Tuberkuloosin diagnostiikka

Transkriptio

1 Tuberkuloosin diagnostiikka 30. Valtakunnalliset Tartuntatautipäivät, Helsinki Jussi Eskola, dosentti (ei sidonnaisuuksia)

2 Tuberkuloosidiagnostiikan kehittyminen 1910-luku: tuberkuliinikoe ja 1930-luvut: diagnostiikan kehittäminen (rtg, värjäys, viljelyt, biokemialliset testit, marsukoe) (1940-luvun lopulla BCG-rokotukset ja ensimmäiset tubilääkkeet) 1970-luvun alussa auramiinivärjäys 1990-luvulla viljelyautomaatit 2000-luvulla IGRA-testit 2000-luvulla geenitekniikat nopeaan toteamiseen, lajinmääritykseen, epidemiologiseen selvitykseen 2010 Xpert MTB/RIF (Cepheid)

3 Tuberkuloosin laboratoriodiagnostiikan kulmakivet Kunnollinen näyte Värjäys nopea ja epäherkkä ( bakt./ml) ysköksen värjäyslöydös tartuttavuuden peruste Viljely hitaahko (>2 vk), herkkyys n. 100 bakt./ml Lajinmääritys Geenimonistustestit pikadiagnostiikkaa nopeita, herkkiä ( bakt./ml) Herkkyysmääritys Genotyypitys ( sormenjälkitutkimus ) spoligo-, MIRU-VNTR-tyypitys, WGS

4 Geenimonistustestit tuberkuloosin diagnostiikassa PCR (Polymerase Chain Reaction) perinteinen tai reaaliaikainen PCR (RT-PCR) pääasiassa TB-bakteerin osoitukseen Cobas TaqMan MTB (Roche), GeneXpert MTB/RIF (Cepheid) SDA (Strand Displacement Amplification) NASBA (Nucleic Acid Sequence-based Amplification) M.tbc, M.avium, M.intracellulare, M.kansasii, M.malmoense TMA (Transcription-mediated Amplification)

5 Geenimonistustestit TB-bakteerin resistenssin osoituksessa RIF- ja INH-resistenssiä koodaavien geenien toteaminen kohdealueiden (rpob-, katg- ja inha-geenit) monistus PCR:llä + hybridisaatio kalvolle kiinnitettyjen leimattujen koettimien kanssa (GenoType MTBDRplus, Hain) RIF-resistenssiä koodaavien geenien toteaminen rpob-geenin monistus PCR:llä + hot spot geenialueen kattavat, eri väreillä leimatut koettimet (GeneXpert MTB/RIF, Cepheid)

6 Genetics of Rifampin Resistance in M. tuberculosis

7 The Xpert MTB/RIF Molecular Beacon Assay A C D rpob gene -3-5 B E 5 Probes bind to wild type Probes do not bind to mutant sequence 1 Probe for SPC (B. globigii) 6 fluorescent dyes detected simultaneously Molecular Beacon Target Hybrid PAGE 7

8 Cartridge Design and Operating Principle Syringe Barrel RT-PCR Tube Rotary Valve Sonicator Dome PAGE 8

9 Bead Format Reagents Retaining balls Sample Preparation bead: Bacillus globigii spores; excipients Enzyme reagent bead: Taq polymerase; dntps; Buffers; Mg 2+ Target-specific reagent bead: primers; rpob specific probes; controls PAGE 9

10 Amplification plot TB positive/rif sensitive PAGE 10 MTB Positive Medium, Rif Resistance NOT DETECTED

11 Amplification plots TB positive/rif resistance PAGE 11 MTB Positive Low, Rif Resistance DETECTED

12 GeneXpert MTB/RIF monikeskustutkimuksissa Yskösnäytteet 1462 potilaasta (Lima, Baku, Kapkaupunki, Durban, Mumbai) o Värjäysnegatiivisissa herkkyys 83-93% o 1 näyte: 72%, 2 näytettä: 85%, 3 näytettä: 90% o Värjäyspositiivisissa herkkyys % o Spesifiteetti % o Rifampisiiniresistenssin osuvuus 99% (209/211) Extrapulmonaariset näytteet 242 viljelyposit. potilaasta (7 keskusta) o Herkkyys %, spesifiteetti >98%

13 TB-nukleiinihappotesti parhaimmillaan 67-vuotias naispotilas; rintasyöpä hoidettu 2002, nyt yskää pari kk yskösnäyte tk:ssa klo 12 TB-värjäys +++, näyte GeneXpert MTB/RIF-testiin, joka posit., kanta rifampisiinille herkkä klo 15 soitto tk:n labraan klo 21 potilas HUSin keuhkoosastolla TB-hoidon aloituksessa

14 WHO GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2017 The only rapid test for diagnosis of TB currently recommended by WHO is the Xpert MTB/RIF assay (Cepheid, USA). It can provide results within 2 hours, and was initially recommended (in 2010) for diagnosis of pulmonary TB in adults. Since 2013, it has also been recommended for use in children and to diagnose specific forms of extrapulmonary TB. The test has much better accuracy than sputum smear microscopy