Mitä uutta DNA:sta. - koko perimän laajuiset analyysimenetelmät ja niiden sovellukset. Heidi Nousiainen, FT Erikoistuva kemisti, HUSLAB

Transkriptio

1 Mitä uutta DNA:sta - koko perimän laajuiset analyysimenetelmät ja niiden sovellukset Heidi Nousiainen, FT Erikoistuva kemisti, HUSLAB SKKY:n ja Sairaalakemistit Ry:n syyskoulutuspäivät Paasitorni,

2 Genomi 23 kromosomiparia (22 + XY) 3 miljardia emäsparia n geeniä Eksomi 1,5 % koko genomista valkuaisaineita koodaavat alueet mirnat ja muut toiminnalliset RNAt perimän läpiluenta valmistui v projekti kesti yli 10 vuotta

3 GCTGTGCTGCGCGCGCGTCCCGGAAGCAGAAGCCTGTGTGGCCTTCCCGGC GGCTGATTCGAGGGCTTGTTTGGTCAGAAGGGGGGCGTCAGAGAAGCTGCC CCTTAGCCAACCATGCCGTCTGAGGGTCGCTGCTGGGAGACCTTGAAGGCCC TACGCAGTTCCGACAAAGGTCGCCTTTGCTACTACCGCGACTGGCTGCTGCGG CGCGAGGTGAGCGGTGGCCCCGGAGGACGTAGGCCTTTCCGGCCCCTCGCG ACCGAAACCTTCTCCCTAGCCGTTGGCACGTTCTGCTCCCGGGAACCCGTGCA GTCTAACAACCTGCATTTATTTCTTGACTTCTGTGTGTACATCCCTCTGTCCTGG GGTTTCTGTCCTCTTCAGCCTATTTTAGCGTTTCGGGGAGCTCCCCTGACTTCA CAGGTGCCCCGCGCTCTGAAGGCTTCATTGCTACCCTCCGCCAGTTGGGCGCC TTCTCCGTTCTGCTGTTGTCAAAGCAATCTCGGCCCCAGGTTCAGTTAACTTAC TGTATGTCTCATGTGCTGGGAGCTCTAGAGTTGCGACGAACGATTGACACGAC CTAATCCATTGCTACTAGTGAAATGACCAAATTTTTAGATTGATTTGGCAGACC TGGAAAGTGAATGGGGGCGTGGTCACCGTACCTAGCATTTGCAAAGCTCTGC GCGAGAAGTGGAGGGATGTGGAGAGTTAAGGCCAGCTCCCATTCCCGAGTC GCTGCTAGTTAGCTACAGATAAGGCGTTGTCCTGCATCCTCAGACTTCTTGGG AAACAATCCTAAAGTATTTCCCTGTCTTTTATGTTGTTGACAGTTTTGAAAAATA CAGACCTTACATTCTGTAGGTTGACTGCCAGCATATGTGCTTTCAAACCACCAG ACCAAGGTTAAGCATTCTTGGCAGGAATACCACAGAAATGATGCCATGGCTTT CTCAGTACATGAGGAGGCACACAGATGTCAACCCATCCCAACACTGGTGATGC TAATCTTGATCACCTGGTTACGTTATTATCTGCCTGGTCTCTCCGTTTAAAATTC GTCATTTTTCCCTTAGTAATTGTTGGGAAGTAATAATACCAGTATCCTTTTTTCT GGGCAAACCTTAATCCTCCATGGCTTTAGCATTCATTGATGTTTTCCACATGAAT CGATACCTCTATGACGTTGCCAGATCCTGTTTCTTTATATCCGCTATTCCTTCTGC ATTTGTTAGTTGGCATTCTACTGTAAGGAGGTGCTTTCTATTTTATTCAGTGATT GTAATCCATTACTTTTATTATTTATTTATTTTATTTTAAATGTCCCAGATTTTGTAA GCTTGTATCAAAATAATCACATGCAAGGCTAGGCGTGGTGGCTCAGGCCCGTA ATCCCAGCACGTTGGGAGGCCGAGGGGGACGGATCACTTGAGGTCAAGAGT TCGCGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACCGCATCTCTACTAAAAATACAAA ATTAGCCGAGCATGGTGGTGCATGCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGACTGAG GCATGAGAATTGCTTGAACCCTGGAAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATTG TGCTGCTGCACTCAAGCCTGGGTGACAGAGTGAGACTGTGTCTCAAAAAAAA AAATGTAGCCTTGTAAATATGTACAACAATTATGTATTCATAAGAATTAAAAAGA

4 GGCCTTCCCGGCGGCTGATTCGAGGGCTTGTTTGGTCAGAAGGGGGGCGTCAGAGAAGCT GCCCCTTAGCCAACCATGCCGTCTGAGGGTCGCTGCTGGGAGACCTTGAAGGCCCTACGC AGTTCCGACAAAGGTCGCCTTTGCTACTACCGCGACTGGCTGCTGCGGCGCGAGGTGAGC GGTGGCCCCGGAGGACGTAGGCCTTTCCGGCCCCTCGCGACCGAAACCTTCTCCCTAGCC GTTGGCACGTTCTGCTCCCGGGAACCCGTGCAGTCTAACAACCTGCATTTATTTCTTGAC TTCTGTGTGTACATCCCTCTGTCCTGGGGTTTCTGTCCTCTTCAGCCTATTTTAGCGTTT CGGGGAGCTCCCCTGACTTCACAGGTGCCCCGCGCTCTGAAGGCTTCATTGCTACCCTCC GCCAGTTGGGCGCCTTCTCCGTTCTGCTGTTGTCAAAGCAATCTCGGCCCCAGGTTCAGT TAACTTACTGTATGTCTCATGTGCTGGGAGCTCTAGAGTTTGCGACGAACGATTGACACG ACCTAATCCATTGCTACTAGTGAAATGACCAAATTTTTAGATTGATTTGGCAGACCTGGA AAGTGAATGGGGGCGTGGTCACCGTACCTAGCATTTGCAAAGCTCTGCGCGAGAAGTGGA GGGATGTGGAGAGTTAAGGCCGAGCTCCCATTCCCGAGTCGCTGCTAGTTAGCTACAGAT AAGGCGTTGTCCTGCATCCTCAGACTTCTTGGGAAACAATCCTAAAGTATTTCCCTGTCT TTTATGTTGTTGACAGTTTTGAAAAATACAGACCTTACATTCTGTAGGTTGACTGCCAGC ATATGTGCTTTCAAACCACCAGACCAAGGTTAAGCATTCTTGGCAGGAATACCACAGAAA TGATGCCATGGCTTTCTCAGTAAGTCACATGAGGAGGCACACAGATGTCAACCCATCCCA ACACTGGTGATGCTAATCTTGATCACCTGGTTACGTTATTATCTGCCTGGTCTCTCCGTT TAAAATTCGTCATTTTTCCCTTAGTAATTGTTGGGAAGTAATAATACCAGTATCCTTTTT TCTGGGCAAACCTTAATCCTCCATGGCTTTAGCATTCATTGATGTTTTCCACATGAATCG ATACCTCTATGACGTTGCCAGATCCTGTTTCTTTATATCCGCTATTCCTTCTGCATTTGT TAGTTGGCATTCTACTGTAAGGAGGTGCTTTCTATTTTATTCAGTGAGTTGTAATCCATT ACTTTTATTATTTATTTATTTTATTTTAAATGTCCCAGATTTTGTAAGCTTGTATCAAAA TAATCACATGCAAGGCTAGGCGTGGTGGCTCAGGCCCGTAATCCCAGCACGTTGGGAGGC CGAGGGGGACGGATCACTTGAGGTCAAGAGTTCGCGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAA CCGCATCTCTACTAAAAATACAAAATTAGCCGAGCATGGTGGTGCATGCCTGTAATCCCA GCTACTCGGGAGACTGAGGCATGAGAATTGCTTGAACCCTGGAAGCAGAGGTTGCAGTGA GCCGAGATTGTGCTGCTGCACTCAAGCCTGGGTGACAGAGTGAGACTGTGTCTCAAAAAA AAAAATGTAGCCTTGTAAATATGTACAACAATTATGTATTCATAAGAATTAAAAAGAAAA ATGTCCCAGATTTGGCTACTGGGCACCTCATTAAGTTGGTTCCTGTGTTCCTGTGACATA TTTCCATCTTTCATTGACATTTCTTTACTTTTTGACACAAAAAGATGTCCCAGGTGCAAG Eksoneita 1,5 % eksoni introni eksoni introni

5 Entäs ne loput 98,5 %? ENCODE the Encyclopedia of DNA Elements

6 Sanastoa Sekvensointi perimän emäsjärjestyksen lukeminen uuden sukupolven sekvensointimenetelmät NGS next generation sequencing WGS whole genome sequencing WES whole exome sequencing

7 Roche Nimblegen HD2 sequence capture array

8

9

10 Mikään nykyisistä menetelmistä ei ole 100 % Agilent Technologies Illumina SureSelect V4+UTRs 71 Mb genes exons TruSeq 62 Mb genes exons Roche NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v Mb > genes

11 The Human Gene Mutation Database (HGMD) Number of entries (HGMD Professional release ) TOTAL Missense/nonsense Splicing Regulatory Small deletions Small insertions Small indels Repeat variations Gross insertions/duplications Complex rearrangements Gross deletions

12 Yhden ihmisgenomin emäsparien lukumäärä auki kirjoitettuna vastaa noin 200 Raamattua.

13 Ihmisten välillä esiintyy runsaasti perinnöllistä vaihtelua. Esimerkiksi yhden emäksen muutoksia (Single nucleotide polymorphism, SNP) esiintyy genomissa keskimäärin noin emäksen välein. Jokainen kantaa perimässään muutoksia (normaali varianssi) Jokaisella on oma, yksilöllinen DNA-sormenjälki. Sairautta aiheuttavia mutaatioita etsiessä pitää osata erottaa normaali variaatio patogeenisesta mutaatiosta.

14 Muutokset, jotka eivät ole eksoneissa tai silmukointikohdissa, poistetaan varianttia Muutokset, jotka eivät vaikuta aminohapporakenteeseen tai silmukointiin, poistetaan varianttia Yleisistä tietokannoista (normaaliväestöstä) löytyvät variantit poistetaan varianttia Jäljellä olevia variantteja verrataan erilaisiin tietokantoihin varianttia

15 Eksomisekvensointi kliinisessä käytössä pilottitutkimuksia: 1. Dixon-Salazar TJ et al. Exome sequencing can improve diagnosis and alter patient management. Sci Transl Med 2012;4:138ra Calvo SE et al. Molecular diagnosis of infantile mitochondrial disease with targeted next-generation sequencing. Sci Transl Med 2012;4:118ra Need ACet al. Clinical application of exome sequencing in undiagnosed genetic conditions. J Med Genet 2012;49:

16 Eksomisekvensointi kliinisessä käytössä pilottitutkimuksia: 118 potilasta neurologinen kehityshäiriö 19 % tautimutaatio löytyi 8 % alkuperäinen diagnoosi muuttui 42 lasta mitokondriotauti 24 % tautimutaatio löytyi 2 uutta tautigeeniä 12 perhettä potilas + vanhemmat 33 % tautimutaatio löytyi 2 uutta tautigeeniä

17 Potilastapauksia

18 Poikalapsi, jonka oireet ilmenivät 15kk iässä, tuli sairaalaan 30kk iässä, ja artikkelin lopussa hän oli melkein kuusivuotias Erittäin vaikea paksusuolen tulehdus (Crohnin taudin kaltainen taudinkuva) Hoidosta huolimatta sai sepsiksen ja joutui neljäksi viikoksi tehohoitoon

19 Paksusuoli poistettiin ja tehtiin avanne Tauti uusi hoidosta huolimatta; saatiin remissioon suonensisäisellä ruokinnalla, antibioottihoidolla ja immunosupressiolla pitkäaikaisena hoitona tämä ratkaisu ei kuitenkaan paras mahdollinen Oireet ja laboratoriotutkimukset viittasivat synnynnäiseen immuunipuutokseen Tarkkaa diagnoosia ei kuitenkaan löytynyt laboratorio- tai kliinisten tutkimusten perusteella

20 Mutaatio XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis) geenissä Potilaalta puuttuu toimiva XIAP valkuaisaine (p.c203y) kysteiini tyrosiini

21

22 XIAP-valkuaisaineen puutoksesta kärsivillä henkilöillä on korkea riski menehtyä hemofagosyyttiseen lymfohistiosytoosiin (HLH) 5v 8kk iässä potilaalle tehtiin luuytimen kantasolusiirto 42 vrk kantasolusiirron jälkeen potilas syö kiinteää ruokaa, eikä suolistosairaus ole uusinut E.A. Worthey et al.making a definitive diagnosis: Successful clinical application of whole exome sequencing in a child with intractable inflammatory bowel disease Genetics in Medicine Volume 13, Number 3, March 2011

23 Kaksoset, joilla oli diagnosoitu dopa-resistiivinen dystonia (DRD). Tyttö alkoi kärsiä 11-vuotiaana voimakkaista yskänpuuskista ja hengitysvaikeuksista. Näiden ei kuitenkaan ajateltu liittyvän DRD:hen. Kaksosten eksomit sekvensoitiin mutaatio SPR-geenissä. Bainbridge, M. N. et al. Sci. Transl. Med. 3, 87re3 (2011).

24 SPR koodaa entsyymiä, joka vaikuttaa serotoniini- ja dopamiiniaineenvaihduntaan. Se on aiemmin yhdistetty DRD:hen. Kaksoset söivät jo dopamiini-prekursoria DRD:hen, mutta geenitestin perusteella heille määrättiin lisäksi serotoniini-prekursoria. Tytön oireet helpottivat. Pojan koordinaatio- ja keskittymiskyky parani.

25 Koko genomin sekvensointi syövän hoidossa

26 Koko genomin sekvensointi syövän hoidossa Sekvensoidaan potilaan genomi ja syövän genomi Leukemian genomista voi löytyä sama mutaatio, joka on aiemmin kuvattu keuhkosyöpäpotilailla. Jos lisäksi tiedetään, että keuhkosyöpäpotilailla, joiden syövässä on tämä muutos, hoitovaste tietyllä lääkkeellä on hyvä, voidaan lääkettä kokeilla myös kyseisen leukemian hoitoon.

27 Uuden sukupolven sekvensointimenetelmä leukemian jäännöstautianalytiikassa Blood Oct 16. Deep sequencing approach for minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia.faham M, Zheng J, Moorhead M, Carlton VE, Stow P, Coustan- Smith E, Pui CH, Campana D. We compared it to gold-standard MRD assays, i.e., multiparameter flow cytometry and allele-specific oligonucleotide polymerase chain reaction (ASO-PCR), using diagnostic and follow-up samples from 106 patients with ALL. Sequencing detected MRD in all 28 samples positive by flow cytometry, and in 35 of the 36 positive by ASO-PCR; it also revealed MRD in 10 and 3 additional samples that were negative by flow cytometry and ASO-PCR, respectively. This new method allows monitoring of treatment response in ALL and other lymphoid malignancies with great sensitivity and precision.

28 Nat Rev Genet Sep;13(9): doi: /nrg3226.

29 Kliinisen mikrobiologian laboratorion prosessi Nat Rev Genet Sep;13(9): doi: /nrg3226.

30 Kliinisen mikrobiologian laboratorion prosessi tulevaisuudessa? Nat Rev Genet Sep;13(9): doi: /nrg3226.

31 Perinteinen geenidiagnostiikka Evaluoidaan potilas ja valitaan kliinisen kuvan perusteella sekvensoitavaksi yhdestä tai useammasta geenistä tietyt eksonit, joiden tiedetään liittyvän tautiin, jota potilaalla epäillään Ei toimi, jos taudinkuva on epätyypillinen tai kliinikon alkuperäinen diagnoosi ei ole oikea Koko genomin/eksomin sekvensointi Voidaan tehdä potilaalle, jonka kliininen taudinkuva on epäselvä, tai jonka geenitestin tulos tunnetuilla tautimutaatioilla on negatiivinen Etukäteen ei tarvitse tietää, mitä etsii

32 NGS (Next Generation Sequencing) korvaa tulevaisuudessa yksittäiset geenitestit lähes kaikissa perinnöllisissä sairauksissa Erityisen hyödyllinen silloin kun: taudin geneettinen tausta on hyvin heterogeeninen (esim. retinitis pigmentosa, jossa tunnetaan kymmeniä tautigeenejä) potilaan diagnoosi on epävarma Hankinnaisten sairauksien diagnostiikka (erityisesti syövät) Henkilökohtainen lääketiede

33 Suoraan kuluttajalle myytävät geenitestit

34 Kiitos mielenkiinnosta!