Kokogenomisekvensointi Esimerkkinä MRSA

Transkriptio

1 Kokogenomisekvensointi Esimerkkinä MRSA Laura Lindholm, erikoistutkija Asiantuntijamikrobiologia

2 Sidonnaisuudet Ei sidonnaisuuksia Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 2

3 MRSA seuranta Suomessa THL ylläpitää valtakunnallista tartuntatautirekisteriä (TTR) Tartuntatautilakiin ja -asetukseen perustuen. TTR:iin ilmoitetaan kaikki uudet MRSA-tapaukset (1995 ) MRSA kannat talletetaan kansalliseen mikrobikantakokoelmaan MRSA referenssilaboratoriossa meca varmistus ( ), Molekylaarinen tyypitys (1992 ) Vuodesta 2009 pääasiallinen tyypitysmenetelmä on ollut spatyypitys Kaikki kannat tyypitetään Lisätyypityksiä tarpeen mukaan tai pyydettäessä (PFGE, MLST, PVL, mecc varmistus, SCCmec) Epidemiaselvityksissä PFGE Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 3

4 MRSA seuranta Suomessa 2015 Asiantuntijamikrobiologiayksikkö Kaikkien uusien MRSA-tapausten kannat lähetetään THL:n kantakokoelmaan Verestä ja selkäydinnesteestä eristetyt MRSA-kannat lähetetään aina THL:n kantakokoelmaan Kaikille kannoille tehdään spa-tyypitys WGS (Whole Genome Sequencing) Veri ja likvorkannat CC398 kompleksiin kuuluvat kannat Epidemiaselvitykset Erityiskysymyksenasettelut S. aureus kantaa sekvensoitu Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 4

5 Spa-tyypitys Spa-tyypityksessä sekvensoidaan S. aureus -bakteerille spesifistä proteiini A:ta koodaavan geenin polymorfista X- aluetta. a S E D A B C Xr Xc Signaalisekvenssi IgG sitoutuminen b r26 r23 r17 r34 r17 r20 r17 r12 r17 Toistojaksojen määrä vaihtelee (1-25) c AAAGAAGACGGCAACAAGCCTGG Toistojakso yleensä 21-24bp Spa-tyyppi: t067 Spa-toistojakso: Spa-tyypin perusteella MRSAkantoja voidaan vertailla eri laboratorioiden välillä sekä kansainvälisesti Väitöskirja Anni Vainio, HY Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 5

6 Molekyyliepidemiologia Paikallisen epidemian havaitseminen, varmistaminen Molekyyliepidemiologisen seurantatiedon tuottaminen Havaitseminen, epäily Hoitava yksikkö, kliininen laboratorio, THL:n laboratorio Epidemiaselvityksen tavoite: tilannekuva infektioita aiheuttaneen mikrobin levinnäisyydestä, tartuntareiteistä ja altistuneista potilaista Epäilyn varmistaminen THL:n laboratorio (spa-tyypitys) WGS (whole genome sequencing) Tuotetaan tietoa potilaista eristettyjen bakteerikantojen sukulaisuudesta kromosomin ja/tai geenien samankaltaisuus Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 6

7 Kokogenomisekvensointi Entistä tarkempi työkalu tartunnanjäljitykseen

8 Kokogenomisekvensointi Bakteerikanta 1) Kromosomaalisen DNA:n eristys 2) Genomikirjaston valmistus 3) Sekvensointi 5) Genomitiedon hyödyntäminen 4) Sekvenssin kokoaminen de novo koonti koonti referenssikantaa vasten MLST, SPA cgmlst Mikrobilääkeresistenssi Virulenssitekijät Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 8

9 core genome MLST cgmlst arc MLST arc yqil yqil aro aro tpi S. aureus 2,8 Mb tpi S. aureus 2,8 Mb glp glp pta gmk pta gmk 1823 kohdegeeniä, 2,8 Mb 7 kohdegeeniä, 3186 bp Genomin koko informaatio saadaan käyttöön Parempi / tarkempi erottelukyky Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 9

10 WGS datasta saatava informaatio Genotyyppi; Spa,MLST Lajitunnistus Virulenssitekijät Resistenssitekijäprofiili (~ herkkyysprofiili) J Clin Microbiol Jul; 52(7): Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 10

11 Mikrobilääkeherkkyyden ennustaminen genomidatan perusteella Staphylococcus aureus

12 Genomidatan perusteella arvioidun herkkyysprofiilin vertailu perinteiseen herkkyysmääritykseen 308 Staphylococcus aureus isolaattia (185 MRSA MSSA) Kaikki isolaatit testattiin EUCAST:in kehityslaboratoriossa (MRSAisolaatit) eri mikrobilääkkeellä 5288 in silico herkkyysmääritystä, genomidatasta arvioitu resistenssitekijä profiili Euroopan stafylokokki referenssilaboratorioiden tekemät herkkyysmääritykset MBio May 5;7(3). pii: e doi: /mBio Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 12

13 Staphylococcal Reference Laboratories (SRLs) The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) Development Laboratory (EDL) Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 13

14 We note that the degree of discordance between the in silico predictions and the EUCAST data is comparable to the degree of discordance between the two sets of phenotypic data. This demonstrates that in silico predictions were at least as reliable, in terms of matching the gold standard, as the AST results generated by independent reference laboratories. We conclude that genotypic prediction is at least as reliable as routine phenotypic testing and that any discrepancies between the two approaches are just as likely to represent inaccuracies in the phenotypic testing as inaccurate genotypic predictions. Herkkyyden ennustaminen genotyypistä on vähintään yhtä luotettavaa kuin rutiini fenotyyppinen testaus. Eroavaisuudet näiden eri lähestymistapojen välillä voivat edusta yhtälailla niin fenotyyppisen testauksen kuin genotyyppisen ennustamisen epätarkkuuksia Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 14

15 Asiantuntijamikrobiologia Herkkyysmääritys: Mikrodiluutiomenetelmä (ISO standardi, EUCAST referenssimenetelmä) Veri- ja likvorkannat Glykopeptidiherkkyydeltään alentuneet kannat Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 15

16 Resistenssitekijä analyysi (WGS), MRSA 60 mikrobilääkeresistenssiiin liittyvää kohdetta + eri alleelit Metisilliini Penisillinaasit MLS (makrolidi-linkosamiini-streptogramiini) ryhmä Aminoglykosidit (Genta-, Tobra-, neo-, kanamysiini) Trimetopriimi Fusidiinihappo Mupirosiini Tetrasykliinit Kloramfenikoli Oksatsolidinonit (Linetzolidi) Glykopeptidit (Vankomysiini, Teikoplaniini) THL: WGS ja mikrodiluutiomenetelmällä tehdyn herkkyysmääritysdatan vertailu Invasiiviset kannat Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 16

17 Virulenssitieto patogeenisuus, leviämiskyky Staphylococcus aureus

18 Virulenssiprofiili 101 virulenssiin liittyvää kohdetta (adhesiinit, eksoentsyymit, hemolysiniit, toksiinit ) Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 18

19 Esimerkkejä WGS:n käytöstä MRSA epidemiaselvityksissä

20 WGS:n perustuva cgmlst-sukulaisuusanalyysi Spa t223, ST22 5 tapausta samalla osastolla 1 infektionäyte, 4 seulontanäytettä Vertailussa mukana 1845 geeniä Isolaattien väliset erot 2-6 alleelia sama kanta, todennäköisesti klonaalinen leviäminen osastolla Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 20

21 Samassa sairaalassa toisella osastolla vuotta aikaisemmin spa t223, ST22 ryväs Käynnissä oleva ryvästymän selvittely Vertailussa mukana 1845 geeniä Rypäiden ero 78 geeniä eivät ole samaa kantaa Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 21

22 Osastolla ollut 3kk aikaisemmin potilas, jolta eristetty spa t223, ST22 Vertailussa mukana 1845 geeniä ero 92 geeniä sama eivät ole samaa kantaa vältyttiin laajamittaisilta seulonnoilta Käynnissä oleva ryvästymän selvittely Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 22

23 WGS:n perustuva cgmlst-sukulaisuusanalyysi 7 potilaan ryväs samalla osastolla Vertailussa 1828 geeniä Spa t127, ST1 Spa t002, ST5 x2 x2 Spa t172, ST Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 23

24 x2 x2 Spa t Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 24

25 Spa t002, pvl+ Spa t008, pvl- Spa t008, t024 pvl+ Spa t032 t t Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 25

26 Spa t067, ST125 Klusteri A Vertailussa 1738 geenin sisältämä informaatio (n. 2milj.emästä) MRSA-kantojen erottelu ei onnistuisi PFGE:n eikä perinteisten spa- ja MLST tyypitysten avulla. Kannat samaa spa-tyyppiä (t067) ja samaa sekvenssityyppiä (ST125) Klusteri B Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 26

27 Spa t067 FIN-name spa Resistance SCCmec MLST ST CC PVL FIN-16 t067 OxaMIC >256, Tob, Ery, Cip, Clin IA 125 ( 5slv ) 5 neg Klusteri A resistenssiprofiili Resistance gene Phenotype meca Beta-lactam resistance aadd Aminoglycoside resistance nora Fluoroquinolone resistance Klusteri B resistenssiprofiili Resistance gene Phenotype meca Beta-lactam resistance nora Fluoroquinolone resistance aadd Aminoglycoside resistance blaz Beta-lactam resistance mph(c) Macrolide resistance msr(a) Macrolide, Lincosamide and Streptogramin B resistance Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 27

28 Yhteenveto WGS päämenetelmä MRSA-kantojen epidemiaselvityksissä Seurantatieto Rypäiden havaitseminen ja epidemiaselvitykset WGS:n erottelukyky on huomattavasti parempi kuin minkään perinteisen tyypitysmenetelmän Herkkyysmääritykset Resistensssigeeniprofiilit Virulenssitieto leviämiskyky, patogeenisuus Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 28

29 Kiitos! Tartuntatautipäivät 2017 / Laura Lindholm 29