2 Real-Time PCR-laitetta LightCycler HLAB27 Cobas TaqMan 48 (HCVNh HCVNhO) Prove-It Herpes MicroArray Genotype (Hain), MRSA, VRE, Mykobakteerit Accuprobe

8 Prove-It Herpes

9 Prove-It Herpes Testi otettiin käyttöön 2010 Kvalitatiivinen tube-array testi, jolla voidaan osoittaa HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV, HHV-6 ja HHV-7 Multiplex-PCR, jonka jälkeen monistuneen DNA:n tunnistus hybridisaatiolla putken pohjaan integroidun sirun pinnalla. Sirun kuvaus ja tuloksen tulkinta automaattisesti ISLAB Puijo testivalmistajan kanssa validoimassa testiä CE-IVD-merkintään. Käytetään meillä vain HSV-1, HSV-2 ja VZV:n osoittamiseen likvorista ja silmänäytteistä

10 Prove-It Herpes Korvasi in-house HSV ja VZV PCR-testit Testin tekoon kuluu suurinpiirtein sama aika kuin vanhassa testissä, mutta testin suoritus yksinkertaisempaa Kaupallisen testin laadun ja toiminnallisuuden ylläpito helpompaa Vuosittain tutkitaan likvoria (tekopäivät ma, ke, pe)

11 GeneXpert

12 GeneXpert 16-paikkainen 4 aktiivista modulia sisältävä laite otettiin käyttöön tammikuussa 2013 Tuberkuloosi Influenssa A + B Clostridium difficile? GBS? MRSA? Noro?

13 Influenssa A+B Aiemmin Influenssa A in-house PCR (2009 alkaen) työläs ylläpidettävä sarjoja tehtiin epidemia-aikana yleensä 2-3 x viikossa, muulloin tarvittaessa. Influenssa A ja B Influenssa A- ja B-virusantigeenin pikatesti viikonloppuna päivystystutkimuksena näytteen laatu kriittinen, epäherkkä RVirAg (Respiratoriset virukset, antigeenin osoitus; näytteen suora värjäys fluoresoivilla vasta-aineilla) näytteen laatu kriittinen

14 GeneXpert/Influenssa A+B Tammikuu 2013 Influenssa A in-house PCR testi tekeminen lopetettiin ja siirryttiin GeneXpert testiin Marraskuu 2013 GeneXpert Influenssatestiä aloitettiin tekemään myös viikonloppuisin (mikrobiologia) Joulukuu 2013 Influenssa A- ja B virusantigeenin pikatestin käyttö lopetettiin ISLAB:ssa RVirAg edelleen käytössä

15 GeneXpert/Tuberkuloosi Aikaisemmin TbNhO lähetettiin HUSLAB:iin Otettiin käyttöön helmikuussa 2013 Nykyisin tehdään kun pyydetään ja kaikista uusista tbvärjäyspositiivisista Tehdään kaikista näytelaaduista, yksinkertainen esikäsittely, mutta tehtävä tubilaboratoriossa, ajoaika n. 2 tuntia Sensitiivisyys hyvä, positiivinen jopa värjäysnegatiivisille Vastataan myös alustava rifampisiini-herkkyys Näytteessä on osoitettavissa M. tuberculosis complex -DNA:ta. Kanta on todennäköisesti herkkä rifampisiinille. TbNhO-tutkimusmäärät nousseet Positiivinen kasvu testataan Accuprobe:lla (geenikoetin) onko tbc tai MAIS -complex genotype (Hain): complex:t auki ja atyyppisille nimi, tubille rifa ja INH -pikaherkkyys -> Turkuun herkkyysmääritykseen

16 Maldi-Tof

17 Ennen Maldi-Tof -laitetta Perinteinen biokemiallinen tunnistus Kromogeeniset maljat: virtsamalja, hiivamalja ja stafylokokkimalja API-testit (API 10, API 20E, ID32E, API20NE, RapidSTR ID 32, STAPH ID 32, CoryneAPI, ID32C) RAPID NH, RAPID ANA agglutinaatiot yms. tarvittaessa sekvenointi HUSLAB:ssa

18 Maldi-Tof Asennus 2012 viikolla 50, Käyttökoulutus viikolla 51. Samalla asennettiin Vitek 2 XL Kevättalvella huone (ja laite) alkoi lämmetä Toukokuussa laite siirrettiin viileämpään huoneeseen Iso pamahdus, luukku avautui kesken ajon, n. viikon käyttökatkos, ohjainkortti, esivakuumipumppu? vaihdettiin. vko 42/2013 detektori vaihdettiin (ajettu niin paljon näytteitä). Tällä hetkellä 3 Prep-Stationia (ja kolme Myla-lisenssiä), kahta käytetään, yksi edelleen vähällä käytöllä.

19 Verifiointi Laitteen käyttö aloitettiin nopeasti Verifiointi aloitettiin tyyppikannoilla ja jo sekvenoiduilla kannoilla Verifiointia tehtiin rutiinin ohella, kustakin eteen tulleesta bakteeri- tai hiivalajista tehtiin rinnan 5 x biokemiallinen tunnistus ja Maldi-Tof tunnistus Rutiininomainen verifiointi lopetettiin syyskuussa 2013, jatketaan tiedon keräämistä laaduntarkkailunäytteistä, sekvenointiin lähetetyistä kannoista ym.

20 Verifioinnin tuloksia Paljon uusia nimiä mm. Actinomyces neuii, Actinomyces europaeus, Actinomyces viscosus Carnobacterium maltaromaticum Dermabacter hominis Diezia cinnamea Helcococcus kunzii Pasteurella canis Raoultella laji Staphylococcus pseudintermedius Streptococcus gallolyticus ssp. pasterianus monet hiivat

21 Verifioinnin tuloksia Ei onnistunut? Capnocytophaga canimorsus puuttuu kirjastosta Citrobacter-lajit (Vain braakii ja koseri verifioitu) Raoultella ornitholytica/planticola Laitteen tultua löydetty 4 kpl Salmonella Typhia (1 nimeytynyt massalla, kolme ei = Salmonella spp) Haemophilus haemolyticus = H.influenzae? Osa Corynebakteereista Helicobacter pylori (vain tyyppikanta) Useat anaerobit (ilman sekvenointia tunnistus vaikeata) Prevotellat, harvinaisemmat Bacteroides lajit

22 Prevotellojen verifointia.. Prevotella buccae 99.9 ANIDENT P.disiens >99.9 Prevotella buccae 99.9 ANIDENT C.gracilis/corporis 99.9/93 Prevotella buccae 99.9 ANIDENT P.buccae >99.9 Prevotella denticola 99.9 ANIDENT B.stercoris 99.1 Prevotella denticola 99.9 ANIDENT Prevotella corporis 93.0 Prevotella disiens 99.9 ANIDENT P.disiens >99.9 Prevotella disiens 99.9 ANIDENT P.bivia Prevotella intermedia 99.9 ANIDENT P.corporis Prevotella melaninogenica 99.9 ANIDENT P.corporis Prevotella melaninogenica 99.9 ANIDENT Pr.bivia Prevotella melaninogenica 99.9 ANIDENT P.melaninogenica Prevotella melaninogenica 99.9 ANIDENT P.melaninogenica >99.9 Prevotella oris 58.2 ANIDENT B.tectum/Pr.denticola

23 Työn kulku Työpisteessä Samba-löydökseksi laitetaan Maila, jolloin kyseiselle löydökselle saadaan tulostettua viivakoodi 2 näytteen valmisteluasemaa käytössä uloste ja virtsatyöpisteet märkätyöpisteet, veriviljely, sienet Jokainen työpiste tulostaa omat viivakoodilistat ja merkitsee selkeästi maljalle tutkittavan pesäkkeen. Muurahaishapon käyttö anaerobibakteerit kampylobakteerit kuivat ja limaiset pesäkkeet ym. tilannekohtaisesti

24 Uusi työpiste massatyöpiste, pääkäyttäjä tekee levyjä, ajaa kaikki levyt pääkäyttäjä päättää ajojärjestyksen, veriviljely- ja anaerobityöpisteen näytelevyillä etuajo-oikeus ajossa on noin 4-5 levyä/päivä yksi spotti/tutkittava mikrobi punaiset ajetaan heti uudelleen pääkäyttäjä hyväksyy tulokset Mylassa tulokset siirtyvät Sambaan näytteen muistilappuun massan pääkäyttäjä auttaa pintamärkätyöpisteen viljelyssä, lajittelussa yms.

25 Mitä ei yleensä tunnisteta Maldi-Tof:lla Virtsakromomaljan punaiset pesäkkeet = E. coli Beetta-hemolyyttiset streptokokit (agglutinaatio) Pienet beetta-hemolyytiset streptokokit märkänäytteestä = Str. anginosus -ryhmä Märkätyöpisteiden selvät Staph. aureus löydökset (SaSelect häntämalja) Märkätyöpisteiden Pseudomonas aeruginosat, herkkyysmaljalla vihreä ja cled +42 Mykobakteerit Homeet Selvät alueen normaalifloorat

26 Diagnostiikka nopeutuu ja paranee Hinta ei ole este nimeämiselle ulostenäytteet koag.neg. stafylokokit hiivat corynebakteerit Massalla saadut nimet pyritään vastaamaan samana päivänä Sambaan lisätyö, palattava työjonoon, mutta vastaukset ovat tarkemmat Jos nimiä ei ole ehditty katsoa ajopäivänä, hoitaja siirtää viimeistään aamulla massalta tulleet nimet muistilapusta löydöksiksi ja kirjaa tehdyt herkkyydet Sambaan aamun jatkojen kirjaaminen nopeutunut

27 Diagnostiikka nopeutuu ja paranee Usein nimi saadaan ennen herkkyyden tekemistä, ehditään korjata, jos nimi muuttaa herkkyysvalikoimaa Anaerobit inkuboidaan anaerobikaapissa ja luetaan joka päivä. Nimet saadaan usein 1 vrk inkuboinnin jälkeen, jos puhdas runsas kasvu. tehdään aina myös diagnostiset kiekot, vastataan suuntaaantava metronidatsoli ja penisilliiniherkkyys. Komplisoituneet infektiopotilaat, josta otetaan paljon näytteitä ja kaikki kasvu pyritään tunnistamaan, tarkka koag.neg stafylokokkien helpottaa tulosten tulkintaa. esim. vaikeat palovammapotilaat

28 Diagnostiikka nopeutuu ja paranee Jatkojen teko yksinkertaisempaa pääasiassa massa ja herkkyydet, tarvittaessa gram ja häntämalja vähemmän ylläpidettäviä tunnistustestejä omatekoisten tunnistusreagenssien käyttö vähentynyt/loppunut useiden hankalasti tunnistettavien mikrobien tunnistus nyt helppoa, esim. Gardnerella vaginalis, harvinaisemmat enterokokit, streptokokit, Actinomyces lajit yms. Veriviljelyn 4 tunnin inkubaatiolla hyviä tuloksia hälyttänyt pullo viljellään ylimääräiselle verimaljalle hiilidioksidiin, massa tehdään 4 tunnin inkubaation jälkeen maljalta mm. perjantaiaamuna hälyttänyt pullo: Salmonella

29 Mikrobi Kantoja testattu Tunnistus laji- tai (sukutasolle) Escherichia coli Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Staphylococcus epidermidis 28 7(1) Streptococcus dysgal ssp. equisimilis Streptococcus pneumoniae Klebsiella oxytoca 8 8 Enterobacter cloacae/asburiae 7 7 Enterococcus faecium 6 4 Candida albicans 6 1(1) Pseudomonas aeruginosa 5 4(1) Proteus mirabilis 5 5 Staphylococcus ludgunensis 5 3 Streptococcus pyogenes 5 4 Enterococcus faecalis 5 5

30 Haasteita Jos massa ei anna nimeä uusi massa-ajo heti muurahaishapolla tai ajo uusitaan seuraavana päivänä tuoreesta viljelmästä. Biokemialliset menetelmät? Sekvenointi? Anaerobien nimi diagnostisten kiekkojen avulla? Hienosäätö. Tehtävä noin 4 viikon välein, Kestää 3-4 tuntia. Jatkuvan kiireen vuoksi perehdytys ollut haasteellista. Toistaiseksi massaa ei yleensä tehdä viikonloppuna Varamenetelmä on oltava (Kaupalliset biokemialliset testit, VITEK 2 XL)

31 Elatusaineet Maldi-Tof säästö? kesä-marraskuu, litramäärät Malja Verimalja Suklaamalja Anaerobimalja CLED Sabouraud

32 Maldi-Tof säästö? API-testejä ja muita diagnostisia testejä (pikaindoli, katalaasi, sappieskuliini yms.) tarvitaan vähän, säästö? Jatkot virtaviivaistuneet, massa + herkkyys Aikaa säästyy nopeammin luotettavampi/tarkempi vastaus näytteiden tutkimiseen kuluva aika vähentynyt pystytään tutkimaan enemmän näytteitä

33 Mitä seuraavaksi? Dermatofyyttien, mykobakteereiden tunnistus Maldi-Tof menetelmällä? Viljelyautomaatti? Sekvenointimahdollisuus?