Geenitekniikan perusmenetelmät

Transkriptio

1 Loppukurssikoe To klo osiota: monivalintatehtäväosio ja kirjallinen osio, jossa vastataan kahteen kysymykseen viidestä. Koe on auki klo Voit tehdä sen oppitunnilla, jolloin saat tarvittaessa teknistä apua. Voit tehdä sen myös kotona, kunhan olet nettiyhteyden piirissä. Palautteen koko kurssista saat samaan lomakkeeseen

2 Geenitekniikan perusmenetelmät

3 Geenitekniikan menetelmät ovat mahdollisia, sillä: 1) DNA:n kemiallinen rakenne on samankaltainen koko eliökunnassa 2) Geneettinen koodi on vastaavasti yleismaailmallinen Se ilmoittaa, mitkä kolmen emäsparin jonot (eli kodonit) DNA- tai RNA-molekyylissä vastaavat proteiinisynteesissä mitäkin aminohappoa

4 Toteutetaan takaisinristeytys: heterotsygootti musta lyhytkarvainen risteytetään valkoisen pitkäkarvaisen kanssa (VvPp x vvpp). Jälkeläisten fenotyypin (ilmiasun) lukusuhteista päätellään geenien V ja P sijainti. Vanhemmat: VvPp vvpp Sukusolut: VP, Vp, vp, vp vp Jälkeläiset: Sukusolut VP Vp vp vp vp VvPp Vvpp vvpp vvpp Mikäli saadaan 25 % eri fenotyyppejä, V ja P sijaitsevat eri kromosomeissa.

5 Vanhemmat: VvPp vvpp Sukusolut: VP, vp vp Jälkeläiset: VvPp, vvpp, VvPp, vvpp (1:1) Mikäli kaikki jälkeläiset kahdenlaisia (vanhempien kaltaisia), V ja P sijaitsevat samassa kromosomissa aivan vierekkäin (kytkentä on täydellinen, eikä geenien uudelleen yhdistyminen toteudu).

6 Vanhemmat: VvPp vvpp Sukusolut: VP, vp vp +Vp, vp Jälkeläiset: VvPp, vvpp, vvpp, Vvpp 40 %, 40 %, yht. max. 20 % Mikäli saadaan neljänlaisia jälkeläisiä, joista vanhempien fenotyyppiä merkittävästi yli 50 %, geenit sijaitsevat samassa kromosomissa etäällä toisistaan (kytkentä on löysä, ja syntyy hieman rekombinaatiotyyppejä)

7 Yhteenveto. Jos tarkasteltavat geenit ovat : 1. Eri kromosomeissa => jälkeläisiä neljänlaisia, 25 % kutakin fenotyyppiä. (2 p.) 2. Samassa kromosomissa etäällä toisistaan (löysä kytkentä) => neljänlaisia jälkeläisiä, joista risteytettävien kaltaisia yli 50 %. (2 p.) 3. Samassa kromosomissa aivan vierekkäin (täydellinen kytkentä) => jälkeläiset kahdenlaisia, vanhempien kaltaisia 1 : 1. (2 p.) Risteytyskaavioissa on ilmettävä: vanhemmat gameetteineen, jälkeläisten genotyypit sekä fenotyypit teoreettisine määräsuhteineen.

8 Geeninsiirron välineitä ja vektoreita

9 Etsitään ja kloonataan sopiva geeni sellaisesta kasvista, jonka kukkiin kehittyy sinistä pigmenttiä (esim. kissankello). Jos sinisen pigmentin synteesi vaatii useamman entsyymin yhteistoimintaa, täytyy kloonata kaksi tai useampiakin geenejä. Siirretään kloonattu geeni/geenit johonkin vektoriin, kuten Agrobacterium tumefaciens bakteerin plasmidiin, jossa on myös merkkigeeni tai antibioottiresistenssigeeni sekä sopiva säätelyalue (promoottori), joka osoittaa siirtogeenin ilmenemisen vain kukan solukoissa. Myös muita vektoreita (geeninkuljettimia) voidaan käyttää, esim. geenipyssy Infektoidaan neilikan versoja Agrobacteriumilla, jolloin kloonattu geeni siirtyy joihinkin kasvisoluihin. Valitaan siirtogeenistä kasvimateriaalista ne solut, jotka ovat ilmentävät sinisyyttä Tämä tapahtuu merkkigeenin tai antibioottiresistenssin avulla Kasvatetaan kasvimateriaalista oikeita sinikukallisia kasveja Tämä toteutuu, mikäli geenit ilmentyvät suunnitelmien mukaan

10 Selvitä vaihe vaiheelta, kuinka hämähäkin seittigeeni saadaan toimimaan bakteerissa. (YO S-06) Huom! Hämähäkki on aitotumallinen, bakteeri esitumallinen.

11 Seittigeenin käsittely ennen siirtoa: 1. Tuotetaan seittigeenistä lähetti-rna:n vastin-dna:ta (=introniton kaksijuosteinen cdna) Intronitonta DNA valmistetaan hämähäkin seittigeenin tuottamasta lähetti-rna:sta RNA-viruksista eristetyn käänteiskopioijaentsyyminavulla. Perustelu: Aitotumallisen geeni suoraan bakteeriin siirrettynä ei toimi, koska aitotumallisen geeneissä on introneita (jotka eivät sisällä tietoa geenin tuottaman proteiinin aminohappojärjestyksestä). Aitotumallisilla intronit silmukoituvat pois lähetti- RNA:sta. Intronittomissa bakteereissa ei ole silmukointimekanismia.

12 2. bakteereista eristetään plasmideja (DNA-renkaita) vektoreiksi 3. Plasmidit avataan katkaisu- (eli restriktio)entsyymillä samalla entsyymillä, jolla seittigeeni on irrotettu 4. Säätelyalue + introniton seittigeeni-yhdistelmä ja avattu plasmidi yhdistetään liittäjä- (eli ligaasi)entsyymillä yhdistelmäplasmidiksi 5. Isäntäbakteerin ottaa yhdistelmäplasmidin sisäänsä (transformaatio) 6. Kasvatusalustalla bakteerit lisääntyvät suvuttomasti kahtiajakautumalla nopeasti ja yhdistelmäplasmidin saaneet bakteerit siirtävät sen tytärsoluihin proteiinisynteesissä ne tuottaa hämähäkin seittiproteiinia 7. Seittiaines eristetään bakteerien elatusalustasta tai bakteerimassasta ja puhdistetaan

13 YO S-15:10 (Loistavat seeprakalat) GloFish-seeprakalat ovat siirtogeenisiä eliöitä, jotka on tuotettu yhdistelmä-dna- tekniikalla. Fluoresoivaa proteiinia koodaava geeni eristetään ja puhdistetaan kyseisestä meduusa- tai korallilajista. Geeni erotellaan elektroforeesissa muista geeneistä. Valittu geeni voidaan kloonata joko perinteisesti plasmidivektorissa bakteereissa tai monistamalla geeni alukkeiden avulla PCR -menetelmällä. Eristetyn geenin siirtäminen seeprakalaan voidaan tehdä vektorin avulla tai saattamalla geeniyhdistelmä (säätelyalue + geeni) mikroinjektiolla suoraan hedelmöittyneen munasolun tumaan. Vektori on käsitelty samoilla katkaisuentsyymeillä (eli restriktioentsyymeillä), joita käytettiin geenin eristämisessä, ja geeni liitetään vektoriin liittäjäentsyymin (eli ligaasientsyymin) avulla. Siirtogeenissä oleva säätelyalue saa aikaan geenin ilmenemisen lihassoluissa. Geenin tulee liittyä osaksi seeprakalan genomia. Kehittyvistä seeprakaloista valitaan ne yksilöt, joissa fenotyypin perusteella geenisiirto oli onnistunut. Genomiin siirtynyt uusi geeni siirtyy näiden kalojen jälkeläisille.