ELAHEH MORADI ARABINOOSIPROMOOTTORIN TRANSKRIPTIODYNAMIIKKA KOLIBAKTEERISSA. Kandidaatintyö

Transkriptio

1 ELAHEH MORADI ARABINOOSIPROMOOTTORIN TRANSKRIPTIODYNAMIIKKA KOLIBAKTEERISSA Kandidaatintyö Tarkastaja: Lehtori Heikki Huttunen Ohjaajat: Andre S.Ribeiro, Jarno Mäkelä Jätetty tarkastettavaksi

2 ii TIIVISTELMÄ TAMPEREEN TEKNILLINEN YLIOPISTO Tietotekniikan koulutusohjelma Moradi, Elaheh: Arabinoosipromoottorin transkriptiodynamiikka kolibakteerissa Kandidaatintyö, 23 sivua Joulukuu 2011 Pääaine: Signaalinkäsittely Tarkastaja: Lehtori Heikki Huttunen Avainsanat: Geenin ilmentyminen, transkriptio, translaatio, geenisäätelyverkko Bakteerissa geenin ilmentyminen on monivaiheinen prosessi, jossa transkriptio on merkityksellisin vaihe geenin ilmentymisessä ja säätelyssä. Tässä työssä tutkitaan arabinoosipromoottorin transkriptiodynamiikkaa kolibakteerissa. Arabinoosioperoni mahdollistaa kolibakteerille arabinoosisokerin käytön glukoosin ja laktoosin poissaollessa. Työn tavoitteena on tutkia transkriptiodynamiikkaa eri olosuhteissa ja havaita miten eri ympäristötekijät vaikuttavat geeniekspressiotasoon. Tässä työssä käytetään kahta menetelmää tutkiaksemme geeniekspressiota: Arabinoosipromoottorin stokastisella mallilla tutkitaan arabinoosisokerin ja arac-proteiinin vaikutusta geeniekspressiotasoon ja pyritään havainnollistamaan geeniekspressiota RNA-tasolla eli yksittäisen RNA:n hetkellisessä määrässä. Viime aikoina kehittyneellä menetelmällä, joka soveltuu mittaamaan geeniekspressiota in vivo yksittäisissä soluissa, tutkitaan transkription satunnaisuutta solujen välillä. Stokastisen mallinnuksen tuloksista ja geenin ilmentymisen mittauksista in vivo voidaan päätellä, että geeniekspressio on monivaiheinen ja satunnainen prosessi, jota ei voi mallintaa pelkästään yhdellä reaktiolla. Tämä työ myös osoittaa, että geeniekspressio on stokastinen prosessi, johon vaikuttaa useita erilaisia ympäristötekijöitä. Eri olosuhteissa geeniekspressiotason muuttuminen antaa sopeutumismahdollisuuden organismille erilaisiin olosuhteisiin ja estää tuhlaavaista ylituotantoa sillä hetkellä tarpeettomasta proteiinista.

3 iii ALKUSANAT Tämä kandidaatintyö tehtiin Tampereen teknillisessä yliopistossa laskennallisen systeemibiologian tutkimusryhmässä signaalinkäsittelyn laitoksella. Työssä käytetty malli ja kuvat saatiin työn ohjaajalta Jarno Mäkelältä. Haluan kiittää työn ohjaajia Heikki Huttusta, Andre S. Ribeiroa ja Jarno Mäkelää työn ohjaamisesta ja kommentoinnista. Suuri kiitokseni kuuluu Jarno Mäkelälle, joka avusti työn etenemisessä esittämällä rakentavia kommentteja ja ohjaamalla työn kulkua oikeaan suuntaan. 16. joulukuuta 2011 Elaheh Moradi

4 iv SISÄLLYS 1 Johdanto Teoria DNA-sekvenssi, geenit ja promoottorialueet Geenien ilmentyminen bakteerissa L-arabinoosioperonin säätely kolibakteerissa Fluoresenssimikroskopia Materiaalit ja menetelmät Arabinoosipromoottorin malli Stokastisten geeniverkkojen simulaattori Tulosten analysointi Geeniekspression mittaukset in vivo Tulokset Mittaustulokset mallista Mittaustulokset solussa Johtopäätökset Lähteet... 22

5 v TERMIT JA NIIDEN MÄÄRITELMÄT atc anhydrotetrasykliini bp Emäspari DNA Deoksiribonukleiinihappo E. coli Escherichia coli, kuuluu kolibakteereihin GFP Vihreä fluoresoiva proteiini In vivo Elävissä organismissa tehtyä tutkimusta Matlab Lyhenne sanoista matrix laboratory, numeeriseen laskentaan tarkoitettu ohjelmisto mrna Lähetti-RNA. Valmistetaan DNA-sekvenssin perusteella, toimii tuotettavan proteiinin sekvenssin mallina. P Proteiini. Geeniekspression tuote, joka koostuu aminohapoista. Pro Promoottori. DNA-sekvenssin kohta, johon RNAp sitoutuu ennen transkription aloitusta. Rib Ribosomi. Makromolekyyli, joka huolehtii translaatiosta. RBS Ribosomin sitoutumiskohta (engl. riboseme binding site) RNA Ribonukleiinihappo RNAp RNA polymeraasi. RNA-synteesistä huolehtiva makromolekyyli. RP c Suljettu kompleksi (engl. closed complex) RP o Avoin kompleksi (engl. open complex) SGNSim Stokastisten geeniverkkojen simulaattori, joka on kirjoitettu C-kielellä.

6 1 1 JOHDANTO Systeemibiologian yksi tärkeistä tavoitteista on ymmärtää miten geenit ja proteiinit vuorovaikuttavat toistensa kanssa. Tätä varten kerätään tietoja ja mittausdataa monimutkaisista biokemiallisista reaktioista ja yritetään mallintaa biologisia ilmiöitä tietokoneella. Useimmat olemassa olevat mittausmenetelmät soveltuvat ainoastaan populaatiotason mittauksiin [1]. Viime aikoina on kuitenkin kehitetty mittaustapoja, joilla voidaan tutkia reaaliaikaista geeniekspressiota yksittäisissä soluissa yksittäisen RNA-tasolla [2]. Genetiikan yksinkertaisuudesta ja bakteerin kasvuvauhdista johtuen, kolibakteeri kuten Escherichia coli on suosittu malliorganismi genetiikassa ja biotekniikassa [3]. Kasvaakseen E. coli tarvitsee pelkistyneen hiililähteen, jota se käyttää ravintona ja josta se saa tarvitsemaansa energiaa. E. coli käyttää energian ja hiilen lähteenä ensisijaisuuden mukaan järjestyksessä glukoosia, laktoosia, arabinoosia ja ksyloosia. Arabinoosioperoni mahdollistaa E. colille kyseisen sokerin käytön. Arabinoosimetabolian tehtävät jaetaan kahteen osaan, sokerin sisäänkuljettamiseen elinympäristöstä solun sisäpuolelle ja sokerin muuntamiseen sopivaan muotoon käytettäväksi. Tämä työ keskittyy enemmän arabinoosioperonin geeniekspressioihin, jotka osallistuvat arabinoosisokerin muuntamiseen. Tässä työssä analysoidaan arabinoosipromoottorin transkriptiodynamiikkaa E. colissa ja käytetään menetelmää, joka on kehitetty viimeaikoina ja soveltuu mittaamaan geeniekspressiota in vivo yksittäisissä soluissa [2]. Tässä työssä käytetään myös arabinoosipromoottorin stokastista mallia E. coli:ssa nukleotidin tarkkuudella tutkiakseen transkriptiodynamiikkaa eri olosuhteissa. Mallin dynamiikka on ohjattu stokastisella simulointialgoritmilla (SSA, engl. stochastic simulation algorithm) [4] ja simuloidaan stokastisten geeniverkkojen simulaattorilla (SGNSim, engl. stochastic genetic networks simulator) [5]. Luvussa 2 esitellään työn taustatietoja, geenin ilmentymisen mekanismia, arabinoosioperonin säätelyä ja fluoresenssimikroskopiaa. Kappaleessa 2.3 on esitetty myös DNA-silmukka, joka on tärkeä biokemikaalinen säätelymekanismi. Luvussa 3 esitellään materiaalit ja menetelmät, joita käytetään työssä tulosten käsittelyyn. Luvussa 4 esitellään saadut tulokset mallin analysoinnista ja geeniekspression in vivo mittauksista. Luvussa 5 esitetään johtopäätökset ja kehittämisideat.

7 2 2 TEORIA 2.1 DNA-sekvenssi, geenit ja promoottorialueet DNA on nukleiinihappo, joka sisältää kaikkien eliöiden solujen geneettiset tiedot. DNA:n päärooli on varastoida tietoa pitkäaikaisesti. Eliön lisääntyessä geneettiset tiedot välittyvät jälkeläisille. DNA koostuu kahdesta pitkästä komplementaarisesta ketjusta nimeltään juoste, jotka ovat kiertyneet toistensa ympärille. Juosteet muodostuvat nukleotideista. Jokainen nukleotidi koostuu pentoosisokerista, fosforihaposta ja typpiemäksestä. Pentoosisokeri, joka on deoksiriboosi, on liitetty fosforihappoon. Typpiemäs on joko adeniini (A), sytosiini (C), guaniini (G) tai tymiini (T). Kuvassa 2.1 on näytetty DNA:n kemiallinen rakenne. Kuva 2.1: DNA:n kemiallinen rakenne.

8 3 Nukleotidi on toistuva yksikkö DNA:n rakenteessa. Se on sitoutunut toisen nukleotidiin sokerifosfaattisidoksella ja yhdessä ne muodostavat polynukleotidijuosteen. Vastakkaisten juosteiden tyyppiemäkset sitoutuvat toisiinsa vetysidoksilla ja muodostavat DNA-kaksoiskierteen. Emäksistä aina adeniini ja tymiini sekä guaniini ja sytosiini muodostavat parit. AT-parissa on kaksi ja CG-parissa kolme vetysidosta (kuva 2.1). Esimerkiksi jos jossain juosteen kohdassa on typpiemäsjärjestys GTAA, toisessa juosteessa sitä vastaavassa kohdassa järjestys on CATT. Koska DNA-kaksoiskierteen juosteet rakentuvat komplementaarisista nukleotideista, niin juosteiden päät ovat komplementaariset. Molemmissa juosteissa on sekä 5 -pää (engl. 5 end) että 3 -pää (engl. 3 end). 5 -pään uloimman sokerirenkaan viidenteen hiileen kiinnittyy fosforihappo ja 3 - pään uloimman sokerin kolmannessa hiilessä on vapaa OH-ryhmä. Geeni on biologisen informaation yksikkö, joka muodostuu nukleotidien tietyistä sekvenssistä. Geneettiset informaatiot ovat tallennettuna DNA-juosteessa, DNA:n emästen järjestykseen. Siis genetiikan koodi on kieli, jossa sen aakkoset ovat DNA:n emäkset eli A, T, C ja G. Kolme peräkkäistä emästä muodostavat yhden sanan, kodonin. Translaatiossa tulkitaan jokainen kodoni yhdeksi aminohapoksi [6]. Näin kolmesta neljäntyyppisestä emäksestä voidaan muodostaa 4 3 erilaista sekvenssiä, siis 64 erilaista kodonia. Toisaalta on olemassa vain 20 aminohappoa, joten genetiikan koodi on redundantti ja monta kodonia voi vastata samaa aminohappoa. Geeneihin liittyy erilaisia säätelyalueita, joiden avulla geenien toimintaa voidaan säädellä. Tällaisia alueita ovat esimerkiksi promoottorit. Promoottori on DNA-alue, joka on lähellä ja samassa juosteessa sen geenin kanssa, jonka toimintaa promoottori ohjaa. Promoottorin ansiosta RNA-polymeraasi sitoutuu DNA:han ja transkriptio eli lähetti- RNA:n kopioiminen DNA-sekvenssistä alkaa. Promoottorissa on sääteleviä alueita, joihin sitoutuu transkriptiofaktoreita tai sääteleviä proteiineja aktivoimaan tai estämään transkriptioprosessia. Promoottorialueet eroavat laajasti rakenteeltaan. Useimmiten promoottorissa on vain yksi transkription aloituskohta (TSS, engl. transkription start site), mutta joissakin tapauksissa promoottorissa voi olla kaksi lähellä olevaa transkription aloituskohtaa. Tällainen promoottori koostuu kahdesta lähellä olevasta promoottorista ja transkriptoi kahta eri geeniä. Tällaisia promoottoreita kutsutaan kaksisuuntaiseksi promoottoriksi. Kaksisuuntaiset promoottorit ovat järjestetty kolmeen eri luokkaan riippuen siitä mitkä ovat niiden promoottoreiden suunnat. Promoottorien suunnat voivat olla peräkkäiset (sama etenemissuunta transkriptiossa), erilleen menevät (vastakkaiset etenemissuunnat), tai lähenevät (vastakkaiset etenemissuunnat) [7]. Kuvassa 2.2 on esitetty kaksisuuntaisten promoottoreiden luokat. Kuva 2.2: Kaksisuuntaiset promoottorit.

9 4 Peräkkäisesti asetettujen promoottorien tapauksessa molemmat promoottorit ohjaavat RNA polymeraasit (RNAp) samaan suuntaan, eli ne transkriptoivat vain yhden alueen [7]. Esimerkiksi lac-promoottori, joka koostuu kahdesta peräkkäisestä promoottorista, transkriptoi vain lac-geenin. Erillään menevien promoottorien tapauksessa molemmat promoottorit transkriptoivat erilliset geenit [7]. Esimerkiksi arabinoosipromoottori, joka koostuu promoottoreista P C ja P BAD, transkriptoi arac- ja arabad-geenit. Lähenevien promoottorien tapauksessa molemmat promoottorit transkriptoivat erilliset geenit, jotka ovat sijoitettuna samaan DNA-sekvenssiin erillisessä DNA-juosteessa, eli RNA polymeraasit transkriptoivat DNA:n molemmat juosteet [7]. DNA:ssa geenien ja toiminnan säätelevien alueiden lisäksi ovat muita alueita, joiden merkitystä ei ole vielä selvinnyt, ehkä nämä alueet ovat tyhjät informaatioarvoltaan tai niillä on muuta merkitystä. 2.2 Geenien ilmentyminen bakteerissa Geenien ilmentyminen on prosessi, jossa geenissä oleva tietoa käytetään syntetisoimaan toiminnallisen geenin tuote. Geenin tuote on yleensä proteiini. Erilaisten proteiinien tuottamisen ohjeet löytyvät geenien DNA-sekvensseistä. Geenien ilmentymisen prosessin voidaan jakaa kahteen vaiheeseen. Transkriptio, jossa kopioidaan DNA:sta lähetti-rna:ta (mrna, engl. Messenger RNA) RNA polymeraasin avulla ja translaatio, jossa tuotetaan proteiineja ribosomin avulla lähetti- RNA:sta. Lähetti-RNA on sama sekvenssi kuin DNA:n koodi juoste, poikkeuksena on se, että mrna:ssa ei ole tymiiniä (T) ja sitä korvataan urasiililla (U). Transkriptio on välttämätön vaihe geenien ilmentymisessä ja säätelyssä. Perinteisesti transkriptio jaetaan kolmeen vaiheeseen, transkription aloitukseen, transkription etenemiseen ja transkription päättämiseen [8]. RNA polymeraasi on tärkein entsyymi transkriptiossa. Ydin RNAp:lla (funktionaalinen perusrakenne) on monimutkainen rakenne, joka koostuu kahdesta proteiinista ß ja ß ja kahdesta α yksiköstä. Ydin RNAp voi transkriptoida mrna:ta, mutta promoottorin löytämiseen se tarvitsee σ-faktoria. σ-faktori sitoutuu ydin RNAp:iin ja muodostaa holoentsyymi RNAp:n. σ-faktori ohjaa RNAp:a promoottoriin, jotta transkriptio alkaa sopivasta kohdasta. Bakteerissa voi löytyä monenlaisia σ-faktoria, jotka tunnistavat erilaiset DNA-sekvenssit promoottorissa. E.colissa tärkein σ-faktori on σ 70. Se on nimetty molekyylipainon perusteella, joka on 70 kilodaltonia [9]. Promoottorissa on kaksi erityistä sekvenssialuetta, jotka ovat asetettu suurin piirtein 35 ja 10 emäsparia ylävirtana transkription aloituskohdasta. Transkription aloituskohta on nimetty +1 paikaksi. Emäsparit, jotka sijaitsevat geenin puolella, numeroidaan positiivisesti ja emäsparit, jotka sijaitsevat promoottorin puolella numeroidaan negatiivisesti. Siis promoottorin erityiset sekvenssialueet kutsutaan -35 ja -10 alueeksi. σ 70 tunnistaa promoottorit, joissa on TAATAT DNA-sekvenssi -10 alueessa ja TTGACA DNA-sekvenssi -35 alueessa [9].

10 5 Transkription aloittamiseen holoentsyymi RNAp sitoutuu promoottoriin ja peittää noin 75 DNA:n emäsparia -50:sta +25 asti. Sen jälkeen avaa DNA-kaksoiskierteen hajoittamalla kaksoiskierteen väliset vetysidokset. Kun RNAp aloittaa transkriptiota transkription aloituskohdasta, se jatkaa DNA:n kaksoiskierteen avaamista ja muodostaa pienen alueen yksijuonteisesta DNA-sekvenssistä. Yleensä transkription etenemisen aikana noin 17 emäsparia ovat avattuna eli kaksi kierrosta DNA:n kaksoiskierteestä. Kun RNAp on kulkenut DNA:ta pitkin, vetysidokset uudistuvat ja DNA-kaksoiskierre muodostuu. Transkription etenemisen aikana RNAp ei tarvitse enää σ-faktoria, siksi σ -faktori irtoaa RNAp:sta kun pieni pätkä mrna:ta on syntetisoitu. Silloin ydin RNAp jatkaa transkription etenemiseen. Transkription etenemissuunta on aina 5 -päästä 3 -päähän, koska RNAp lisää uuden nukleotidin mrna:han vain vapaan 3 -pään OH-ryhmään. DNA-sekvenssin nukleotidi määrittää mikä on seuraava lisättävä nukleotidi mrna:n vapaan 3 -pään OH-ryhmään. Siksi syntyvä juoste on DNA-malliin komplementaarinen [9]. Transkription eteneminen jatkuu siihen asti, kun RNAp kohtaa terminaattorin tai transkription lopetussignaalin. Sitten RNAp ja uusi mrna irtoavat DNA:sta ja transkriptio loppuu [9]. Kuvassa 2.3 on esitetty transkription vaiheet. Kuva 2.3: Transkriptioprosessi vaiheittain. A: Geeni ja promoottorialue. B: RNAp sitoutuu promoottoriin ja peittää noin 50 nukleotidia (-50:-1). C: RNAp liikkuu transkription aloituskohtaan, tällä hetkellä se on peittänyt noin 75 nukleotidia (-50:25). D: Transkription eteneminen. E: Transkription lopetus. Uuden transkription aloittamiseen ei tarvitse edellisen transkription päättyä kokonaan. Silloin kun promoottori vapautuu toinen RNAp voi sitoutua promoottoriin ja aloittaa uuden transkription. Näin voi olla monta RNA polymeraasia transkriptoimassa samaa geeniä samaan aikaan. Bakteerit ovat tumattomia eliöitä, siksi transkriptio ja translaatio tapahtuvat solulimassa ja ovat dynaamisesti yhdistettyjä prosesseja eli ennen kuin transkriptio loppuu kokonaan, translaatio voi alkaa. Ribosomit voivat sitoutua ribosomin sitoutumiskohtaan (RBS, engl. ribosome binding site) mrna:ssa ja aloittaa translaatiota vaikka RNAp

11 6 olisi vielä transkriptoimassa mrna:ta. Silloin ribosomi lukee mrna:ta ja jokaiselle kodonille lisää oikean aminohapon polypeptidiketjuun. 2.3 L-arabinoosioperonin säätely kolibakteerissa L-arabinoosioperoni muodostuu monesta rakenteellisesta geenistä ja säätelyalueista. Se mahdollistaa arabinoosisokerin käytön E. colissa. Rakenteelliset geenit ovat arae, araf, arag, arah, arac, arab, araa ja arad. Rakenteelliset geenit voidaan jakaa tehtäviensä mukaan. AraE, araf, arag ja arah ovat geenit, jotka tuottavat tarvittavat entsyymit sokerin sisään kuljettamiseen elinympäristöstä solun sisäpuoleen. Geenit arab, araa ja arad koodaavat tarvittavat entsyymit arabinoosisokerin muuntamiseen kolmessa vaiheessa D-ksyloosi-fosfaatiksi. AraI 1, arai 2, arao 1 ja arao 2 ovat säätelyalueita, joiden avulla arac-proteiini säätelee geenien ilmentymistä. AraC-geeni on itsesäätyvä geeni, joka koodaa arac-proteiinia. AraC-proteiini säätelee geenien ilmentymistä sitoutumalla ns. sääntelyalueisiin. Kun ympäristössä on arabinoosisokeria, arac-proteiini aktivoi mrna:n transkriptiota arae-, arafgh- ja arabad-geeneissä. AraC-proteiini vaikuttaa toisella tavalla arabad- geenien transkriptioon arabinoosisokerin poissaollessa ja estää arabad-geenien transkriptiota. AraC-proteiini on homodimeeri molekyyli, jonka monomeerit muodostuvat kahdesta osasta: DNA-sitoutumisosasta ja dimerisaatio-osasta. Dimerisaatio-osa sisältää myös arabinoosi-sitoutumistaskun [10,11]. Tärkein tekijä arac-proteiinissa on N-pääte, joka sisältää 18 aminohappoa. Arabinoosisokerin poissaollessa N-pääte levittää dimerisaatioosaa DNA-sitoutumisosaan. Silloin on sopiva tilanne arac-proteiinille sitoutua säätelyalueisiin arai 1 ja arao 2 ja muodostaa DNA-silmukka näiden välille. Säätelyalueet arai 1 ja arao 2 ovat erillään DNA-sekvenssissä 210 bp:lla, joiden välissä on sijoitettu P C ja P BAD promoottorit. DNA-silmukka estää RNAp:n sitoutuminen arabad- ja arac-geenien promoottoriin, joten transkriptio ei voi alkaa molemmissa geeneissä. Arabinoosisokerin läsnäollessa, N-pääte suosii sitoutumista arabinoosisokerin ympärille, jolloin se ei sitoudu DNA-sitoutumisosaan. Tällaisessa tilanteessa DNA-sitoutumisosat vapautuvat ja voivat sitoutua helposti säätelyalueisiin arai 1 ja arai 2. Säätelyalueet arai 1 ja arai 2 sijaitsevat P BAD promoottorissa ja niiden avulla arabad-geenien toiminta aktivoituu [10,11]. AraC-proteiini käyttää kolme arac-sitoutumiskohtaa DNA:ssa arabad-geenien säätelyyn. Positiivisesti säätelyssä tarvittavat kohdat ovat arai 1 ja arai 2 ja negatiivisesti säätelyssä ovat arai 1, ja arao 2. Kuvassa 2.4 on esitetty miten DNA-silmukka muodostuu kun arabinoosisokeri ei ole läsnä ja sen hajoamisesta arabinoosisokerin lisääntyessä.

12 7 Kuva 2.4: Vasemmalla on DNA-silmukka. AraC-proteiini on sitoutunut säätelyalueisiin arai 1 ja arao 2 ja estää transkription aloitusta promoottorissa P C ja P BAD. Oikealla DNA-silmukka hajoa arabinoosisokerin lisääntyessä, jolloin arac-proteiini sitoutuu säätelyalueisiin arai 1 ja arai 2 ja aktivoi transkription aloitusta P BAD promoottorissa. Toinen arac-proteiini sitoo säätelyalueisiin arao 1 ja arao 2 ja estää transkription aloituksen P C promoottorissa. Kuten edellä on mainittu, arac-geeni on itsesäätyvä geeni. AraC-proteiinin pitoisuuden lisääntyessään ympäristössä, geenin transkription nopeus vähenee ja päinvastoin, proteiinin vähentyminen johtaa transkription nopeuden kasvamiseen. AraCproteiini käyttää kolme arac-sitoutumiskohtaa DNA:ssa itsesäätelyyn [18]. Arabinoosisokerin poissaollessa DNA-silmukka, joka muodostuu säätelyalueiden arai 1 ja arao 2 välillä, estää arac-geenin transkriptiota samalla tavalla kun se estää arabad-geenien transkription. Kun taas arabinoosisokerin läsnäollessa DNA-silmukka hajoaa säätelyalueiden arai 1 ja arao 2 välillä ja tällöin arac-proteiini sitoutuu säätelyalueisiin arao 1 ja arao 2, arac-geenin transkription estämistä varten. Niiden säätelyalueiden välillä sijaitsee P C promoottori ja näin RNAp ei voi sitoutua promoottoriin P C ja transkriptio on estetty arac-geenissä (kuva 2.4). AraC-proteiinin pitoisuuden vähentyminen hajottaa proteiinin sitoutumisyhteydet säätelyalueiden arao 1 ja arao 2 välissä ja transkriptio voi alkaa. 2.1 Fluoresenssimikroskopia Yleisesti valomikroskooppien kuvat muodostuvat absorptiolla ja heijastuksella. Mutta fluoresenssimikroskooppi on valomikroskooppi, joka käyttää fluoresenssi-ilmiöitä havainnollistamaan kohteensa. Fluoresenssimikroskooppi käyttää fluoresoivia molekyyliä paikantamman haluttuja kohteita. Fluoresoivat molekyylit absorboivat valoa ja vapauttavat osan energiasta fluoresenssina. Vihreä fluoresoiva proteiini (GFP, engl. green fluorescent protein) on luonnollisesti kehittynyt fluoresoiva proteiini, joka on ensimmäisenä eristetty meduusasta Aequorea Victoria:sta. GFP koostuu puhdistettuna 238 aminohaposta joka absorboi sinistä valoa ja lähettää vihreää valoa (kuva 3.1.B). GFP:tä käytetään yleisesti tutkimaan tiettyjen geenien toimintaa ja tuotantoa fluoresenssimikroskoopilla [16]. GFP-geeniä saadaan ekspressoitua soluissa sijoittamalla niiden geenit tiettyihin operoneihin. GFP-proteiini yleensä ei vaikuta isäntä-solun kasvuun

13 eikä vuorovaikuta helposti muiden proteiinien kanssa [16]. Se on myös aika vakaa molekyyli ja tämä on sen merkittävin haittapuoli geenien ilmentymisen tutkimuksissa reaaliajassa, koska fluoresenssin määrä ei vähene. 8

14 9 3 MATERIAALIT JA MENETELMÄT 3.1 Arabinoosipromoottorin malli Arabinoosipromoottori on kaksisuuntainen promoottori, joka sisältää promoottorit P C ja P BAD E. colissa. Promoottoreiden P C ja P BAD suunnat ovat erilleen menevät ja transkriptioiden aloituskohtien välissä on 147 nukleotidia. Transkription aloitusvaihe on monivaiheinen prosessi. Transkription aloituksen kinetiikka riippuu sen jokaisen vaiheen kinetiikasta eli transkription aloituksen jakaumassa jokaisella vaiheen kinetiikalla on tärkeä rooli. Alla on esitelty McClure:n transkriptiomalli [7], joka koostuu kolmesta vaiheesta: R + P k b k f RP c RP o RNA (3.1) Ensimmäisessä vaiheessa RNAp sitoutuu promoottoriin ja muodostaa suljetun kompleksin (RP c ), sen jälkeen isomerisoitunut RP c avautuu ja muodostuu avoimen kompleksin RP o, eli DNA-kaksoiskierre avautuu ja sen väliset vetysidokset hajoavat. Viimeisessä vaiheessa promoottori vapautuu ja vasta sen jälkeen transkription eteneminen alkaa. Vakiot k b ja k f ovat vaiheiden reaktionopeudet. Transkription aloituksen mallintamisessa pitää ottaa huomioon joitakin ominaispiirteitä: Ensiksi prosessi on hyvin stokastinen, jonka takia käytetään stokastista simulointialgoritmia. Toiseksi promoottorien rakenteet eroavat paljon toisistaan. Arabinoosipromoottorin stokastisen malli koostuu monesta vaiheesta [8], tärkeimmät reaktiot ja niiden stokastiset reaktionopeudet ja aikaviiveet ovat esitetty taulukossa 3.1. Tässä RNAp tarkoittaa RNA polymeraasia, U n on n:s vapaa nukleotidia. U [start,end], tarkoittaa vapaiden nukleotidien väliä. Kun RNAp sitoo promoottoriin, se peittää noin 50 nukleotidia DNA-mallissa. Arabinoosipromoottorin mallissa kukin RNAp peittää 55 nukleotidia ja tässä O n on peitetty nukleotidi. RNAp, joka on sitoutumassa DNAsekvenssiin, varaa 55 nukleotidia eli vaihteluväliltään [n D, n + D ], missä D = 27. Kun RNAp sitoutuu promoottoriin (3.2), se liukuu DNA:ta pitkin yksi nukleotidi kerrallaan yhteen suuntaan (3.4). Mikäli RNAp on estetty toisella RNAp:lla tai ei pysty löytämään transkription aloituskohtaa (TSS), se irtoaa DNA:sta (3.3). Kun liukuva RNAp löytää transkription aloituskohdan (TSS), suljettu kompleksi muodostuu (3.5), jonka jälkeen DNA-kaksoiskierre avautuu ja muodostaa avoimen kompleksin (3.6). DNA:n kaksoiskierteen avauksen jälkeen transkription eteneminen alkaa (3.7). Mikäli transkription etenemisvaiheen aloitus epäonnistuu, keskeneräinen transkription tuote vapautuu (3.8) ja RNAp liukuu TSS:n kohti ja yrittää uudestaan

15 10 aloittaa transkriptiota. RNAp jatkaa yrittämistä kunnes transkription etenemisvaiheen aloitus onnistuu. Heti kun transkription etenemisvaiheen aloitus onnistuu, RNAp vapauttaa promoottorialueen (3.9) ja toinen RNAp voi käyttää sitä ja aloittaa uutta transkriptiota. Transkription etenemisen aikana RNAp peittää noin nukleotidia. Tässä mallissa on käytetty 25 nukleotidia [14]. RNAp, joka on kopioimassa geenialuetta (3.10), varaa 25 nukleotidia eli vaihteluväliltään [n E, n + E ], missä E = 12. Reaktio 3.11 on viimeinen transkription etenemisaskel, eli transkription loppuminen. Tähän reaktioon on lisätty aikaviivettä RNAp:n ja mrna;n vapauttamiseen. Aikaviiveen laskemiseen on käytetty Gamma jakaumaa. Taulukko 3.1: Reaktiot arabinoosipromoottorin mallissa. Parametrit on saatu mittauksista E. colissa. TAPAHTUMA REAKTIO REAKTIONOPEUS JA AIKAVIIVE Sitoutuminen (3.2) k b RNAp + U [n D,n+ D ] O n k b = Irtoaminen (3.3) k f O n RNAp + U [n D,n+ D ] k f = 0.3 Liikkuminen (3.4) k m O n + U n+ D +1 O n+1 + U n D k m = 660 k c = 0.5 RP c :n muodostaminen (3.5) RP o :n muodostaminen (3.6) Transkription etenemisvaiheen aloittaminen (3.7) Epäonnistunut aloitusvaihe (3.8) TSS:n Vapauttaminen (3.9) O TSS+ D RP c RP o E TSS+n k c RP c k o RP o k el E TSS k a RP o k el E TSS+12 + U TSS+ E +12 E TSS+13 + U [TSS+12, TSS+2 D +12] k o =2 k el = 42 k a = k el / 10 k el = 42 Transkription eteneminen (3.10) Transkription Päättäminen (3.11) E n + U n+ E k el E n+1 + U n E k el E nlast RNA(τ el ) + RNAp(τ el ) + U [nlast 2 E,n last] k el =42 k el =42 τ el = Gamma (ex,1/kp_elong) ex= nukleotidien määrä geenissä X-geenistä.

16 11 Repressio- ja repression vapautumisreaktio, jotka käytettiin tässä mallissa, on esitetty taulukossa 3.2. Tässä mallissa arac-proteiini toimii estäjänä ja estää RNA polymeraasin sitomisen promoottoriin ( ). Taulukko 3.2: Repressio- ja repression vapautumisreaktiot arabinoosipromoottorin mallissa. Parametrit on saatu mittauksista E. colissa. rep = 8. * tarkoittaa, että moekyyliä tarvitaan reaktiossa, mutta sitä ei kuluteta. TAPAHTUMA REAKTIO REAKTIONOPEUS JA AIKAVIIVE Repressio ( ) Repression vapautumisreaktio ( ) Arac + U n rep,n+ rep k bind Arac + FreeI 1 I 1 k loop I 1 + O 2 Loop k bind O 2 k bind Arac + U n rep,n+ rep +Arab O 1 Loop + Arab I 1 O 2 O 1 k unbind k unloop I 1 + O 2 FreeI 1 + Arac k unbind Arac + U n rep,n+ rep k unbind Arac + U n rep,n+ rep k bind = k loop = 1260 k unbind = 0.05 k unloop = Stokastisten geeniverkkojen simulaattori Stokastisten geeniverkkojen simulaattori (SGNSim, engl. stochastic genetic networks simulator) on työkalu mallintamaan geenisäätelyverkot (GRN, engl. gene regulatory network), missä transkriptio ja translaatio ovat mallinnettu erillisellä aikaviiveillä (engl. multiple time delayed event) ja sen dynamiikka on ohjattu stokastisella simulointialgoritmilla. SGNSim:ssa on mallinnettu GRN:t käyttäen joukkoa reaktioita [12], jossa on aikaviivettä transkription ja translaation välissä. Todelliset geenisäätelyverkkojen dynamiikka on niin monimutkainen, että aikaviiveen käyttö nimittäin transkription ja translaation välissä on tarpeellista [16]. GRN-mallissa geenit ovat vuorovaikutuksessa aktivointi- ja repressio-reaktioiden kautta, jossa reaktion nopeus on riippuvainen myös pitoisuuksista. SGNSim:n komentorivi saa syötteenä.g tiedoston, jossa on reaktioita ja elementtien määrät alkuvaiheessa eriteltynä. GRN:t mallinnetaan seuraavista reaktioista: RNAp + Pro i k i,bas Pro i (τ i 1 ) + RBS i (τ i 1 ) + RNAp(τ i 2 ) (3.20) Rib + RBS i k i,rbs RBS i (τ i 3 ) + Rib(τ i 4 ) + p i (τ i 4 ) (3.21) RBS i k dr,i (3.22) p i k dp,i (3.23)

17 12 Reaktioissa , τ:n yläindeksit erottavat aikaviivettä tuotteiden välillä, ja alaindeksit erottavat viiveitä eri geenien liittyvien reaktioiden välillä. Esimerkiksi jos yhtälö 3.20:n reaktio tapahtuu i geenille, ajassa t, pro i ja yhden RNAp poistuu systeemistä ja asettuu odotustapahtumalistassa. Ajassa t + τ 1 i, Pro i ja RBS vapautuvat ja ajassa t + τ i RNAp vapautuu ja on käytettävissä toiseen reaktioon. SGNSim:n dynamiikan 2 simuloimiseen on käytetty delayed SSA [15], joka käyttää odotuslistaa varastoimaan tuotteita, jonka tuotantoon on käytetty aikaviivettä. Tässä mallissa geenit ovat kuvattu niiden promoottorilla. Promoottorin DNAsekvenssin sisältää alueen, johon RNAp sitoutuu ja aloittaa transkription, ja operaattorialueen, johon transkription faktorit sitoutuvat ja vaikuttavat geenin ekspressioon. 3.3 Tulosten analysointi Tässä esitellään tulosten analysointia, jotka saatiin mallin eri simuloinneista. Jokaisessa simuloinnissa saadaan yksi aikasarja. Tulosten analysoinnissa tullaan käyttämään Lähetti-RNA:n (mrna) määrä jokaisella ajanhetkellä molemmista geeneistä (arac- ja arabad-geenit). Transkription aloitusten ajanhetket promoottoreissa P BAD ja P C. Ajanhetket, joissa RNAp sitoutuu promoottoriin P BAD ja muodostaa RP c. Ajanhetket, joissa RP o muodostuu promoottorissa P BAD, eli DNAkaksoiskierteen vetysidokset hajaantuvat (reaktio 3.6). Ajanhetket, joissa RNAp vapauttaa promoottorin arabad-geeneissä ja aloittaa mrna:n kopioimisen (reaktio 3.9). Ajanhetket, joissa transkriptio päättyy ja valmis mrna vapautuu (reaktio 3.11). Ensiksi lasketaan arabinoosisokerin vaikutus arac- ja arabad-geenien tuotantotasoon, siksi lasketaan mrna:n keskiarvoa jokaisessa simuloinnissa. Simuloinnin tiedoista saadaan mrna:n määrän jokaisella ajanhetkellä, siis Matlab:n mean-funktiolla saadaan mrna:n keskiarvo koko simuloinnin aikana. Vaihtamalla arabinoosisokerin määrä eri simuloinnissa nähdään sokerin vaikutus molempien geenien tuotantoon. Tämän jälkeen tarkastellaan kohinaa mrna-tasossa. Yleensä kohina voidaan määritellä monella tavalla, mutta tässä käytetään CV 2 -arvoa (engl. square of coefficient of variation) [17] havaitsemaan miten kohinaa muuttuu mrna-tasossa, kun transkription nopeus vaihtuu (kuva 4.1). CV 2 lasketaan ottamalla mrna:n varianssi ja jaetaan se mrna:n keskiarvon neliöllä. Seuraavaksi tarkastellaan transkriptiodynamiikkaa promoottorissa P BAD, ja lasketaan seuraavat aikavälit: RNAp:n sitoutumisen promoottoriin ja RP o :n muodostamisen välillä. RNAp:n sitoutumisen promoottoriin ja promoottorin vapauttamisen välillä. RNAp:n sitoutumisen promoottoriin ja valmis mrna:n vapauttamisen välillä. Sitten lasketaan ajanhetket, joilla ilmiöt tapahtuu. Saadaksemme tarvittavat tiedot käytetään Matlab:n komentoa find(diff()) ja näin saadaan jokaisten tapahtumien ajanhet-

18 13 ket. Saadakseen kyseiset aikavälit vähennetään jokaisen tapahtuman ajanhetket RNAp:n sitoutumisajanhetkistä promoottoriin (kuva 4.2). Viimeisenä transkription aloitusten ajanhetkistä lasketaan peräkkäisten transkriptioaloitusten aikavälit. Niin muodostetaan vektori, jossa on kaikki ajanhetket, missä transkription aloitus on tapahtunut. Sitten otetaan erotukset peräkkäisistä ajanhetkistä Matlab:n diff-funktiolla ja sijoitetaan ne toiseen vektoriin. Näin saadaan vektori, jossa on kaikki aikavälit peräkkäisistä transkriptionaloituksista. Tämä lasketaan molempien promoottoreiden P BAD ja P C jokaiseen simulointiin, tutkiaksemme miten transkriptiodynamiikka muuttuu arabinoosipromoottorissa (kuva 4.3,4.4). Lopulta jokaiselle jakaumalle lasketaan keskiarvo ja CV 2 -arvoa. 3.4 Geeniekspression mittaukset in vivo Tässä osiossa on kuvattu menetelmä, jota käytetään jäljittämään RNA:n molekyylit elävissä soluissa. Tällä menetelmällä voidaan seurata yksittäisiä molekyyleja E. colissa. RNA:n havaitsemisen systeemi muodostuu fuusioproteiinista, joka on yhdistetty fluoresenssi proteiinista (GFP) ja bakteriofaagi MS2 pinnoiteproteiinista. Fuusioproteiinigeeni asetetaan ColE1-plasmidiin ja sitä kontrolloidaan P Lteto promoottorilla. Sitä indusoidaan anhydrotetrasykliinilla. Transkription kohde RNA:ta tuotetaan F-plasmidista, joka sisältää myös punaisen fluoressenssi proteiinin (mrfp1) koodausalueen. Punaisen fluoresenssi proteiini jatkuu 96 MS2 sitoutumiskohdalla ja kontrolloidaan P ara promoottorilla, jota indusoidaan L- arabinoosilla. F-plasmidista on ainoastaan yksi kopio bakteerissa. Mutta ColE1- plasmidista pitää olla vähintään 50 kopiota [19], että saadaan riittävästi MS2-GFP saturoimaan kaikki RNA:ta. Kun kohde-rna transkriptoidaan, fuusioproteiini MS2-GFP sitoutuu RNA:han ja muodostaa kirkkaita fluoresenssipisteitä (Kuva 3.1 B). Kuvassa 3.1 (A) on esitetty käytetyt geneettiset komponentit. Kuvat on otettu fluoresenssimikroskoopilla kahdessa tunnissa, 1 kuva minuutissa, eli jokaisen kokeen jälkeen on olemassa 120 kuvaa analysoitavaksi. Kuvien analysoimiseen on käytetty Matlab-funktioita. Ensimmäiseksi pitää piirtää maskit, erottamaan solut taustasta siten, että kukin maski on käsitelty yksittäisenä soluna. Joissakin kuvissa solut kasvavat ryppäissä, eli niitä ei voida erotella maskilla. Ne jätetään huomioimatta. Kuvassa 3.1 (B) esitetään alkuperäinen kuva ja kuvassa 3.1 (C) esitetään segmentoitu kuva. Analysoinnissa oletetaan kaikki kohde-rna:t saturoituneeksi MS2-GFP fuusioproteiinilla.

19 14 Kuva 3.1: A:RNA:n havaitsemisen systeemin geneettiset komponentit. B:Alkuperäinen kuva. C:Segmentoitu kuva, solut näytetään vihreällä, maskit näytetään sinisellä ja tunnistetut kirkkaat pisteet ovat ympäröity punaisella. Kuvien analysoinnissa on käytetty pisteen tunnistus algoritmia, joka löytää kirkkaat pisteet soluista, maskin alueelta. Näiden perusteella jäljitetään kohde-rna:ta solussa. RNA-molekyylien määrä jokaisessa pisteessä määritellään käyttämällä pisteen intensiteetin jakaumaa [2], joka olettaa, että intensiteetin jakauman ensimmäinen piikki vastaa yksittäistä RNA-molekyylia. Jakauman seuraavat piikit vastaavat monikertaista RNA-molekyylia pisteessä.

20 15 4 TULOKSET 4.1 Mittaustulokset mallista Tutkiaksemme transkriptiodynamiikan riippuvuutta arabinoosisokeriin, simuloidaan arabinoosipromoottorin mallia muuttamalla arabinoosisokerin määrää jokaisessa simuloinnissa. Kuvassa 4.1 (A) on esitetty mrna:n keskiarvon kuvaaja, joka on laskettu arac- ja arabad-geenien transkriptiotuotannoista. Tulokset on saatu seitsemästä simuloinnista siten, että jokaiseen simulointiin lisätään arabinoosisokeria logaritmisesti. Kuvaajista havaitaan selvästi, että arabinoosisokerin lisäys aiheuttaa transkription nopeuden kasvua promoottorissa P BAD. Tämä aiheuttaa puolestaan myös mrna:n keskiarvon kasvua. Toisaalta arabinoosisokerin lisäys aiheuttaa transkriptionopeuden laskua arac-geenissä ja tästä johtuen myös arac-geenin tuottama mrna:n keskiarvo laskee voimakkaasti. Kuva 4.1: A: mrna:n keskiarvon kuvaaja. B :mrna:n CV 2 -arvon kuvaaja.. Transkription nopeuden lasku arac-geenissä arabinoosisokerin lisäämällä johtuu siitä, että arac-proteiinin sitoutumisyhteys säätelyalueiden arao 1 ja arao 2 välissä on voimakkaampi kuin arac-proteiinin sitoutumisyhteys säätelyalueiden arai 1 ja arao 2 välissä, joten arabinoosin läsnäollessa arac-proteiini estää oman geeninsä transkriptiota voimakkaammin (kappale 2.3).

21 16 Kuvassa 4.1 (B) on esitetty mrna:n CV 2 -arvon kuvaaja. Kuvaajan perusteella tarkastellaan kohinaa mrna-tasossa. Kuten nähdään kuvassa transkription nopeuden kasvu arabad-geeneissä aikaansaa kohinan laskua mrna-tasossa ja päinvastoin transkription nopeuden lasku arac-geenissä aikaansaa kohinan kasvua mrna-tasossa. Seuraavasti tarkastellaan transkriptiodynamiikkaa vaiheittain arabad-geenissä. Kuvassa 4.2 on esitetty histogrammi, joka sisältää transkription erivaiheiden erotukset aikasarjana (kappale 3.3). Histogrammi A esittää RNAp:n sitoutumista promoottoriin ja RP o :n muodostamisen aikavälit, histogrammi B esittää RNAp:n sitoutumista promoottoriin ja promoottorin vapauttamisen aikavälit ja histogrammi C esittää RNAp:n sitoutumista promoottoriin ja valmis mrna:n vapauttamisen aikavälit. Kuten kuvasta havaitaan, A histogrammi on jakautunut eksponentiaalisesti, B histogrammi on gammajakautunut ja C histogrammi on normaali-jakautunut. Tästä voidaan päätellä, että histogrammissa A on osallistunut vähemmän reaktioita ja histogrammissa C on osallistunut enemmän reaktioita. Lisäksi kuvasta voidaan havaita selvästi miten varianssit muuttuvat eri tapauksissa. Kuva 4.2: Transkription erivaiheiden aikavälit. A: RNAp:n sitoutumista promoottoriin ja RP o :n muodostamisen aikavälit. B: RNAp:n sitoutumista promoottoriin ja promoottorin vapauttamisen aikavälit. C: RNAp:n sitoutumista promoottoriin ja mrna:n vapauttamisen aikavälit. Seuraavasti tarkastetaan transkription aloituksen dynamiikkaa promoottorissa P BAD ja P C. Tulokset on saatu eri simuloinneista, jotka eroavat arabinoosisokerin määrältään. Kuvassa 4.3 on esitetty peräkkäisten transkriptioiden aloitusten aikajakaumat promoottorissa P BAD. Kuten kappaleessa 2.3 on sanottu, arabinoosisokerin läsnäollessa on tarpeellista arabad-geenien transkription aloitukseen. Silloin kun arabinoosia ei ole mal-

22 17 lissa transkriptio ei tapahdu olleenkaan. Lisäämällä arabinoosia transkriptio alkaa promoottorissa P BAD. Kuva 4.3: Transkription aloituksen aikajakauma P BAD promoottorissa. Niin kuin kuvissa (4.3) havaitaan tulokset täsmäävät hyvin teorian kanssa. Silloin kun arabinoosisokeria on vähän ympäristössä (Arab = 10), transkription aloitukset tapahtuvat harvoin ja niiden aikavälit ovat hyvin pitkiä. Lisäämällä arabinoosia mallissa, arabad-geenien transkription aloitusten aikavälit pienenevät eli transkription aloituksen nopeus kasvaa. Toisaalta kun arabinoosia on lisätty riittävästi, tuotto saturoituu. Eli transkription aloituksen nopeus ei muutu, vaikka lisättäisiin vielä arabinoosia. Sitä voidaan nähdä kuvassa 4.3 alemmat tapaukset, transkriptionopeus on melko sama vaikka arabinoosin määrää muutetaan arvosta 1000 arvoon Lisäksi lasketaan jokaiselle jakaumalle keskiarvoa ja CV 2 -arvoa. Niin kuin nähdään arabinoosin lisäämällä jakauman keskiarvo ja varianssi pienenee voimakkaasti. Kuvassa 4.4 on esitetty peräkkäisten transkription aloitusten aikajakaumat promoottorissa P C. Kuten kappaleen alussa nähtiin arabinoosisokerin lisäyksen vaikutusta aracgeenin tuotantoon, tässäkin havaitaan selvästi arabinoosisokerin negatiivinen vaikutusta promoottorille P C.

23 18 Kuva 4.4: Transkription aloituksen aikajakauma P C -promoottorissa. Ensimmäisessä kuvassa arabinoosi ei ole ympäristössä, joten transkriptio tapahtuu hyvin usein. Lisäämällä arabinoosia transkription aloitusten aikavälit kasvavat eli transkription aloituksen nopeus laskee. Viimeisessä kuvassa nähdään, että arabinoosin ollessa riittävästi mallissa, arac-geenin transkriptio tapahtuu hyvin harvoin. Lisäksi lasketaan jokaiselle jakaumalle keskiarvoa ja CV 2 -arvoa. Niin kuin nähdään arabinoosin lisäämällä jakauman keskiarvo ja varianssi kasvaa voimakkaasti. 4.2 Mittaustulokset solussa Tässä analysoidaan E. coli solujen kuvia, jotka on saatu kahdesta kokeesta. Molemmissa kokeissa arabinoosin määrä on sama (0.1% arabinoosia), siksi tulokset on yhdistetty. Solujen määrä on yhteensä 280 kappaletta molemmissa kokeissa. Tarkastellaksemme transkriptiodynamiikkaa lasketaan transkriptioiden aikavälit kohteena olevasta RNA:sta kaikissa soluissa. Tämän histogrammi on esitetty kuvassa (4.5).

24 19 Kuva 4.5: Kohde RNA:n transkription aikavälijakauma, tulokset ovat yhdistetty kahdesta kokeesta. Jakaumalle on laskettu keskiarvo ja CV 2. Kuvasta havaitaan selvästi, että peräkkäisten transkriptioiden aikavälit ovat gammajakautuneet. Aikavälien välillä ei havaittu korrelaatiota, joka tarkoittaa että prosessi on satunnainen. Gamma-jakaumasta voidaan päätellä että transkriptiota ei voi mallintaa yhdellä reaktiolla, eli se on monivaiheinen prosessi. Jakauman oikealla puolella olevasta hännästä voidaan päätellä myös, että toisin kuin mallissa, todellisuudessa transkriptiota tapahtuu vaikka solu ei ole kunnolla indusoitu. Kuvassa 4.6 on laskettu mrna:n määrää jokaisessa solussa. Lisäksi jakaumalle on laskettu CV 2 ja Fano Factor (varianssi jaettuna keskiarvolla [17]). Fano Factorista voidaan päätellä, että prosessi on hyvin keskittynyt eli varianssi on pienempi kuin keskiarvoa. Satunnaisprosessin Fano Factor on yksi. Kuva 4.6: mrna:n määrän jakauma solussa, tulokset ovat yhdistetty kahdesta kokeesta. Jakaumalle on laskettu keskiarvo, CV 2 ja Fano Factor.

25 Kuten kuvassa (4.6) nähdään, useimmiten mrna:n määrä solussa on nolla, joten transkriptio tapahtuu hyvin harvoin. Kasvattaakseen geeniekspressiotasoa pitää vaihtaa ympäristötekijöitä, jotka kasvattavat transkription nopeutta. Jakauman varianssi on myös pienempi kuin satunnaisprosessilla. 20

26 21 5 JOHTOPÄÄTÖKSET Tässä työssä tarkasteltiin geeniekspression dynamiikkaa yksittäisissä soluissa RNAtasossa kahdella menetelmällä. Ensin käytettiin arabinoosipromoottorin stokastista mallia nukleotidin tarkkuudella, jossa repressio tapahtui säätelyproteiinin ja arabinoosisokerin vaikutuksella. Lisäksi geeniekspression dynamiikan mittaamiseen käytettiin menetelmää, joka soveltuu mittaamaan geeniekspressiota in vivo yksittäisissä soluissa [2]. Työn stokastisen mallin tulosten analysointiosuudessa näytettiin, kuinka arabinoosisokeri vaikuttaa arac- ja arabad- geenien ekspressiotasoon. Mallin simuloinnista saadut tulokset toimivat hyvin odotusten mukaisesti ja antoivat teoriaan sopivia tuloksia. Tuloksista havaitaan selvästi, että arabinoosisokerin lisäys aiheuttaa kasvua arabadgeenien ekspressiotasoon. Mutta toisaalta se aiheuttaa laskua arac-geenin ekspressiotasoon. Geenin ilmentymisen mittauksista in vivo voidaan päätellä, että geeninekspressio on monivaiheinen ja satunnainen prosessi, jota ei voi mallintaa yhdellä reaktiolla. Johtuen käytössä olevan datan vähyydestä, kuvien analysoinnin tuloksista ei voi vetää sen laajempia johtopäätöksiä. Tästä työstä voidaan päätellä, että geeniekspressio on stokastinen prosessi, johon vaikuttaa erilaisia ympäristötekijöitä. Eri olosuhteissa geeniekspressiotason muuttuminen antaa sopeutumismahdollisuuden eri organismille erilaisiin olosuhteisiin ja estää tuhlaavaista ylituotantoa sillä hetkellä tarpeettomasta proteiinista. Arabinoosioperonin geenit ovat hyvä esimerkki tähän koska ne eivät ekspressoi kun arbinoosisokeria ei ole ympäristössä ja täten estävät tarpeettoman proteiinin tuotannon. Toisaalta geenit käynnistyvät arabinoosisokerin ollessa ympäristössä. Tässä työssä keskityttiin arabinoosisokerin vaikutukseen arabinoosioperonin säätelyyn. On olemassa myös toinen molekyyli, syklinen AMP (CAP-cAMP interaktio), joka vaikuttaa arabinoosioperonin säätelyyn ja auttaa hajottamaan DNA-silmukkaa. Tulevaisuudessa olisikin mielenkiintoista analysoida tämän vaikutusta arabinoosioperoniin.

27 22 LÄHTEET [1] Stolovicki, E., Braun, E., Collective dynamics of gene expression in cell populations, PLoS one, 2011, 6: e [2] Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S.M., Cox, E.C., Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria, Cell 2005, 123: [3] Weaver, R., Hedrick, P., Genetics, Wm. C. Brown Publishers, Dubuque, IA, USA, [4] Gillespie, D. T., A general method for numerically simulating the stochastic time evolution of coupled chemical reactions, J. Comput. Phys. 1976, 22: [5] Ribeiro, A.S., Lioyd-Price, J., SGNSim, a stochastic genetic network simulator, Bioinformatics, 2007, 23(6): [6] Wikipedia. [WWW]. [Viitattu ]. Saatavissa: [7] McClure, W. R., Mechanism and control of transcription initiation in prokaryotes, Ann. Rev. Biochem, 1985, 54: [8] Bai, L., Santangelo, T.J., Wang, M.D., Single-molecule analyses of RNA polymerase transcription, Ann. Rev. Biophys. Biomol, 2006, 35: [9] Turn, N., Trempy, J., Fundamental Bacterial genetic, First edition, 2003, Chapter 12. [10] Schleif R., AraC protein: a love-hate relationship, BioEssay, 2003, 25: [11] Schleif R., Regulation of the L-arabinose operon in Escherichia coli, Trends Genet, 2000, 16: [12] Ribeiro, A.S., Zhu, R., Kauffman, S.A., A general modeling strategy for gene regulatory, J. Comp. Bio., 2006, 13: [13] Gross, J., Englesberg, E., Determination of the order of mutational sites governing L-arabinose utilization in Escherichia coli B/r by transduction with phage P1bt, Virology, 1959, 9:

28 23 [14] Greive, S.J., von Hippel, P.H., "Thinking quantitatively about transcriptional regulation, Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6: [15] Roussel, M.R, Zhu, R., Validation of an algorithm for delay stochastic simulation of transcription and translation in prokaryotic gene expression, Phys. Biol., 2006, 3: [16] Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.W., Prasher, D.C., Green fluorescent protein as a marker for gene expression, Science, 1994, 263: [17] Paulsson, J., Models of stochastic gene expression, Physics of Life Reviews, 2005, 2: [18] Hamilton, E.P., Lee, N., Three binding sites for AraC protein are required for autoregulation of arac in Escherichia coli, Biochemistry, 1988, 85: [19] Lutz, R., Bujard, H., Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements, Nucleic Acids Res, 1997, 25: