LAPPEENRANNAN TEKNILLINEN YLIOPITO TYÖOHJE 2009 Keianteniian osasto Tenillisen eian laboratorio BJ90A0900 Tenillisen eian ja tenillisen polyeerieian laboratoriotyöt Ohje: Irina Turu, Katriina Liiatainen, Kio Kleola AKKAROOIN ENTYMAATTINEN HYDROLYYI Työn taroitus Disaaridien glyosidiset sidoset voidaan hydrolysoida happoatalyytin avulla tai entsyaattisesti. Invertaasientsyyi hydrolysoi seletiivisesti -D-frutosideja. aaroosilla (4-O-( -D-gluopyranosyyli)- -D-frutofuranoosi) () hydrolyysituotteina ovat D-gluoosi (G) ja D-frutoosi (F) (yhtälö (1)). invertaasi (1) G F Entsyyit voivat olla reatioseosessa liuenneina tai ne on sidottu liueneattoaan antajaan. Moleissa tapausissa reatio tapahtuu entsyyin atiivisessa esusessa. Työssä tutitaan saaroosin hydrolyysiä invertaasientsyyillä äyttäen panos- ja iintopetireatoria. Invertaasi sidotaan heioon anioninvaihtohartsiin. Reation 1 ineettiset paraetrit ääritetään differentiaalienetelällä panosoeiden tulosista. Jatuvatoiisella iintopetireatorilla saatuja ittaustulosia verrataan näiden paraetrien avulla lasettuihin arvoihin.
Mittausenetelät 2 1. Katalyytin valistus Kaupallinen invertaasi sidotaan ionisesti anioninvaihtohartsin pintaan. idonta tehdään ph:ssa 6, jossa invertaasiproteiini on negatiivisesti varautunut ja antajan pinnalla olevat ryhät puolestaan ovat positiivisesti varautuneet. Näin uodostuvat sähöstaattiset "sidoset" iinnittävät entsyyin antajaan. Vesipitoinen antaja (n. 50 g) seoitetaan 100 L:aan invertaasiliuosta, ja seosta pidetään 45 C:ssa 2 h oo ajan hitaasti seoittaen. Kantajan tilavuus itataan ennen seoitusta. Invertaasiliuosessa on 50 L aluperäistä entsyyiliuosta ja 50 L ionivaihdettua vettä. Liuosen ph säädetään arvoon 6. Entsyyin sidonnan jäleen liuosfaasista otetaan 10 L näyte atiivisuusääritystä varten. Näytteen ja aluperäisen entsyyiliuosen atiivisuudet itataan ohdan 2 uaan. Lopusi sidottu entsyyi pestään ionivaihdetulla vedellä ja sitä säilytetään äränä jääaapissa. 2. Entsyyiatiivisuuden ittaus Ysi uner-ysiö (U) taroittaa sitä invertaasiäärää, joa tuottaa 1 g inverttisoeria (gluoosin ja frutoosin eviolaarinen seos) 5 inuutin aiana standardiolosuhteissa. Mittausolosuhteet: T 25 o C; ph 4,5; saaroosipitoisuus 6,5 p-%. Aluperäisestä entsyyiliuosesta tehdään 0,01 M asetaattipusuriin 1/10000 ja 1/20000 laiennoset. idonnan jäleinen näyte laiennetaan suhteissa 1/20, 1/200. Lisäsi valistetaan saaroosi- ja gluoosiliuoset seuraavasti: - 6,500 g saaroosia (pa-laatu)/ 100 L 0,01 M asetaattipusuria - 1,500 g D-gluoosia /100 L 0,01 M asetaattipusuria. Mittauset tehdään 10 L oeputissa vesihauteessa, joa on terostoitu 25 C:een. Kustain neljästä entsyyilaiennosesta otetaan 0,5 L oeputeen. Lisäsi yhteen oeputeen laitetaan 0,1 L gluoosiliuosta + 0,4 L vettä ja yhteen pelästään 0,5 L vettä. Näytteitä ja saaroosiliuosta terostoidaan uutaa inuutti ennen reation äynnistäistä. Mittaus aloitetaan lisääällä uhunin oeputeen 2,5 L saaroosiliuosta. Lisäyset tehdään esi. 30 s välein ja joaisessa oeputessa reation annetaan jatua tasan 30 in (ts. lisäys ensiäiseen oeputeen ajanhetellä t 0, toiseen ajanhetellä t 30 s, jne..). Reatio pysäytetään lisääällä oeputiin 7,0 L värjäysreagenssia ja oeputia pidetään tasan 10 in iehuvassa vesihauteessa. Kustain putesta otetaan jäähdytysen jäleen 2,0 L näyte ja siihen lisätään 8,0 L vettä. Lopusi itataan laiennosen absorbanssi aallonpituudella 515 n. Kullein entsyyinäytteelle tehdään lisäsi nollaoe. Näytteeseen (0,5 L) lisätään ensin värjäysreagenssi ja sitten vasta saaroosiliuos. Muuten nollanäytteet äsitellään uten edellä. Entsyyiliuosen atiivisuus R sol ysiöissä U/ 3 saadaan yhtälöstä (2). R sol 0,5 A A Näyte gluoosi - A - A Nollanäyte H 2 o laiennuserroin Laiennuserroin on lopputilavuuden suhde aluperäisen entsyyiliuosen tilavuuteen (10000, 20000, 20 tai 200) ja A taroittaa absorbanssia. (2)
3 3. Reatioittauset Panosreatori Panosoeet tehdään terostoidussa 1 d 3 pyöröolvissa, jossa on hyvä seoitus. Alusi tutitaan reationopeuden riippuvuutta atalyytin äärästä. Mittauset tehdään läpötilassa 35 C ja sidotun entsyyin äärät ovat 2, 5 ja 10 g. Lisäsi itataan reationopeus 25 C:ssa ja 45 C:ssa äyttäen esierisi 5 g entsyyiä. Kaiissa panosoeissa saaroosin aluonsentraatio on 0,5 ol/d 3 ja liuosäärä on 500 L. aaroosi liuotetaan 0,005 M asetaattipusuriin ja ph:si säädetään 5. Reatio äynnistetään lisääällä atalyytti terostoituun soeriliuoseen. Näytteitä, joiden tilavuus on 10 L, otetaan alussa 5-10 in välein, lopussa selvästi harvein. Näytettä otettaessa pysäytetään seoitus. Näyteliuos jäähdytetään huoneen läpötilaan ja se analysoidaan ohdan 4 uaan. Mittausen jäleen liuos palautetaan reatoriin. Reatiota jatetaan, unnes saaroosin onversio on 80-90 % ja tasaantunut sille tasolle eli näytteenottoa jatetaan niin auan, että iertoula pysyy suunnilleen saana. Kiintopetireatori Kiintopetireatori tehdään paaaalla 10 g sidottua entsyyiä Pharasian Bioteh XK16-olonniin, jona jäleen yläpää suljetaan. Katalyyttierrosen läpötilasi säädetään 35 C vaipan vesiierron avulla. Katalyyttierros ei saa uivua ittausen aiana. 0,5 M saaroosiliuos syötetään reatoriin 5-30 3 /in tilavuusvirtausnopeudella. Ulostuloonversio itataan äyttäen 3-4 eri virtausnopeutta ja liuosoostuus analysoidaan saoin uin panosoeissa. 4. Reatioseosen analysointi Näytteen saaroosionversio analysoidaan polarietrisesti, ts. ittaaalla näyteliuosen optinen iertoyy. Jäähdytetty näyte siirretään polarietriputeen (pituus 100 ) ja iertoula itataan laitteen äyttöohjeen uaisesti. aaroosionversion X ja itatun iertoulan [ o ] välinen riippuvuus on uotoa X M G 100 α - M [ α ] 0, l [ α ] + M F[ α ] - M [ α ] G F (3) aaroosin aluonsentraatio 0, [ol/d 3 ] lasetaan reagoiattoan soeriliuosen iertoulasta. M i ja [ ] i ovat oponentin i ooliassa [g/ol] ja oinaisiertoula [ o ] ja l on polarietriputen pituus etreinä. [ ] +66,5 o, [ ] G + 52,7 o ja [ ] F -93,0 o. M s 360,32 g/ol, M f 180,16 g/ol, M g 180,16 g/ol.
4 Tulosten äsittely 1. Reatioalli ja reatorialli Reation ajatellaan tapahtuvan ahdessa vaiheessa: 1) saaroosi sitoutuu entsyyin atiiviseen ohtaan /-E (yhtälö 4) 2) sitoutunut saaroosi /-E hydrolysoituu gluoosisi G ja frutoosisi F (yhtälö 5) /-E + 1-1 /-E (4) 2 / - E / - E + G + F (5) Olettaen, että reatio 5 on hydrolyysinopeutta ontrolloiva vaihe ja että ainoastaan saaroosi pystyy sitoutuaan entsyyiin, saadaan hydrolyysinopeudelle r h Mihaelis-Menten-tyyppinen yhtälö (6). r d - t K V h 2 d + (6) Yhtälössä (6) V on /V R, ja V R on reatorin nestetilavuus, on atalyytin assa, on saaroosin 1+ 2 onsentraatio, 2 on reation (5) nopeusvaio ja K on Mihaelis-Mentenin vaio. 1 Reationopeusyhtälö (6) on johdettu liitteessä 1. Differentiaalienetelässä ittaustulosista lasetaan derivaatan d /dt arvot eri ajanhetillä ja niiden avulla ääritetään yhtälön (6) vaiot 2 ja K. Tätä varten nopeusyhtälö irjoitetaan seuraavaan linearisoituun uotoon. 1 d 1 K + dt 2 V 2 V (7) Jos iintopetireatori toiii isoterisesti ja jos virtaus atalyyttierrosessa on tulppavirtausta, reation ainetase voidaan irjoittaa uotoon (tulee tulppavirtausreatorin PFR ainetaseesta): d dv r V & (8) Yhtälössä (8) r s on saaroosin hajoaisnopeus. toiioetrian uaan r s -r h. V & on tilavuusvirtausnopeus ja V on putireatorin tilavuus.
5 2. Mittaustulosten äsittely Atiivisuusittausten tulosista lasetaan aluperäisen invertaasiliuosen ja antajaan sidotun invertaasin atiivisuudet ysiöissä U/ 3 ja U/g. idotun entsyyin atiivisuus R i lasetaan yhtälöstä 9. R i V sol antaja ( R 0,sol R 4,sol ) (9) V sol on sidontaliuosen tilavuus (100 3 ) antaja on antajan assa (50 g). R 0,sol ja R 4,sol ovat atiivisuudet liuosessa ennen sidontaa ja sidonnan jäleen. Panosoeiden tuloset esitetään saaroosin onsentraation riippuvuutena reatioajasta ja (d /dt)- arvot lasetaan derivoialla ittauspisteiden autta sovitetun äyrän yhtälö (esi. toisen asteen polynoifuntio > derivoinnin jäleen suora). Konsentraatiot piirretään esierisi Exelillä ajan funtiona ja äyrään sovitetaan polynoi (Add trendline). Polynoi derivoidaan ja näin saadaan utain ittapistettä vastaavat d dt 1 -pisteet (huo. derivaattapisteistä otetaan äänteisluu). Vaiot 2 ja 1 d K saadaan tään jäleen suoran (7) f(1/ ) ulaertoiesta ja leiauspisteestä. Eri dt läpötiloissa itatuista nopeusvaioista lasetaan reation (5) ativoituisenergia E a Arrheniusen yhtälöstä (10). 2 0exp - E a (T) RT (10) Yhtälössä (10) 0 on frevenssiteijä, joa on läpötilasta riippuaton vaio, R on aasuvaio ja T on absoluuttinen läpötila (Kelvin). Vertaa saatua ativoituisenergiaa viitteessä [1] annettuun arvoon 9 al/ol. Yhtälö (10) saadaan linearisoidusi ottaalla yhtälön oleilta puolilta luonnollinen logariti. Tällöin saadaan ln( 2 ) 1/T:n funtiona (suora), jona ulaertoiesta ja leiauspisteestä saadaan E a ja o. Lisäsi tutitaan, riippuuo nopeusvaio 2 atalyytin äärästä. Kiintopetireatorin tuloset esitetään ulostuloonversion riippuvuutena syöttönopeudesta. Panosoeista ääritettyjä vaioita äytetään yhtälössä (8) lasettaessa ulostuloonversiota (Polyath, Matlab ). Esitä ittauspisteet ja lasettu riippuvuus saassa uvassa. Konversio ääritellään reagoineen saaroosin äärän suhteena aluperäiseen saaroosin äärään: X 0, 0, (11) aaroosin onsentraatio eri ajanhetinä saadaan lasettua, un onversio tiedetään, yhtälöstä (11).
6 Kirjallisuusviitteet 1. Bell, J.A. (toi.), Cheial Priniples in Pratie, Addison-Wesley, Reading, 1967. s. 194.
7 Liite 1 Reationopeusyhtälön (6) johtainen Oletetaan, että reatio (4) on paljon nopeapi uin reatio (5): Reatio (4) on nopea ja enee tasapainoon saaa. 1 E 1E 0 > 1 1 E E K Reatio (5) äärää hitaana oo hydrolysoituisnopeuden. r h 2 E Jotta reationopeusyhtälö saataisiin ääritellysi, täytyy E :lle saada äytännöllinen uoto. Käytetään stationääritilaoletusta, jona uaan entsyyiin sitoutuneen saaroosin äärä pysyy uuttuattoana (entsyyiin sitoutuu saaroosia saalla nopeudella uin entsyyistä lähtee tuotteita). d dt E 1 E 1 E 2 E 0 Entsyyi on joo vapaana tai siihen on sitoutuneena saaroosi. 0,E E + E > E 0, E E Edellä olevista saadaan E rataistusi. E 1 0, E + + 1 1 2 Jaetaan edellinen 1 :llä. E 0, E + + 1 2 1
8 Mihaelis-Mentenin vaio on K 1+ 2 1 aadaan yhtälö: E 0,E + K ijoitetaan E reationopeusyhtälöön. r 0, E h 2 + K Kosa atalyytin assa liuostilavuutta ohti on suoraan verrannollinen 0,E :hen, voidaan 0,E orvata V :llä ( /V R ). aadaan Mihaelis-Menten -tyyppinen reationopeusyhtälö. r V h 2 K +
9 Tenillisen eian laboratoriotyöt Mittauspöytäirja Teijät: Päivääärä: AKKAROOIN ENTYMAATTINEN HYDROLYYI 1. Entsyyin sitoinen hartsiin Entsyyi: T Kantaja: ph t o C in idontaliuosen tilavuus, V sol Kantajan assa, antaja l g Näyte Absorbanssi R sol R 0,sol (U/ 3 ) R 4,sol (U/ 3 ) R i (U/g) vesi gluoosi 1:10000 1:20000 1:20 1:200 1:10000* 1:20000* 1:20* 1:200* R sol 0.5 * ((A näyte - A nollanäyte) / (A gluoosi - A vesi )) * laiennuserroin R 0,sol atiivisuus liuosessa ennen sidontaa (1:10000 + 1:20000) / 2 R 4,sol atiivisuus sidonnan jäleen (1:20 + 1:200) / 2 R i V sol / antaja * (R 0,sol - R 4,sol ) laiennuserroin: 20, 200, 10000 tai 20000
10 Tenillisen eian laboratoriotyöt Mittauspöytäirja Teijät: Päivääärä: AKKAROOIN ENTYMAATTINEN HYDROLYYI 0, ol/l 2. aaroosin hydrolyysi panosoeena V L T o C T o C T antaja g antaja g antaja g o C t, in iertoula, o X, - t, in iertoula, o X, - t, in iertoula, o X, -
11 Tenillisen eian laboratoriotyöt Mittauspöytäirja Teijät: Päivääärä: AKKAROOIN ENTYMAATTINEN HYDROLYYI 3. aaroosin hydrolyysi panosoeena ja iintopetireatorissa Kiintopetioe: T o C T o C T antaja g antaja g antaja g o C t, in iertoula, o X, - t, in iertoula, o X, - V, L/in iertoula, o X, -