Uuden sukupolven sekvensointimenetelmät ja diagnostiikka

Koko: px

Aloita esitys sivulta:

Download "Uuden sukupolven sekvensointimenetelmät ja diagnostiikka"

Jukka-Pekka Hänninen
7 vuotta sitten
Katselukertoja:

1 Uuden sukupolven sekvensointimenetelmät ja diagnostiikka Juha-Pekka Pursiheimo Turun Yliopisto Turku Clinical Sequencing Laboratory (TCSL) Labquality Days

2 n. 3,3 miljardia emäsparia kliinisesti merkittävät muutokset

3 teho hinta

4 n. 70 KB emästä -> 20 A4:sta n. 100 GB emästä 350 miljoonaa sekvenssiä (2x150 emästä) -> 30 miljoonaa sivua -> 3360m -> kg 10x

6 Uuden sukupolven sekvensointi: mitä sillä tarkoitetaan -Sekvensoidaan (analysoidaan) useita genomialueita moninkertaisesti useilta potilailta samanaikaisesti DNA rakennevirheet -pistemutaatiot (SNP) -deleetiot -insertiot Kromosomitason muutokset -deleetiot -insertiot -translokaatiot -aneuploidiat

7 Uuden sukupolven sekvensointi: miten se toimii 1. Genomisen materiaalin (gdna) muokkaus pilkonta rikastus (pyydystys tai monistus) 2. DNA-juosteiden erottelu ja kiinnittäminen lasilevy beadit 3. Kiinnitettyjen DNA-juosteiden monistaminen 4. Kaikkien monistettujen DNA-juosteiden samanaikainen analysointi sekvensointi synteesin avulla (SBS) 5. Data-analyysi

8 Uuden sukupolven sekvensointimenetelmien kliiniset hyödyt -Tehokkaampaa diagnostiikkaa Uudet tautigeenit, tautia aiheuttavat genomiset muutokset -Hoitotehon nosto (personalized medicine, precision medicine) precision medicine Is defined as tailoring of tehottomat / haitalliset hoidot vähenevät medical treatment to the individual characteristics -Ennaltaehkäisevät hoidot of each patient (National Research Council, 2011). -Luokittelu ja tautiryhmien jaottelu

9 Miten hyödyt saavutetaan parhaiten?? -Yhteistyö/informaation jako fenotyyppi/genotyyppi/hoitoteho - Laatuvarmistetut ja standardoidut työtavat/ohjeet/kitit - Laatuvarmistettu ja standardoitu data-analyysi muutosten löytäminen raportointi

10 Huomioon otettavia asioita suunniteltaessa Uuden sukupolven sekvensointia kliiniseen käyttöön Diagnostinen saanto/hyöty (Diagnostic yield): -Millä todennäköisyydellä menetelmällä löydetään taudin selittävä genominen muutos -Suhteutuu aina tutkimuskohteeseen ja käytössä olevaan menetelmään -Täytyy olla selkeästi parempi kuin kaytössä olevilla menetelmillä Tutkittavat geenit: -Kliinisessä diagnostiikassa vain ne geenit joilla selkeästi todennettu yhteys tutkittavaan tautiin sisällytetään geenilistaan -Lista täytyy laatia/suunnitella yhteistyössä alan kliinisten asiantuntijoiden kanssa -Analyysissä keskitytään vain näihin geeneihin (validaatiot) Testien rajoitteet: -Teknisistä syistä johtuvat testin sisäiset rajoitteet tulee selvittää testin tilaajalle. Selkeä informaatio siitä mitä voidaan luotettavasti tutkia

11 Haasteita: -Haastavat näytteet (määrä, laatu ) -Logistiikan toimivuus (näytteiden säilytys, käsittely, toimitusajat ) -Moniammatillisuus (mm. bioinformaatikkojen saatavuus) -Laitteiden, analyysiohjelmien toimiminen (varalaitteet, huollot, päivitykset ) -Tulosten pitkäaikainen säilyttäminen (paikallinen vai pilvipalvelu) -Data-analyysi (oma vai osto) -Tuntemattomat variantit, kliininen merkitys, merkintä ja lausuminen epävarmuutta löydetyistä muutoksista joiden merkitystä ei tunneta tutkimuksen ulkopuoliset löydökset (incidental findings) **Ei yhtenäistä toiminta tapaa, jokaisella omat

12 Uuden sukupolven sekvensointimenetelmien diagnostisia sovellutuksia

13 Koko genomin sekvensointi Whole Genome Sequencing (WGS) -Antaa nukleotiditason kuvan koko genomista (n.90%) -Mahdollisuus analysoida kaikki genomiset muutokset -Uudet tautigeenit ja tauteja aiheuttavat genomiset muutokset

14 -14v. kaksoset joilla DRD (Dopa-Responsive Dystonia) -Koko genomin sekvensoinnilla löydettiin het. mutaatiot SPR geenissä -Hoito: L-Dopa vaihdettiin 5-hydroxytryptofaaniin -Molempien potilaiden tila parani huomattavasti -6 potilasta joilla vakava epilepsia 4 Ohtaharan Syndrooma (OS) 2 NSEOE (non-syndromic early-onset epilepsy) -Aiemmat geneettiset analyysit ilman tulosta -Koko genomin sekvensoinnilla löydettiin OSpotilailta 2 de-novo mutaatiota (KCNT1 ja PIGQ) -NSEOE-potilailta CBL ja CSNK1G1 de-novo mutaatiot

15 Eksomisekvensointi Whole Exome Sequencing (WES) -Analysoidaan vain proteiineja koodaavat genomialueet, eli eksonit -n. 1% genomisesta materiaalista -Mahdollista kattaa yli 95% eksoneista, yli 85% tunnetuista tautia-aiheuttavista muutoksista -Kohdealuetta voidaan haluttaessa laajentaa -Uudet tautigeenit ja tauteja aiheuttavat genomiset muutokset -n. 200 tautigeeniä tunnistettu eksomisekvensoinnilla -Kliinisessä käytössä, voidaan helposti pilkkoa pienempiin paneeleihin -Useita eri versioita ja valmistajia

16 -Poika (15kk); oireita jotka viittasivat Chronin tautiin -Tarkoista kliinisistä tutkimuksista huolimatta ei diagnoosia -Eksomisekvensointi löysi hemitsygoottisen missense-mutaation X-linked Inhibitor of Apoptosis geenissä -Löydöksen pohjalta tehtiin allogeeninen solusiirto, jonka seurauksena oireet helpottivat merkittävästi -78 potilasta joilla eriasteisia neurologisia kehityshäiriöitä -Eksomisekvensointi löysi selittävän mutaation 32:lle potilaalle (41%) -Päätelmä: eksomisekvensointi tarjoaa luotettavan ja tehokkaan työkalun varhaiseen diagnosointiin ja hoidon ohjaukseen

17 Paneeli sekvensointi -Tarkasti tiettyyn tautiin/tautiryhmään suunniteltu geenilista -Rajattu, vain tunnetut muutokset -Useita menetelmiä kohdentamiseen

18 -HaloPlex-paneeli jossa 10 kardiomyopatian kehittymiseen liitettyä geeniä -Tarkkuus ja herkkyys sama kuin Sangerilla -Toimii luotettavasti kliinisessä tutkimuksessa -TruSeq Amplicon Cancer -paneeli (Illumina) jossa 54 syöpägeeniä -63 potilasta joilla AML -Pistemutaatiot, insertiot ja duplikaatiot voitiin luotettavasti analysoida -1.5% alleelifrekvenssi!!

19 Soluvapaa DNA (cell free DNA; cfdna) -DNA:ta vapautuu verenkiertoon kuolevista (apoptoosi/nekroosi) soluista ja/tai eksosomien kautta -Soluvapaata DNA:ta käytetään diagnostisissa tutkimuksisssa -Lyhyt puoliaika (dynamiikka) -Lyhyitä DNA-fragmentteja (n emäsparia) NIPT (Non-Invasive Prenatal Test) Syöpädiagnostiikka

20 NIPT (Non-Invasive Prenatal Test) -Sikiön DNA:ta vapautuu äidin verenkiertoon istukan soluista -Kromosomien 21 (Down syndrome), 18 (Edwards syndrome) ja 13 (Patau syndrome) aneuploidiat perustesti -Sukupuolikromosomien aneuploidiat -Sikiön DNA:n määrä

21 Soluvapaa DNA syöpädiagnostiikassa: -Kasvaimen geneettinen monimuotoisuus -Hoitovasteen seuranta -Kasvaimen muuttuminen hoidon seurauksena -Jäännöstautidiagnostiikka -Kasvaimen varhainen havaitseminen -Etäpesäkkeiden havaitseminen -Kasvain taakan havaitseminen

22 Soluvapaa DNA syöpädiagnostiikassa: Patient ARI Alternate Allele Frequency (%) KRAS c.35g>a TP53 c.584t>c SMAD4 c.1055g>a PTEN c.66c>g Weeks

Samankaltaiset tiedostot

NGS:n haasteet diagnostiikassa. 9.10.2014 Soili Kytölä, dos. sairaalageneetikko HUSLAB, genetiikan laboratorio

NGS:n haasteet diagnostiikassa 9.10.2014 Soili Kytölä, dos. sairaalageneetikko HUSLAB, genetiikan laboratorio Sidonnaisuudet Kokousmatkoja: Novartis Luentopalkkioita: AstraZeneca, Roche, Pfizer, Lilly