Kokogenomityypitys uusi työkalu tartunnanjäljitykseen Tartuntatautikurssi 7.4.2017 Laura Lindholm
MRSA MRSA = Metisilliiniresistentti Staphylococcus aureus Resistentti lähes kaikille beetalaktaameille meca /mecc -geeni bakteerin kromosomissa Bakteerin seinämän penisilliiniä sitovan proteiinin muutos Osa kannoista lisäksi moniresistenttejä 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 2
http://urn.fi/urn:isbn:978-952-302-716-9 www.finres.fi 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 3
MRSA (Methicillin resistant S.aureus) muuntunut S.aureus MecA geeni sijaitsee siirtyvässä geneettisessä elementissä Staphylococcal cassette cromosome SCCmec, joka sisältää geenien horisontaaliseen siirtoon tarvittavat entsyymit meca geeni voi siirtyä horisontaalisesti kannasta toiseen. SCCmec-kasetit sisältävät mecageenin lisäksi insertioalueet, meca:n tuotantoa sääteleviä geenejä sekä vähintään yhden rekombinaasia koodaavan ccr-geenin. MecA geeni koodaa muuntunutta peptidoglykaanisynteesin entsyymiä (PBP2'/PBP2a), jolla on matala affiniteetti beetalaktaameille. Foster T. J Clin Invest 2004;114:1693-96 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 4
Staphylococcal casette chromosome mec SCCmec tyypitys IWG-SCC = International Working Group on the Staphylococcal Cassette Chromosome elements SCCmec-kasetit voidaan tyypittää ccr ja mec geenien perusteella SCCmec-tyyppi määräytyy näiden yhdistelmän mukaan. 29,4 kb Mec complex E: meci-mecr1-mecc-blaz, ccra1ccrb3, novel type 8 ccr http://www.sccmec.org 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 5
MRSA seuranta Suomessa 1995-2014 THL ylläpitää valtakunnallista tartuntatautirekisteriä (TTR) Tartuntatautilakiin ja -asetukseen perustuen. TTR:iin ilmoitetaan kaikki uudet MRSA-tapaukset (1995 ) MRSA kannat talletetaan kansalliseen mikrobikantakokoelmaan MRSA referenssilaboratoriossa meca varmistus (1992-2005), Molekylaarinen tyypitys (1992 ) Vuodesta 2009 pääasiallinen tyypitysmenetelmä on ollut spatyypitys Kaikki kannat tyypitetään Lisätyypityksiä tarpeen mukaan tai pyydettäessä (PFGE, MLST, PVL, mecc varmistus, SCCmec) Epidemiaselvityksissä PFGE 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 6
MRSA seuranta Suomessa 2015 Kaikkien uusien MRSA-tapausten kannat lähetetään THL:n kantakokoelmaan Verestä ja selkäydinnesteestä eristetyt MRSA-kannat lähetetään aina THL:n kantakokoelmaan Kaikille kannoille tehdään spa-tyypitys WGS (Whole Genome Sequencing) Veri ja likvorkannat Epidemiaselvitykset Erityiskysymyksenasettelut https://www.thl.fi/fi/web/infektiotaudit/laboratoriotoiminta/laboratoriotutkimukset/mrsalaboratoriotutkimukset 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 7
THL.FI - AIHEET- INFEKTIOTAUDIT- LABORATORIOTOIMINTA - LABORATORIO TUTKIMUKSET - MRSA MRSA Metisilliiniresistentti Staphylococcus aureus eli MRSA THL tutkii kaikkien uusien MRSA-tapausten MRSA-kannat. Epidemioihin, vakavaan taudinkuvaan tai relapsiepäilyihin liittyviä kantoja voidaan erikseen tutkia pyynnöstä. Tautiluokka: Muu ilmoitettava mikrobilöydös Kantakokoelma: Metisilliinille tai oksasilliinille resistentit kannat sisältyvät tartuntatautirekisterin kantakokoelmaan Lähetettävät kannat: Verestä ja selkäydinnesteestä eristetyt kannat. Muista kliinisistä näytteistä eristetyt uudet MRSA-kannat. Epidemiaepäilyn yhteydessä kerätyt kannat. Laboratoriotutkimukset Spa-tyypitys (ensisijainen tyypitysmenetelmä, tehdään kaikille kannoille) Erityistilanteissa (epidemiat, vakavat infektiot) kokogenomin sekvensointiin perustuva tyypitys Alentuneen vankomysiiniherkkyyden varmistaminen mikrodiluutiomenetelmällä. 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 8
Herkkyysmääritys: Mikrodiluutiomenetelmä (ISO20667-1 standardi, EUCAST referenssimenetelmä) Veri- ja likvorkannat Glykopeptidiherkkyydeltään alentuneet kannat 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 9
MRSA-löydökset ja niiden osuus veren S. aureus löydöksistä 1995-2016, lkm ja % Lähde:Tartuntatautirekisteri 13.2.2017 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 10
Spa-tyypitys Spa-tyypityksessä sekvensoidaan S. aureus -bakteerille spesifisen proteiini A:n polymorfista X-aluetta. a S E D A B C Xr Xc Signaalisekvenssi IgG sitoutuminen b r26 r23 r17 r34 r17 r20 r17 r12 r17 Toistojaksojen määrä vaihtelee (1-25) c AAAGAAGACGGCAACAAGCCTGG Toistojakso yleensä 21-24bp Spa-tyyppi: t067 Spa-toistojakso: 26-23-17-34-17-20-17-12-17 Spa-tyypin perusteella MRSAkantoja voidaan vertailla kansainvälisesti Väitöskirja Anni Vainio, HY 2011 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 11
Multi Locus Sequence Typing (MLST) MLST:n periaate Valitaan sopivat geenit edustamaan bakteeria S.aureus: arc, aro, glp, gmk, pta, tpi, yqi E.coli: adk, fumc, gyrb, icd, mdh, pura, reca Joskus voi olla eri geenejä käyttäviä rinnakkaisia menetelmiä ei voida vertailla tuloksia Sekvensoidaan geenit Verrataan tietokantoihin MLST-tyyppi kertoo kuuluuko isolaatti johonkin tiettyyn kansainvälisesti menestyneeseen klooniin 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 12
MLST arc yqil tpi S. aureus 2,8 Mb aro glp pta gmk ST125 arcc aroe glpf gmk_ pta_ tpi_ yqil 1 4 1 4 12 1 54 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 13
BURP (Based Upon Repeat Pattern) analyysi Spa Spa-tostojakso t952 26-23-17-34-17-20-12-12-17-16 t2348 26-23-17-34-17-20-17-12-118-16 t5213 26-23-17-34-17-20-17-12-12-12-12-16 t1265 26-23-17-34-17-20-17-12-12-12-16 t443 26-23-17-34-17-20-17-12-12-12-17-16 t3557 26-23-17-34-17-20-17-12-12-17 t088 26-23-17-34-17-20-17-12-12-17-16 t548 26-23-17-34-17-20-17-12-16 t067 26-23-17-34-17-20-17-12-17 t2066 26-23-17-34-17-20-17-12-17-12-17-16 t002 26-23-17-34-17-20-17-12-17-16 t214 26-23-17-34-17-20-17-12-17-16-16 t686 26-23-17-34-17-20-17-12-17-17 t306 26-23-17-34-17-20-17-12-17-17-16 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 14
PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) PFGE: Koko bakteerin genomi EI sekvensoida Genomisen DNA:n digestio Pulssikenttäelektroforeesi Värjäys Kuvantaminen vertailu tulkinta 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 15
Kokogenomisekvensointi Entistä tarkempi työkalu tartunnanjäljitykseen
Käsitteet NGS = Next Generation Sequencing Uuden sukupolven sekvensointitekniikat WGS = Whole Genome Sequencing Kokogenomisekvensointi C C A A T G C 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 17
Kokogenomisekvensointi Bakteerikanta DNA, kirjasto Sekvensointi Sekvenssin kokoaminen (de novo tai referenssi) MLST, SPA cgmlst Mikrobilääkeresistenssi Antigeenit, serotyypit 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 18
Kokogenomisekvensointiajon käynnistäminen 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 19
Lyhyet sekvenssit, readit MiSeq: 2x150 sekvensointikasetti: 35 151 emästä: ka 135 emästä >1 miljoona readia, 139 miljoonaa emästä / ajo / näyte 2x 250 sekvensointikasetti: 35-251 emästä, ka 230 emästä 1,7 miljoonaa readia, 390 miljoonaa emästä / ajo / näyte 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 20
Lyhyet sekvenssit yhdistellään = koonti (assembly) Contig 1 Contig 2 Con.3 Con.4 Contig 5 Contig 6 read Draft genome = con 1 + con 2 + con 3 + con 4 + con 5 + con 6 Draft genome koko genomi (osia genomista puuttuu lähes aina) Referenssi genomi 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 21
Lyhyet sekvenssit yhdistellään = koonti (assembly) Contig 1 Contig 2 Con.3 Con.4 Contig 5 Contig 6 read Lisäksi sekvensoinnissa syntyy sekvenssejä, joita ei saada yhdisteltyä eli ne jäävät kokonaan pois koonnin aikana. Saattavat sisältää tärkeää informaatiota Toisaalta saattavat sisältää kontaminoivan DNA:n sekvenssejä. Draft genome voi sisältää myös sekvenssiä, joita ei ole referenssigenomissa esim. plasmidit Referenssi genomi 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 22
core genome MLST cgmlst MLST arc arc yqil yqil aro aro tpi S. aureus 2,8 Mb tpi S. aureus 2,8 Mb glp glp pta gmk pta gmk 1823 kohdegeeniä 7 kohdegeeniä 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 23
WGS datasta saatava informaatio Spa-tyyppi Lajitunnistus Virulenssitekijät Antitioottiresistenssiprofiili J Clin Microbiol. 2014 Jul; 52(7): 2365 2370 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 24
Kokogenomisekvensointi (WGS) hyödyntäminen molekyyliepidemiologiassa Genomisekvenssi Lajimääritys Genotyyppi MLST, Spa Yksittäiset mutaatiot, Single-nucleotide polymorphism (SNP) Genomin koko informaatio saadaan käyttöön Resistenssitekijäprofiili (~ herkkyysprofiili) Lääkeresistenssiä aiheuttavat mutaatiot Genomin koko informaatio saadaan käyttöön. Esim. S.aureus MLST hyödyntää 3186 emäksen sisältämän informaation WGS hyödyntää 2,9 miljoonan emäksen sisältämän informaation 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 25
Bakteerien tyypittäminen, epidemiologinen seuranta ja ryvästymät epidemiaselvitykset MLST Spa Emm spoligo E-testi Kiekko Liemi Malja PFGE MIRU- VNTR Potilastiedot Seurantatieto Epidemioiden havaitseminen spa types of all MRSA isolates 2010-2015 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 26
Bakteerien tyypittäminen, epidemiologinen seuranta ja ryvästymät NGS/WGS Epidemiaselvitykset Epidemioiden havaitseminen Potilastiedot Seuranta 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 27
Bakteerien tyypittäminen, epidemiologinen seuranta ja ryvästymät Bakteeri Seuranta Epidemiat Herkkyysmääritys MRSA Spa-tyypitys WGS Ei CPE WGS WGS Ei VRE WGS WGS Ei S. pneumoniae WGS Harvinaisia/WGS - S. pyogenes Emm-tyypitys Harvinaisia/WGS Ei C. difficile Ribotyypitys WGS Ei Salmonella Serotyypitys WGS Kiekkoherkkyys Listeria WGS WGS Ei EHEC WGS WGS Ei M.tuberculosis Spoligo/WGS? WGS MGIT/WGS N. meningitidis Serotyypitys, WGS WGS Ei 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 28
Esimerkkejä epidemiaselvityksistä Tartuntatautikurssi 7.4.2017 Laura Lindholm
WGS:n perustuva cgmlst-sukulaisuusanalyysi Vertailussa 1828 geenin sisältämä informaatio (n. 2milj.emästä) Spa t127, ST1 Spa t002, ST5 x2 x2 Spa t172, ST375 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 30
x2 x2 Spa t386 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 31
Spa t002, pvl+ Spa t008, pvl- Spa t008, t024 pvl+ Spa t032 t008 11-19-12-21-17-34-24-34-22-25 t024 11-----12-21-17-34-24-34-22-25 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 32
Spa t172, ST375, pvl neg 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 33
x2 Spa t172, ST375, pvl neg Eri paikkakunnat 1/2016 Vanhainkoti 6/2016 avovastaanottopisteet 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 34
Spa t067, ST125 Klusteri A Vertailussa 1738 geenin sisältämä informaatio (n. 2milj.emästä) MRSA-kantojen erottelu ei onnistuisi PFGE:n eikä perinteisten spa- ja MLST tyypitysten avulla. Kannat samaa spa-tyyppiä (t067) ja samaa sekvenssityyppiä (ST125) Klusteri B 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 35
Spa t067 (FIN-16) FIN-name spa Resistance SCCmec MLST ST CC PVL FIN-16 t067 OxaMIC >256, Tob, Ery, Cip, Clin IA 125 ( 5slv ) 5 neg Klusteri A resistenssiprofiili Resistance gene Phenotype meca Beta-lactam resistance aadd Aminoglycoside resistance nora Fluoroquinolone resistance Klusteri B resistenssiprofiili Resistance gene Phenotype meca Beta-lactam resistance nora Fluoroquinolone resistance aadd Aminoglycoside resistance blaz Beta-lactam resistance mph(c) Macrolide resistance msr(a) Macrolide, Lincosamide and Streptogramin B resistance 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 36
Virulenssiprofiili hlb beta-hemolysin hlga haemolysin gamma, component A hlgb haemolysin gamma, component A hlgc haemolysin gamma, component c tst toxic shock syndrome toxin 1 luked leukocidins lukfs-pv leukocidins eta exfoliative toxin serotype A etb exfoliative toxin serotype B edinabc epidermal cell differentiation inhibitor aur aureolysin splabe seriiniproteases scn staphylococcal complement inhibitor sak staphylokinase ACME Arginine Catabolic Mobile Element enterotoxins A-E, G-O, R, U, Q 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 37
Rypäiden havaitseminen 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 38
Yhteenveto WGS tulee / jo merkittävästi muuttanut mikrobilääkeresistenssin seurantaa Moniresistentit bakteerit Seurantatieto Rypäiden havaitseminen ja epidemiaselvitykset Resistensssigeeniprofiilit Herkkyysmääritykset Virulenssitieto leviämiskyky, patogeenisuus 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 39
Kiitos! 11.4.2017 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 40