CHEM-A1310 Biotieteen perusteet 2019

Transkriptio

1 CHEM-A1310 Biotieteen perusteet 2019 Laboratoriodemojen teoriaosuus Huomaa: Jokaisesta suorittamatta jääneestä demokerrasta vähennetään 0.75 pistettä tentin kokonaispisteistä. Rästikertojen jälkeen suoritukset eivät ole enää mahdollisia. Rästiä ei ole mahdollista suorittaa esim. kirjallisella tehtävällä. Laboratoriodemoihin mukaan oma laboratoriotakki, suojalasit (tarvittaessa saa lainattuakin) ja kirjoitusvälineet + laskin harjoitustyön aikana tulet vastaamaan kirjallisiin kysymyksiin, jotka palautetaan opettajalle harjoituskerran lopussa; harjoituskerta arvostellaan käytännön työn lisäksi näiden vastausten perusteella (hyväksytty/hylätty) Laboratoriodemoissa mukana myös englanninkielisiä opettajia Mikroluokkademoon (Entsyymi) EI laboratoriovarusteissa!

2 Laboratoriodemot pidetään B-siiven oppilaslaboratoriossa SUN Saavu hyvissä ajoin ennen demoa B-siiven aulaan, demot alkavat aina tasalta! Huom! Kumpaankin demoon on tulossa yksi uusi ryhmä, valitse nämä jos muut eivät käy tai et ole vielä ilmoittautunut KROMA, ke 6.2. klo 14:00-16:00 GEELIAJO, ma klo 10:00-12:00 2

3 Kromatografia Kromatografiaa voi käyttää proteiiniseosten puhdistukseen esim. koon ja/tai nettovarausten perusteella 3

4 Kromatografiat proteiinien puhdistuksessa Ekskluusiokromatografia (size-exclusion chromatography) Muita nimiä: molekyyliseulakromatografia, geelikromatografia Ioninvaihtokromatografia Kiinteä faasi on joko positiivisesti tai negatiivisesti varautunut ja vastakkaisesti varautunut proteiini tarttuu siihen. Vastaavasti stationäärin kanssa samanmerkkisen varauksen omaavat ionit hylkivät stationäärifaasia ja liikkuvat kromatografiakolonnin läpi nopeammin kuin erimerkkiset varaukset ja niiden retentioaika on lyhyempi Affiniteettikromatografia Proteiinilla spesifinen sitoutuminen kiinteän faasin ligandiin, esim. antigeeni vasta-aine, entsyymi substraatti tai reseptori ligandi Ekskluusiokromatografian periaate Pienikokoiset molekyylit kulkevat kolonnin partikkelien pienten huokosten kautta ja siksi liikkuvat kolonnissa hitaasti. Suuret proteiinit ja muut molekyylit kulkevat partikkelien ulkopuolelta ja siksi liikkuvat kolonnissa nopeasti. 4

5 Ekskluusiokromatografiassa proteiinien ja muiden molekyylien erotus perustuu niiden erilaiseen etenemisnopeuteen kiinteällä materiaalilla täytetyssä kolonnissa. Erottuminen koon mukaan. Vertaa esim. DNA-elektroforeesi! Pienet vs. isot DNA-palat, kummat kulkevat nopeammin? Näyte ajetaan sisään kolonniin ja sen jälkeen kolonniin ajetaan puskuria, jossa proteiinit liikkuvat kolonnin sisällä. t06/sim0.htm 5

6 Korkean erotuskyvyn nestekromatografia, josta yleisimmin käytetään lyhennettä HPLC (engl. High Performance Liquid Chromatography) Esimerkki HPLC-laitteistosta Tutkimustilanteessa kolonnista ulos tulevan proteiinin määrä mitataan esim. UV-detektorilla, jolloin nähdään missä fraktioissa erottuvat proteiinit ovat. Figure 2: HPLC chromatographic protein analysis of the fractions collected by the preparative size-exclusion chromatography (Sephadex G-100 column) of the clarified medium of the submerse culture. 6

7 Demotyön kuvaus Puhdistuskolonnin läpi ajetaan väriliuos, jossa erikokoiset (iso ja pieni) värimolekyylit kulkevat eri nopeuksilla kolonnin sisältämän geelin läpi ja siten erottuvat toisistaan. Värimolekyylit poistuvat kolonnista eri aikoina. Tässä työssä käytämme värimolekyylejä lähtömateriaalina, jotta voitte seurata erottumistapahtumaa. Työn aikana kerätään näytefraktioita. Econo-Pac 10DG Puskuri: 50 mm Tris-HCl, ph 7.5 Blue dextran Fluorescein DNA:n geelielektroforeesi Proteiinien geelielektroforeesi 7

8 DNA eliöissä DNA-sekvenssi ja geenit muodostavat eliöiden genotyypin ja määräävät täten myös fenotyypin eli ilmiasun, jonka me voimme havaita. DNA on luonnon keskeinen rakennusosanen ja se toimii myös pohjana biotekniikan ja synteettisen biologian sovelluksissa. DNA sisältää solun geneettisen informaation (käydään läpi prof. Linderin luennolla) 8

9 Geelielektroforeesi DNA-tutkimuksen perustyökaluna Kun DNA on eristetty esim. eläinsolusta tai bakteerista, sitä voidaan esim. Kopioida PCR:n (polymerase chain reaktion, polymeraasiketjureaktio) avulla Tai vaikkapa pilkkoa paloihin entsyymien avulla DNA:ta voidaan pilkkoa restriktio- eli katkaisuentsyymeillä, jotka tunnistavat esim. kuuden tai kahdeksan nukleotidin jakson sekvenssistä Perustyökalu esim. rekombinantti-dna-tekniikassa DNA-palojen pituus voidaan määrittää geelielektroforeesilla PCR Figure 1 How Polymerase Chain Reaction works: 1) Denaturation: the reaction is heated to C for seconds to break the hydrogen bonds between the strands. 2) Annealing: the reaction temperature is lowered to C for seconds to allow primers to anneal to the template strands. 3) Elongation: the temperature is increased (optimal temperature dependenton DNA Polymerase used e.g C for Taq Polymerase) to allow for the addition of dntps. The amount of target sequence doubles with each thermal cycle which leads to an exponential amplification represented by 2 (# of cycles). 9

10 Restriktioentsyymi katkaisee DNA:n nology.htm Restriktioentsyymejä on erilaisia 10

11 Esimerkki DNA-digestion sovelluskohteesta: Geenin kloonaus plasmidiin, jonka avulla haluttua proteiinia voidaan tuottaa esim. E. coli soluissa -haluttu proteiini voi olla esim. lääkeaine tai vaikkapa entsyymi, jota bakteeri ei luonnostaan tuota Harjoitustyö: DNA-geelielektroforeesi ja analyysi 11

12 Plasmidissa olevan geeni-insertin olemassaolo voidaan tarkistaa restriktioentsyymi-digestion ja DNA-geelielektroforeesin avulla. Elektroforeesin tuloksena voidaan määrittää DNA-palojen määrä ja koko bp 6200 bp Mikä on DNA:n varaus: negatiivinen, neutraali vai positiivinen? Mihin suuntaan DNA-palat liikkuvat sähkövirrassa? 12

13 SybrSafe: SYBR Safe is a safer alternative to the known mutagen ethidium bromide. - A cyanine dye used as a nucleic acid stain in molecular biology - Binds to DNA - The resulting DNA-dyecomplex absorbs blue light (λ max = 509 nm) and emits green light (λ max = 524 nm) 13

14 Värjätty DNA näkyy UV-valossa - Suojamaskia ja suojakäsineitä käytettävä! Videot 1) Video agaroosigeelin valmistuksesta (BioRad) 2) Video DNA-agaroosigeeliajosta (BioRad) 14

15 Proteiinien elektroforeesi Miten erottaa erilaiset proteiinit toisistaan? Exam%201%20Review/Ch03%20Cell%20Organelles%20&%20Cytoskeleton.htm 15

16 Miten voidaan havaita onko haluamaamme proteiinia syntynyt esim. mikrobeissa tuotettaessa? Proteiinien elektroforeesin periaate Proteiinit liikkuvat sähkökentässä Hyödynnetään proteiinien erottamiseksi toisistaan tunnistamista varten Proteiinit liikkuvat kokonsa perusteella eri nopeuksilla ja siten erottuvat toisistaan 16

17 SDS-PAGE SDS = sodium dodecyl sulphate (negatiivisesti varautunut detergentti) PAGE = polyakryyliamidi-geelielektroforeesi SDS-PAGE = natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi SDS denaturoi ja linearisoi proteiinit niiden primaarirakenteiksi eli aminohapposekvenssimuotoon sekä päällystää linearisoidut proteiinit -> kompleksilla negatiivinen varaus SDS-PAGE Miksi juuri polyakryyliamidi? Kemiallisesti inertti Sähköisesti neutraali Hydrofiilinen Läpinäkyvä koostumus hyvä havainnointitarkoituksiin 17

18 Proteiinien erottuminen Proteiinin koon määritys FDH: 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase 2,3-BDH: 2,3-butanediol dehydrogenase GDH: glutamate dehydrogenase 18

19 Proteiini-elektroforeesin työjärjestys Ajopuskurien valmistus Geelin valmistus Näytteiden valmistelu ajoa varten Näytteiden ja standardien lataus ja ajo Geelin värjäys ja/tai immunoblottaus Kuvantaminen ja tulosten analysointi Esimerkki näyte-cocktailista: Tris-HCl-puskuri SDS glyseroli bromophenol blue DTT (dithiothreitol, rikkisillat poikki) näy eiden denaturoin kuumentamalla Geelin värjäys - Esim. Coomassie blue -värillä Huom! Muista työturvallisuus ja suojavarusteet, esim. akryyliamidi on neurotoksiini Laitteisto 200 V Tärkeää, että johdot kytketään oikein päin! Ajolaitteen kansi päälle/pois vasta, kun virtalähde on sammutettu ja johdot on irrotettu virtalähteestä! 19

20 20

21 Proteiinien identifiointi geeliajon jälkeen Yhtenä vaihtoehtona proteiinien immunoblottaus eli Western blot Geeliajossa koon mukaan erotellut proteiinit siirretään sähkövirran avulla membraanille, josta haluttu proteiini voidaan tunnistaa sille spesifisen vasta-aineen avulla western-blot-protein-immunoblot.html#.vqqjewo6h8e 21

22 Western blot -menetelmän tuloksena vain tutkittava proteiini havaitaan membraanilla, jos alkuperäinen näyte sisältää ko. proteiinia Kemiluminesenssiin tai kolorimetriseen reaktioon perustuva detektio Video Video vertikaalisesta SDS-PAGE-ajosta: 22

23 Huom! Käy tämä teoriaosuus läpi vielä juuri ennen omaa harjoituskertaasi (osa harjoituskerroista vasta maaliskuussa), jotta osaat toimia oikein demossa ja pystyt vastaamaan analyysiosuuden kysymyksiin Töiden suoritus Pienryhmissä B-siiven oppilaslaboratorioissa Pipetointiharjoitukset geeleihin sekä kromatografia-ajo (agaroosi) Erillinen analyysiosio, tehtävien läpikäynti pienryhmissä -> opettajat tarkastavat tehtävät ja keräävät vastauspaperit ennen kuin lähdette Tule ajoissa paikalle, työ alkaa heti ilmoitettuna ajankohtana Mukaan laboratoriotakki ja suojalasit sekä kirjoitusvälineet REPPUJA ja TAKKEJA ym. EI LABORATORIOTILOIHIN! B-siiven aulassa lokerot päiväsäilytystä varten 23