ESBL-tuoton varmistaminen kiekkoherkkyysmenetelmällä

Transkriptio

1 Vastuuhenkilö Suvi Nykäsenoja Sivu/sivut 1 / 5 1 Menetelmäviitteet ja poikkeamat CLSI Document M31-A3, Vol. 28, No 8. Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard Third Edition. CLSI ISBN X. CLSI Document M100-S20 Vol 30, No.1. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twentienth Informational Supplement. CLSI ISBN Menetelmän tarkoitus ja soveltamisala Tämä ohje koskee E. coli -, Klebsiella sp.-, ja Proteus mirabilis -kantoja. Jos kyseessä on muu bakteerilaji, sovitaan tapauskohtaisesti tuloksen ilmoittamisesta ja jatkotutkimuksista. 3 Määritelmä(t) Laajakirjoiset β-laktamaasit (ESBL, extended-spectrum β-lactamases) ovat β- laktamaaseja, jotka pystyvät hydrolysoimaan kolmannen polven kefalosporiineja (esim. kefotaksiimi) ja monobaktaameja (atstreonaami) ja joskus myös karbapeneemeja (esim. imipeneemi). Ne pystyvät yleensä hajottamaan myös penisilliinejä sekä ensimmäisen ja toisen polven kefalosporiineja, vaikkakin osalla esim. penisillinaasi-aktiivisuus saattaa olla heikentynyt. Laajakirjoisia β-laktamaaseja esiintyy kaikissa β-laktamaasi-luokissa. Laajakirjoisia β-laktamaaseja koodaavia geenejä esiintyy erityisesti gramnegatiivisissa Enterobacteriaceae -heimon sauvabakteereissa (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae ja Salmonella spp). Niitä on myös muissa gramnegatiivissa sauvabakteereissa. ESBL-geenejä on sekä bakteerien kromosomeissa että plasmideissa. Horisontaalisia, laji- ja sukurajat ylittäviä β-laktamaasi- ja ESBL-geenien siirtymisiä on tapahtunut usein. Tärkeimmät geeniperheet ovat nimeltään TEM, SHV, OXA ja CTX. Eri entsyymit numeroidaan perheittäin, esim. TEM-3. Käytännössä ESBL:lla tarkoitetaan usein vain plasmideissa leviäviä A-luokan laajakirjoisia β-laktamaaseja, jotka pystyvät hajottamaan kolmannen polven kefalosporiineja, mutta ovat herkkiä ns. β-laktamaasi-inhibiittoreille kuten klavulaanihapolle. Luokkaan A kuuluvia β-laktamaaseja ovat mm. TEM-, SHV- ja CTX-M -ryhmien β-laktamaasit.

2 Vastuuhenkilö Suvi Nykäsenoja Sivu/sivut 2 / 5 4 Periaate Menetelmässä tutkitaan bakteerikannan herkkyyttä kolmannen polven kefalosporiineille ilman betalaktamaasi-inhibiittoria (klavulaanihappo) ja inhibiittorin kanssa. ESBL:a tuottavat kannat ovat herkkiä klavulaanihapolle, jolloin niiden kasvu inhiboituu klavulaanihapon läsnä ollessa. 5 Mahdolliset virhelähteet Menetelmä ei sovellu bakteerikannoille, jotka tuottavat ESBL:n lisäksi AmpC:a, TEM- ESBL:a (CMT), OXA-ESBL:a tai karbapenemaasia. ESBL-fenotyyppi voi peittyä myös silloin, jos kanta tuottaa samanaikaisesti klavulaanihapolle resistenttejä betalaktamaaseja. Virhepositiivisen tuloksen voivat antaa ne K. pneumoniae - ja E. coli -kannat, jotka ylituottavat SHV-1-entsyymiä (ei ESBL) ja ilmentävät näin ollen keftatsidiimiresistenssiä Liian tiheä tai harva kasvusto maljalla voi aiheuttaa epäselvän estovyöhykkeen reunan ja johtaa vyöhykkeen laajuuden ali- tai yliarviointiin. Siirroksen tiheys tulee aina tarkastaa McFarland- standardin avulla. Kosteus vaikuttaa antibioottien imeytymiseen kiekoista, minkä takia kiekot tulee ottaa ajoissa lämpenemään. Säilytysastian kuivatusaine tulee regeneroida säännöllisesti. Epäselviä tai vaikeasti tulkittavia estokehiä voi aiheuttaa antibioottikiekon huono kontakti maljapintaan (esim. kiekko tipahtanut annostelijasta tai pinseteistä) tai se, että kiekkoa on siirretty maljalla. Tutkittavan bakteeriviljelmän tai käytettyjen maljojen kontaminoituminen aiheuttaa virheellisiä tuloksia. 6 Työturvallisuus Mikrobiologisessa laboratoriossa työskenneltäessä noudatetaan toimintaohjetta LAB Ympäristöolosuhteet ja testaustilat 1. Tavanomainen laboratorioympäristö 8 Laitteet ja välineet 1. Mikrobiologinen perusvälineistö 2. Lämpökaappi 36,0 ± 1,0 C, 21,0 ± 1,0 C tai 16,0 ± 1,0 C 3. McFarland 0.5 -standardi tai nefelometri 4. Steriilejä pumpulipuikkoja

3 Vastuuhenkilö Suvi Nykäsenoja Sivu/sivut 3 / 5 5. Dreija petrimaljojen pyörittämiseen 6. Työntötulkki tai viivain 7. Kiekkoannostelija 9 Elatusaineet ja reagenssit 9.1 Elatusaineet 1. veriagar % NaCl tai ei-selektiivinen kasvatusliemi (tryptic soy broth, BHI-liemi, Mueller-Hinton -liemi) 3. Mueller-Hinton-II -agar (perusalusta) 9.2 Antibioottikiekot Maljan paksuuden tulee olla sen keskikohdassa n. 4 mm. Maljojen valmistajasta riippuen tällainen malja saadaan, kun 9 cm maljalle valetaan ml agaria. keftatsidiimi 30 µg keftatsidiimi-klavulaanihappo 30/10 µg kefotaksiimi 30 µg kefotaksiimi-klavulaanihappo 30/10 µg 10 Kontrollikannat E. coli ATCC Klebsiella pneumoniae ATCC Suoritus Toimi Evira menetelmäohjeen kohdan 9 mukaisesti. 12 Tulokset 12.1 Tulosten tulkinta Mittaa estovyöhykkeen halkaisija millimetrin tarkkuudella kirkkaan estovyöhykkeen reunasta eli kohdasta, jossa bakteerikasvu heikkenee jyrkästi. Valitse mittauspisteet siten, että ne ovat mahdollisimman kaukana viereisistä kiekoista ja maljan reunasta. Mittaa estokehän reunassa oleva, heikosti havaittava huntumainen kasvu mukaan estovyöhykkeeseen. Tutkittavan kannan tulkitaan olevan ESBL-tuottaja, jos klavulaanihappoa sisältävän kiekon (keftatsidiimi-klavulaanihappo 30/10 µg tai kefotaksiimi-klavulaanihappo 30/10 µg) aiheuttama estovyöhyke on 5 mm suurempi kuin vastaavan kiekon, jossa ei ole klavulaanihappoa (vastaavasti keftatsidiimi 30 µg tai kefotaksiimi 30 µg).

4 Vastuuhenkilö Suvi Nykäsenoja Sivu/sivut 4 / 5 Jos tutkittu kanta on ESBL-tuottaja, ilmoita tuloksena: tutkitun bakteerikannan todettiin tuottavan laajakirjoista ß-laktamaasia (ESBL), jolloin sitä on pidettävä resistenttinä kaikille penisilliineille ja kefalosporiineille Tulosten ilmoittaminen Vastaa testin tulos samassa vastauksessa VetMIC-tuloksen kanssa käyttäen seuraavia koodeja: esblneg: Tutkittu kanta ei tuota laajakirjoista B-laktamaasia (ESBL) esblpos: Kanta tuottaa laajakirjoista B-laktamaasia (ESBL) ELMO-tutkimusvastauksessa kaikkien beetalaktaamien tulokset luokitellaan resistenteiksi, myös amoksisilliini-klavulaanihapon Kontrollikantojen käyttö E. coli ATCC 25922: klavulaanihappoa sisältävällä kiekolla (keftatsidiimiklavulaanihappo 30/10 µg tai kefotaksiimi-klavulaanihappo 30/10 µg) korkeintaan 2 mm suurempi estovyöhyke kuin kiekolla, jossa ei ole klavulaanihappoa (keftatsidiimi 30 µg tai kefotaksiimi 30 µg) Klebsiella pneumoniae ATCC : keftatsidiimi-klavulaanihappo 30/10 µg -kiekon aiheuttama estovyöhyke 5 mm suurempi kuin keftatsidiimi 30 µg -kiekon; kefotaksiimi-klavulaanihappo 30/10 µg -kiekon aiheuttama estovyöhyke 3 mm suurempi kuin kefotaksiimi 30 µg -kiekon 13 Menetelmän validointi Menetelmällä on tutkittu EU:n referenssilaboratorion vertailututkimuskantoja vuodesta 2008 (E. coli ja Salmonella). Menetelmällä on todettu kaikki vertailututkimuksessa mukana olleet ESBL-kannat (yht. 15) eikä yhtään kantaa ole virheellisesti tulkittu positiiviseksi. Yhteenveto sijaitsee serverillä AMBI:n alla ESBL-kansiossa (ESBL_menetelmän toimivuus EU-RL-kannoilla xls). 15 Menetelmän status Kansainvälisen menetelmäkokoelman menetelmä Virallinen menetelmä Sisäinen menetelmä 16 Laadunvarmistusmenetelmät Laboratorioiden väliset vertailututkimukset Menetelmävertailut Vertailukantojen/kontrollikantojen käyttö Siirrostetut näytteet Rinnakkaismääritykset Kontrollikiekot Valvontakortit/vihko

5 Vastuuhenkilö Suvi Nykäsenoja Sivu/sivut 5 / 5 17 Viitteet CLSI Document M31-A3, Vol. 28, No 8. Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard Second Edition. CLSI ISBN X. CLSI Document M100-S20 Vol 30, No.1. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twentienth Informational Supplement. CLSI ISBN Bakteerien lääkeherkkyyden määrittäminen kiekkomenetelmällä. Versio 5.0. FiRestandardi. Suomalainen mikrobilääkeresistenssin tutkimusryhmä Finnish Study Group for Antimicrobial Resistance (FiRe), Jaakkonen, A., Laajakirjoisen β-laktamaasiresistenssiyden kehittyminen ja detektio, kandidaatintyö, Teknillinen korkeakoulu, kemian ja materiaalitieteiden tiedekunta, Kansanterveyslaitos, mikrobiekologian laboratorio, ESBL-taustaa, mus/laajakirjoiset_beetalaktamaasit_esbl/ Vastuuhenkilöt Suvi Nykäsenoja 19 Päivityshistoria Antibioottien nimet suomennettu. Työohje LAB 7048 muutettu menetelmäohjeeksi. Vastuuhenkilö vaihdettu.