Genomi- ilmentymisen säätely

Transkriptio

1 Genomi- ilmentymisen säätely Samuel Myllykangas, FT Biolääke<eteen laitos Helsingin yliopisto Geeni- ilmentyminen Johdanto Säätely Tutkimusmenetelmät Luennon runko 1

2 Johdanto Monisoluisen organismin kaikissa soluissa on sama DNA Johdanto Monisoluisen organismin kaikissa soluissa on sama DNA 2

3 Johdanto Eri solutyypeissä ilmentyvät eri geenit RNA:n ilmentyminen (mikroarray) Proteiinien ilmentyminen (2D gel electrophoresis) Yleiset prosessit (RNA polymeraasi) Erityiset prosessit (Hemoglobiini) 30-60% geeneistä ilmentyy soluissa Geeni- ilmentymisen taso vaihtelee Proteiini- ilmentymisen erot ovat suuria Figure 7-3 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Johdanto Ympäristö vaikutaa geenien ilmentymiseen Sisäises=: - Kasvutekijät - Hormonit - Metabolii<t - Signaaliproteiinit - Kemikaalit Ulkoises=: - Kemikaalit - Lääkkeet - Lämpö<la - Valo 3

4 Johdanto Geeni- ilmentymistä säädellään useilla mekanismeilla Johdanto Monisoluisen organismin kaikissa soluissa on sama DNA Eri solutyypeissä ilmentyvät eri geenit Ympäristö vaikutaa geenien ilmentymiseen Geeni- ilmentymistä säädellään useilla mekanismeilla 4

5 Geeni- ilmentymisen säätely 1. Transkrip=o 2. RNA:n prosessoinnin säätely 3. RNA:n kuljetuksen säätely 4. Translaa<on säätely 5. mrna:n hajotuksen säätely 6. Proteiinin ak<ivisuuden säätely Transkrip=on jälkeinen säätely Geenien säätelyproteiinit sitoutuvat DNA:han DNA heliksi DNA sekvenssi Proteiinirakennetunnistus Sp1: 5 - GGGCGG 3 3 CCGGCC 5 GATA1: 5 TGATAG 3 3 ACTATC P53: 5 GGGCAAGTCT 3 3 CCCGTTCAGA 5 5

6 1/22/13 Transkrip<on säätely Geenien säätelyproteiinit sitoutuvat DNA:han Heliksi- mutka- heliksi Homeodomain Sinkki- sormiproteiinit Heliksi- luuppi- heliksi B- laskos Transkrip<on säätely Geeni- ilmentymistä säädellään kytkimien avulla E. colin tryptofaanikytkin - Tryptofaanin synteesin geenien operoni - Yksi promootori - Säätelyelemen\ OperaaTori - Tryptofaanirepressori 6

7 Geeni- ilmentymistä säädellään kytkimien avulla Geeni- ilmentymistä säädellään kytkimien avulla DNA- luupit lisäävät säätelyproteiinien välistä vuorovaikutusta Bakteereissa säätely toimii yksinkertaisten DNA luuppien välityksellä 7

8 Eukaryoo\nen transkrip<on säätely on monimutkaista DNA sekvenssi - PromooTori - Säätelyalueet - Enhancer- alueet Proteiinit - Yleiset transkrip<otekijät - Ak<vaaTorit - RNA pol II - MediaaTorit Synergia Eukaryoo\nen transkrip<on säätely on monimutkaista Transkrip<on aloitus (enhancers, repressors) Yksilönkehitys (mm. HOX- geenit) Tumareseptorit (estrogeenireseptori) Reagoin< ympäristötekijöihin, esim. solustressi (heat shock faktori) Solusyklin säätely (onkogeenit, kasvaimenestäjägeenit, esim. MYC, p53) 1/3 ihmisen kehityshäiriöistä johtuu transkrip<ofaktoreiden häiriintyneestä toiminnasta 8

9 Eukaryoo\nen transkrip<on säätely on monimutkaista DNA on pakaku histoneihin - Säätelyproteiinit eivät sitoudu DNA:han - Kroma<inia muokataan aukaisemalla pakkaus - Pakkaus palautuu vaihtelevas< transkrip<on jälkeen - RNA pol II avaa histonipakkausta edellä ja sulkee jäljessä Erikoistuneiden solujen muodostuminen vaa<i tarkkaa geeni- ilmentymisen säätelyä Prokaryooteilla useita genee\siä mekanismeja Phase variaa<o Ma<ng Two- protein circuits (lambda phage prophage- >ly<c) 9

10 Erikoistuneiden solujen muodostuminen vaa<i tarkkaa geeni- ilmentymisen säätelyä Feedback loopit Ajallisia muutoksia Erikoistuneiden solujen muodostuminen vaa<i tarkkaa geeni- ilmentymisen säätelyä Proteiinit säätelevät useiden geenien ilmentymistä Yksi proteiini voi aloikaa lihassolun erilaistumisen 10

11 Erikoistuneiden solujen muodostuminen vaa<i tarkkaa geeni- ilmentymisen säätelyä EpigeneeOset merkit muukuvat elämän aikana EpigeneOset muutokset Erilaiset solut Muutostekijät Erikoistuneiden solujen muodostuminen vaa<i tarkkaa geeni- ilmentymisen säätelyä EpigeneeOset mekanismit 11

12 Geenien säätelyproteiinit sitoutuvat DNA:han Geeni- ilmentymistä säädellään kytkimien avulla Eukaryoo\nen transkrip<on säätely on monimutkaista Erikoistuneiden solujen muodostuminen vaa<i tarkkaa geeni- ilmentymisen säätelyä Transkrip<on jälkeinen säätely 12

13 Transkrip<on jälkeinen säätely RNA:n prosessoinnin säätely Ribokytkimet Transkrip<o pysähtyy Transkrip<on jälkeinen säätely RNA:n prosessoinnin säätely Vaihtoehtoinen RNA:n silmukoin< 13

14 Transkrip<on jälkeinen säätely RNA:n prosessoinnin säätely Pilkkominen Vasta- aine- erityksen säätely Membraaniproteiini (pitkä) EriteTy proteiini (lyhyt) CstF alayksikkö Transkrip<on jälkeinen säätely RNA:n prosessoinnin säätely Editoin< Lukuraamin ja sekvenssin muutokset U nukleo<dejä voidaan lisätä mitokondrion RNA:han Emäsmuutokset Adeniinin deaminaa<o - > Inosine Cytosiinin deaminaa<o - > Uracil 14

15 Transkrip<on jälkeinen säätely RNA:n kuljetuksen säätely Transkrip<on jälkeinen säätely Translaa<on säätely UTR säätely Lämpösensori Ribokytkin An=sense RNA 15

16 Transkrip<on jälkeinen säätely RNA:n hajotuksen säätely Transkrip<on jälkeinen säätely RNA:n prosessoin< RNA:n kuljetus Translaa<on säätely RNA:n hajotuksen säätely 16

17 Geeni- ilmentymisen tutkimusmenetelmät RNA- DNA hybridisaa<o PCR Kroma<ini immunopresipitaa<on DNA mikroarray Uuden polven sekvensoin< RNA häirintä (RNAi) RNA- DNA hybridisaa<o Northern blot Hybridisaa=o (A- T/U, C- G) RNA:n tunnistaminen - Leimatuilla DNA- koe\milla - Elektroforeesi - Nucleiinihappojen siirto kalvolle - Visualisoin< 17

18 Polymeraasiketjureak<o (PCR) Exponen=al amplifica=on of targets - Heat- stable DNA polymerase - Specific primers (fwd and rev) - Thermal cycling - dntps Kroma<ini- immunopresipitaa<o DNA:n ja proteiinien vuorovaikutusten tutkiminen - Transkrip<otekijät - > promootori - RNA polymeraasi - > geeni - Histone - > DNA - Perustuu spesifisiin vasta- aineisiin 18

19 DNA- DNA hybridisaa=o DNA mikroarray DNA mikroarray Geeni- ilmentyminen DNA mikroarraykoe Uuden polven sekvensoin< Sanger DNA sekvensoin< Geeli- elektroforeesisekvensoin= Genomic DNA Fragmented DNA Sequencing library Kapillaarisekvensoin= Immobilization Polony array Cycles Next-generation sequencing A C C G T A T G C T G T A A G C Illumina Genome Analyzer sequencing Library immobilization Bridge amplification *T TTTT Dye termina=on sequencing - Single reac<on - Fluorescent dyes - Capillary electrophoresis *T Reversible terminator nucleotides *T *T TTTTTTTTTTTTT TTTT *T TTTTTTTTTTTTT TTTT T TTTTTTTTTTTTT 19

20 Uuden polven sekvensoin< Sekvensoin<kapasitee\ on lisääntynyt massiivisen parallelisoinnin ansiosta Prepara<on Genomic DNA Fragmented DNA Cloning Amplification Capillary electrophoresis Sanger sequencing Sekvensoin=keskus - Robo<ikkaa - 3 M emästä/päivä Uuden polven sekvensoin< Sekvensoin<kapasitee\ on lisääntynyt massiivisen parallelisoinnin ansiosta Prepara<on Genomic DNA Fragmented DNA Cloning Amplification Capillary electrophoresis Sanger sequencing Genomic DNA Fragmented DNA Sequencing library Immobiliza<on Polony array Cycles Next-generation sequencing Laboratorio: M/päivä A C C G T A T G C T G T A A G C 20

21 Uuden polven sekvensoin< Sekvensoin<kapasitee\ on lisääntynyt massiivisen parallelisoinnin ansiosta Light microscopy Single molecule Nonop=c Available In progress R&D phase Gnubio Stratos Genomics Halcyon ZS Gene<cs Bionanomatrix Lightspeed Nanophotonics Biosci Base4Innova<on GenizonBioSci LaserGen GE Global Genovoxx Visigen/Starlight Genapsys Mobius Genomics Raveo Nanopore sequencing Nabsys Oxford Nanopore Electronic Biosciences IBM- Roche Genia NobleGen Uuden polven sekvensoin< Sekvensoin<kapasitee\ on lisääntynyt massiivisen parallelisoinnin ansiosta Menetelmät parantuvat ja kustannukset alenevat Illumina MiSeq Virtauskenno (flow cell) 21

22 Uuden polven sekvensoin< Sekvensoinnin avulla voidaan tutkia geenien ilmentymistä RNA häirintä (RNAi) Mekanismi RNAi = RNA interference, RNA:n hiljentäminen Molekyylit, jotka hiljentävät RNA:n sirna = small interfering RNA Täydellinen pariutuminen kohde mrna- molekyylin kanssa johtaa mrna:n hajoamiseen mirna = microrna Täydellinen tai epätäydellinen pariutuminen kohde mrna:n kanssa johtaa mrna:n hajoamiseen tai proteiinisynteesin estoon Kokeelliset työvälineet laboratoriossa geenien hiljentämiseen sirna = small interfering RNA shrna = small hairpin RNA 22

23 RNA häirintä (RNAi) Geenin hiljentäminen RNAi:n avulla Green and red lines show cell index values for two different sirnas the light blue line shows the control without sirna the dark blue and pink lines show controls with inac<ve sirnas. Geeni- ilmentymisen tutkimusmenetelmät RNA- DNA hybridisaa=on avulla voidaan tunnistaa transkripteja PCR:n avulla pystytään monistamaan ja eristämään <etyjä sekvenssejä genomista Kroma=ini- immunoprosipitaa=o mahdollistaa proteiinien ja DNA:n välisten vuorovaikutusten tutkimuksen DNA mikroarrayn avulla voidaan tutkia kaikkien ihmisen geenien RNA- tason ilmentymistä Uuden polven sekvensoin= on kehitynyt viime vuosina huimas< ja on syrjäytämässä DNA mikroarrayn RNAi mahdollistaa <etyjen geenien hiljentämisen koe- eläimessä 23