Kokogenomityypitys uusi työkalu tartunnanjäljitykseen. Tartuntatautikurssi Laura Lindholm

Transkriptio

1 Kokogenomityypitys uusi työkalu tartunnanjäljitykseen Tartuntatautikurssi Laura Lindholm

2 MRSA MRSA = Metisilliiniresistentti Staphylococcus aureus Resistentti lähes kaikille beetalaktaameille meca /mecc -geeni bakteerin kromosomissa Bakteerin seinämän penisilliiniä sitovan proteiinin muutos Osa kannoista lisäksi moniresistenttejä Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 2

3 Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 3

4 MRSA (Methicillin resistant S.aureus) muuntunut S.aureus MecA geeni sijaitsee siirtyvässä geneettisessä elementissä Staphylococcal cassette cromosome SCCmec, joka sisältää geenien horisontaaliseen siirtoon tarvittavat entsyymit meca geeni voi siirtyä horisontaalisesti kannasta toiseen. SCCmec-kasetit sisältävät mecageenin lisäksi insertioalueet, meca:n tuotantoa sääteleviä geenejä sekä vähintään yhden rekombinaasia koodaavan ccr-geenin. MecA geeni koodaa muuntunutta peptidoglykaanisynteesin entsyymiä (PBP2'/PBP2a), jolla on matala affiniteetti beetalaktaameille. Foster T. J Clin Invest 2004;114: Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 4

5 Staphylococcal casette chromosome mec SCCmec tyypitys IWG-SCC = International Working Group on the Staphylococcal Cassette Chromosome elements SCCmec-kasetit voidaan tyypittää ccr ja mec geenien perusteella SCCmec-tyyppi määräytyy näiden yhdistelmän mukaan. 29,4 kb Mec complex E: meci-mecr1-mecc-blaz, ccra1ccrb3, novel type 8 ccr Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 5

6 MRSA seuranta Suomessa THL ylläpitää valtakunnallista tartuntatautirekisteriä (TTR) Tartuntatautilakiin ja -asetukseen perustuen. TTR:iin ilmoitetaan kaikki uudet MRSA-tapaukset (1995 ) MRSA kannat talletetaan kansalliseen mikrobikantakokoelmaan MRSA referenssilaboratoriossa meca varmistus ( ), Molekylaarinen tyypitys (1992 ) Vuodesta 2009 pääasiallinen tyypitysmenetelmä on ollut spatyypitys Kaikki kannat tyypitetään Lisätyypityksiä tarpeen mukaan tai pyydettäessä (PFGE, MLST, PVL, mecc varmistus, SCCmec) Epidemiaselvityksissä PFGE Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 6

7 MRSA seuranta Suomessa 2015 Kaikkien uusien MRSA-tapausten kannat lähetetään THL:n kantakokoelmaan Verestä ja selkäydinnesteestä eristetyt MRSA-kannat lähetetään aina THL:n kantakokoelmaan Kaikille kannoille tehdään spa-tyypitys WGS (Whole Genome Sequencing) Veri ja likvorkannat Epidemiaselvitykset Erityiskysymyksenasettelut Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 7

8 THL.FI - AIHEET- INFEKTIOTAUDIT- LABORATORIOTOIMINTA - LABORATORIO TUTKIMUKSET - MRSA MRSA Metisilliiniresistentti Staphylococcus aureus eli MRSA THL tutkii kaikkien uusien MRSA-tapausten MRSA-kannat. Epidemioihin, vakavaan taudinkuvaan tai relapsiepäilyihin liittyviä kantoja voidaan erikseen tutkia pyynnöstä. Tautiluokka: Muu ilmoitettava mikrobilöydös Kantakokoelma: Metisilliinille tai oksasilliinille resistentit kannat sisältyvät tartuntatautirekisterin kantakokoelmaan Lähetettävät kannat: Verestä ja selkäydinnesteestä eristetyt kannat. Muista kliinisistä näytteistä eristetyt uudet MRSA-kannat. Epidemiaepäilyn yhteydessä kerätyt kannat. Laboratoriotutkimukset Spa-tyypitys (ensisijainen tyypitysmenetelmä, tehdään kaikille kannoille) Erityistilanteissa (epidemiat, vakavat infektiot) kokogenomin sekvensointiin perustuva tyypitys Alentuneen vankomysiiniherkkyyden varmistaminen mikrodiluutiomenetelmällä Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 8

9 Herkkyysmääritys: Mikrodiluutiomenetelmä (ISO standardi, EUCAST referenssimenetelmä) Veri- ja likvorkannat Glykopeptidiherkkyydeltään alentuneet kannat Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 9

10 MRSA-löydökset ja niiden osuus veren S. aureus löydöksistä , lkm ja % Lähde:Tartuntatautirekisteri Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 10

11 Spa-tyypitys Spa-tyypityksessä sekvensoidaan S. aureus -bakteerille spesifisen proteiini A:n polymorfista X-aluetta. a S E D A B C Xr Xc Signaalisekvenssi IgG sitoutuminen b r26 r23 r17 r34 r17 r20 r17 r12 r17 Toistojaksojen määrä vaihtelee (1-25) c AAAGAAGACGGCAACAAGCCTGG Toistojakso yleensä 21-24bp Spa-tyyppi: t067 Spa-toistojakso: Spa-tyypin perusteella MRSAkantoja voidaan vertailla kansainvälisesti Väitöskirja Anni Vainio, HY Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 11

12 Multi Locus Sequence Typing (MLST) MLST:n periaate Valitaan sopivat geenit edustamaan bakteeria S.aureus: arc, aro, glp, gmk, pta, tpi, yqi E.coli: adk, fumc, gyrb, icd, mdh, pura, reca Joskus voi olla eri geenejä käyttäviä rinnakkaisia menetelmiä ei voida vertailla tuloksia Sekvensoidaan geenit Verrataan tietokantoihin MLST-tyyppi kertoo kuuluuko isolaatti johonkin tiettyyn kansainvälisesti menestyneeseen klooniin Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 12

13 MLST arc yqil tpi S. aureus 2,8 Mb aro glp pta gmk ST125 arcc aroe glpf gmk_ pta_ tpi_ yqil Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 13

14 BURP (Based Upon Repeat Pattern) analyysi Spa Spa-tostojakso t t t t t t t t t t t t t t Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 14

15 PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) PFGE: Koko bakteerin genomi EI sekvensoida Genomisen DNA:n digestio Pulssikenttäelektroforeesi Värjäys Kuvantaminen vertailu tulkinta Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 15

16 Kokogenomisekvensointi Entistä tarkempi työkalu tartunnanjäljitykseen

17 Käsitteet NGS = Next Generation Sequencing Uuden sukupolven sekvensointitekniikat WGS = Whole Genome Sequencing Kokogenomisekvensointi C C A A T G C Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 17

18 Kokogenomisekvensointi Bakteerikanta DNA, kirjasto Sekvensointi Sekvenssin kokoaminen (de novo tai referenssi) MLST, SPA cgmlst Mikrobilääkeresistenssi Antigeenit, serotyypit Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 18

19 Kokogenomisekvensointiajon käynnistäminen Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 19

20 Lyhyet sekvenssit, readit MiSeq: 2x150 sekvensointikasetti: emästä: ka 135 emästä >1 miljoona readia, 139 miljoonaa emästä / ajo / näyte 2x 250 sekvensointikasetti: emästä, ka 230 emästä 1,7 miljoonaa readia, 390 miljoonaa emästä / ajo / näyte Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 20

21 Lyhyet sekvenssit yhdistellään = koonti (assembly) Contig 1 Contig 2 Con.3 Con.4 Contig 5 Contig 6 read Draft genome = con 1 + con 2 + con 3 + con 4 + con 5 + con 6 Draft genome koko genomi (osia genomista puuttuu lähes aina) Referenssi genomi Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 21

22 Lyhyet sekvenssit yhdistellään = koonti (assembly) Contig 1 Contig 2 Con.3 Con.4 Contig 5 Contig 6 read Lisäksi sekvensoinnissa syntyy sekvenssejä, joita ei saada yhdisteltyä eli ne jäävät kokonaan pois koonnin aikana. Saattavat sisältää tärkeää informaatiota Toisaalta saattavat sisältää kontaminoivan DNA:n sekvenssejä. Draft genome voi sisältää myös sekvenssiä, joita ei ole referenssigenomissa esim. plasmidit Referenssi genomi Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 22

23 core genome MLST cgmlst MLST arc arc yqil yqil aro aro tpi S. aureus 2,8 Mb tpi S. aureus 2,8 Mb glp glp pta gmk pta gmk 1823 kohdegeeniä 7 kohdegeeniä Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 23

24 WGS datasta saatava informaatio Spa-tyyppi Lajitunnistus Virulenssitekijät Antitioottiresistenssiprofiili J Clin Microbiol Jul; 52(7): Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 24

25 Kokogenomisekvensointi (WGS) hyödyntäminen molekyyliepidemiologiassa Genomisekvenssi Lajimääritys Genotyyppi MLST, Spa Yksittäiset mutaatiot, Single-nucleotide polymorphism (SNP) Genomin koko informaatio saadaan käyttöön Resistenssitekijäprofiili (~ herkkyysprofiili) Lääkeresistenssiä aiheuttavat mutaatiot Genomin koko informaatio saadaan käyttöön. Esim. S.aureus MLST hyödyntää 3186 emäksen sisältämän informaation WGS hyödyntää 2,9 miljoonan emäksen sisältämän informaation Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 25

26 Bakteerien tyypittäminen, epidemiologinen seuranta ja ryvästymät epidemiaselvitykset MLST Spa Emm spoligo E-testi Kiekko Liemi Malja PFGE MIRU- VNTR Potilastiedot Seurantatieto Epidemioiden havaitseminen spa types of all MRSA isolates Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 26

27 Bakteerien tyypittäminen, epidemiologinen seuranta ja ryvästymät NGS/WGS Epidemiaselvitykset Epidemioiden havaitseminen Potilastiedot Seuranta Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 27

28 Bakteerien tyypittäminen, epidemiologinen seuranta ja ryvästymät Bakteeri Seuranta Epidemiat Herkkyysmääritys MRSA Spa-tyypitys WGS Ei CPE WGS WGS Ei VRE WGS WGS Ei S. pneumoniae WGS Harvinaisia/WGS - S. pyogenes Emm-tyypitys Harvinaisia/WGS Ei C. difficile Ribotyypitys WGS Ei Salmonella Serotyypitys WGS Kiekkoherkkyys Listeria WGS WGS Ei EHEC WGS WGS Ei M.tuberculosis Spoligo/WGS? WGS MGIT/WGS N. meningitidis Serotyypitys, WGS WGS Ei Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 28

29 Esimerkkejä epidemiaselvityksistä Tartuntatautikurssi Laura Lindholm

30 WGS:n perustuva cgmlst-sukulaisuusanalyysi Vertailussa 1828 geenin sisältämä informaatio (n. 2milj.emästä) Spa t127, ST1 Spa t002, ST5 x2 x2 Spa t172, ST Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 30

31 x2 x2 Spa t Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 31

32 Spa t002, pvl+ Spa t008, pvl- Spa t008, t024 pvl+ Spa t032 t t Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 32

33 Spa t172, ST375, pvl neg Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 33

34 x2 Spa t172, ST375, pvl neg Eri paikkakunnat 1/2016 Vanhainkoti 6/2016 avovastaanottopisteet Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 34

35 Spa t067, ST125 Klusteri A Vertailussa 1738 geenin sisältämä informaatio (n. 2milj.emästä) MRSA-kantojen erottelu ei onnistuisi PFGE:n eikä perinteisten spa- ja MLST tyypitysten avulla. Kannat samaa spa-tyyppiä (t067) ja samaa sekvenssityyppiä (ST125) Klusteri B Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 35

36 Spa t067 (FIN-16) FIN-name spa Resistance SCCmec MLST ST CC PVL FIN-16 t067 OxaMIC >256, Tob, Ery, Cip, Clin IA 125 ( 5slv ) 5 neg Klusteri A resistenssiprofiili Resistance gene Phenotype meca Beta-lactam resistance aadd Aminoglycoside resistance nora Fluoroquinolone resistance Klusteri B resistenssiprofiili Resistance gene Phenotype meca Beta-lactam resistance nora Fluoroquinolone resistance aadd Aminoglycoside resistance blaz Beta-lactam resistance mph(c) Macrolide resistance msr(a) Macrolide, Lincosamide and Streptogramin B resistance Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 36

37 Virulenssiprofiili hlb beta-hemolysin hlga haemolysin gamma, component A hlgb haemolysin gamma, component A hlgc haemolysin gamma, component c tst toxic shock syndrome toxin 1 luked leukocidins lukfs-pv leukocidins eta exfoliative toxin serotype A etb exfoliative toxin serotype B edinabc epidermal cell differentiation inhibitor aur aureolysin splabe seriiniproteases scn staphylococcal complement inhibitor sak staphylokinase ACME Arginine Catabolic Mobile Element enterotoxins A-E, G-O, R, U, Q Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 37

38 Rypäiden havaitseminen Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 38

39 Yhteenveto WGS tulee / jo merkittävästi muuttanut mikrobilääkeresistenssin seurantaa Moniresistentit bakteerit Seurantatieto Rypäiden havaitseminen ja epidemiaselvitykset Resistensssigeeniprofiilit Herkkyysmääritykset Virulenssitieto leviämiskyky, patogeenisuus Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 39

40 Kiitos! Tartuntatautikurssi 2017 / Laura Lindholm 40