( B ) ( 1 1 ) KUUTJUTUSJULKA I SU UTLAGGN I NG S S KR I FT. (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 C 12N 5/18, A 61K 39/395

Transkriptio

1 ( B ) ( 1 1 ) KUUTJUTUSJULKA I SU UTLAGGN I NG S S KR I FT C ), (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 C 12N 5/18, A 61K 39/395 (21) Patenttihakemus - Patentansökning SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P (71) Hakija - Sökande 1. American Cyanamid Company, Wayne, N.J., USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Schenkel, Robert Harris, 355 Robin Hood Drive, Yardley, Pa., USA, (US) 2. Wong, Rosie Bick-Har, 16 Ross Hall Boulevard, Piscataway, N.J., USA, (US) 3. Thammana, Pallaiah, 8 Village Green Way, Hazlet, N.J., USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Oy Kolster Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä Eimeria spp.-itiöiden ja merotsoiittien vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ja menetelmä anti geenikoostumuksen valmistamiseksi Förfarande för framställning av monoklonala antikroppar mot Eimeria spp.-sporozoiter och merozoiter och förfarande för framställning av en antigen komposition (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer Journal of Parasitology, vol. 68, 1982, p , Poultry Science, vol. 60, nro 7, 1981, Abstracts of Papers, p (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksintö koskee Eimeria tenella'n merotsoiitteja ja itiöitä vastustavia monoklonaalisia vasta-aineita, joita valmistetaan käyttämällä hybridoomatekniikkaa. Keksintö koskee myös spesifisiä antigeenejä käytettäväksi rokotteina kokkidioosin ennaltaehkäisyssä ja hoidossa ja mnoklanaalisia vasta-aineita tuottavia hybridoomaviljelmiä. Uppfinningen hänför sig till monoklonala antikroppar mot merozoiter och sporozoiter av Eimeria tenella, vilka antikroppar framställs genom hybridomateknik. Uppfinningen hänför sig även till specifika antigener för användning som vaccin vid förebyggande och behandling av coccidiosis och till hybridomakulturer, vilka producerar monoklonala antikroppar.

2 Menetelmä Eimeria spp.-itiöiden ja merotsoiittien vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ja menetelmä antigeenikoostumuksen valmistamiseksi 5 Keksintö koskee menetelmää monoklonaalisten vastaaineiden valmistamiseksi, jotka reagoivat Eimeria spp.- itiöiden tai merotsoiittien antigeenien kanssa. Nämä monoklonaaliset vasta-aineet reagoivat spesifisesti Eimeria tenella'n itiöitä ja merotsoiittejä vas- 10 taan. Kyseisiä vasta-aineita saadaan hybridoomatekniikalla. Esitetään hybridooma-viljelmiä, jotka tuottavat vastaaineita E. tenella'a vastaan. Merosoiitti-antigeenit identifioidaan ja karakterisoidaan. Keksintö koskee myös menetelmää antigeenisen, immu- 15 nogeenisen ja proteiinipitoisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on liukoinen detergenttiä sisältävään puskuriliuokseen, ja joka on Eimeria tenella'n merotsoiittien antigeeninä, ja joka on spesifisesti reaktiivinen merotsoiittivastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa. 20 Kyseiset antigeenit ja tietyt monoklonaaliset vasta-aineet ovat tehokkaita kokkidioosin ennaltaehkäisyssä ja hoidossa. Antigeenit ovat hyödyllisiä rokotteina kokkidioosia vastaan. Taustatietona mainittakoon, että kokkidioosi on 25 alkueläimissä esiintyvä sairaus, jonka aiheuttaa joukko alkueläinparasiitteja. Linnuissa esiintyvä kokkidioosi on tuhoisa siipikarjan tauti, jonka aiheuttaa joukko Eimerialajeja. Kyseisellä taudilla on monimutkainen elinkierto, joka koostuu sekä suvuttomista että suvullisista vaiheis- 30 ta. Kanat saavat alunperin tartunnan tautiin nieltyään vapaana eläviä munarakkuloita, joita yleensä esiintyy ulosteissa. Munarakkulat kehittyvät tauteja levittäviksi suvuttomiksi itiöiksi kanan ruoansulatuskanavassa. Itiöt tartuttavat epiteelisoluja ja kehittyvät monitumaisiksi 35 rakenteiksi, jotka tunnetaan halkioina. Jokainen halkio

3 2 kehittyy ja lopulta vapauttaa useita tauteja levittäviä suvuttomia rakenteita, jotka tunnetaan merotsoiitteinä. Kyseiset merotsoiitit poistuvat tartunnan saaneista soluista ja tartuttavat muita epiteelisoluja. Itiöihin ja 5 merotsoiitteihin liittyvät useat tauteja levittävät suvuttomat vaiheet muodostavat suurelta osin kokkidioosin patologian. Kokkidioosin suvullinen kierto alkaa, kun merotsoiitit erottuvat gametosyyteiksi. Hedelmöittyminen tapahtuu ja hedelmöittymistuotteet, jotka tunnetaan munarakkuloina, 10 vapautuvat ulosteisiin. Tällöin parasiitin elinkierto päättyy. Tyypillisen Eimeria tenella'n elinkierto kanoissa päättyy noin 7:ssä - 9:ssä päivässä. Eimeria-lajien takia koituvien valtavien taloudellisten tappioiden johdosta siipikarjateollisuudelle, roko- 15 te parasiittia vastaan on erittäin toivottava. Kuitenkin parasiitin elinkierron monimutkaisuudesta ja jokaisessa elinvaiheessa olevien useiden antigeenien lukumäärän vaihtelevuudesta johtuen, on huomattu, että heikennetyt tai tapetut parasiitit eivät ole saaneet aikaan pysyvää immu- 20 niteettiä. Eräs ratkaisu kyseiseen ongelmaan on eristää ja tunnistaa tietyt antigeenit parasiitistä ja antaa niitä riittävässä määrin, jotta ne voivat toimia immunisoivina aineina. Edullisesti kyseiset antigeenit suojaavat kaikkien tärkeiden lajien tartunnoilta. 25 On tunnettua, että useilla Eimeria-lajeilla sekä saman lajin elinkierron eri vaiheilla on sekä yhteisiä että spesifisiä antigeenejä [Z. Cerna: Folia Parasitologica (Praha), 17 (1970), ss ; Davis et al.: Immunol. 34 (1978), ss ; M. E. Rose: Immunol (1959), ss ; Rose et al.: Immunol. 5 (1962), ss ; ja Tanelian et al.: Acta parasitol. Yogosl. 7 (1976), ss ]. On myös tunnettua, että immuniteetin kehittyminen Eimeria'a vastaan on lajikohtaista; joillakin siipikarjan 35 lajeilla esiintyy huomattavaa kantakohtaista immuniteettiä

4 [T. K. Jeffers, julkaisussa P. L. Long et al. (toim.): Avian Coccidiosis, ss ; Proc. 13th Poultry Sci. Symp. (1978); L. P. Joyner: Parasitol. 59 (1969), ss ; P. L. Long: Parasitol. 69 (1974), ss ; ja Long et al.: Parasitol. 79 (1979), ss ]. Tällä hetkellä Eimeria-lajin immunogeenejä, jotka voisivat synnyttää suojaavaa immuniteettiä linnuissa tai nisäkkäissä, ei vielä ole eristetty tai identifioitu. Ky- 10 seisillä Eimeria-immunogeeneillä saadaan todennäköisesti aikaan onnistunut immunisointi kokkidioosia vastaan. Lymfosyyttihybridoomatekniikan kehittyminen tarjoaa keinon, jolla voidaan tuottaa suhteellisen suuria määriä spesifisiä vasta-aineita lukuisia Eimeria-antigee- 15 nejä vastaan. Fuusioimalla spesifiset vasta-ainetta tuottavat solut (pernasolut) myeloomakasvaimesta saatuihin soluihin, on mandollista valmistaa hybridoomasoluja, jotka erittävät monoklonaalisia vasta-aineita, jotka spesifisesti kohdistuvat alkuperäistä herkistävää antigeeniä vas- 20 taan [Köhler & Milstein: Nature (Lontoo) 256 (1975), ss ]. Jos saadaan parasiitin vastaisia vasta-aineita, voi olla mandollista siirtää kyseiset vasta-aineet tartunnan saaneeseen tai altistuneeseen siipikarjaan ja täten ai- 25 kaansaada isäntäorganismille määrätty passiivinen immuniteetti. Kun monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia hybridoomaviljelmiä on saatu, on mandollista eri menetelmillä käyttää kyseisiä vasta-aineita spesifisten antigeenien eristämiseksi ja identifioimiseksi, joita antigeenejä puo- 30 lestaan voitaisiin käyttää rokotteena, jotta isäntäorganismille saataisiin aktiivinen immuniteetti. Tunnetaan lukuisia hybridoomaviljelmiin ja monoklonaalisiin vasta-aineisiin liittyviä patenttijulkaisuja (ts. US-patenttijulkaisut ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ja ).

5 Edellä esitetyn valossa kokkidioosin taloudellisista vaikutuksista karjanhoitoon ja erityisesti siipikarjateollisuuteen, alkueläinparasiitin hallinta on hyvin toivottavaa. 5 Niinpä keksinnön tarkoituksena on saada aikaan uusia ja käyttökelpoisia monoklonaalisia vasta-aineita E. tenella-parasiitin merotsoiittejä vastaan. Lisätarkoituksena on eristää ja identifioida spesifiset E. tenella-antigeenit, jotka ovat käyttökelpoisia rokotteina linnuissa 10 esiintyvän kokkidioosin hallitsemiseksi. Keksinnön mukaisille menetelmille vasta-aineiden ja antigeenikoostumuksen valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään. Eimeria tenella-laji, joka infektoi kananpoikien 15 umpisuolet, on erityisen tuhoisa parasiitti, joka aiheuttaa erityisen pahoja verisiä haavaumia tartunnan saaneissa eläimissä. E. tenella'lla on kaksi merotsoiitti-vaihetta elinkierrossaan, jotka vaiheet on nimetty ensimmäisen ja vastaavasti toisen sukupolven merotsoiiteiksi. Immunitee- 20 tin E. tenella'a vastaan tiedetään kehittyvän sen elinkierron suvuttomien merotsoiitti-vaiheiden aikana [P. L. Long (toim.): The Biology of the Coccidia, University Park Press, Baltimore, Md. (1982)]. E. tenella'n merotsoiitti-valmistetta käytetään 25 immunisoimaan hiiriä, jotta lopulta saataisiin monoklonaalisia vasta-aineita jäljempänä esitetyllä menetelmällä. Monoklonaalisia vasta-aineita tutkitaan edelleen, jotta voitaisiin määrittää niiden kyky hillitä parasiitin kasvua in vivo. Antigeenit, jotka aikaansaavat monoklonaalisia 30 vasta-aineita, jotka reagoivat ainakin yhden Eimeria-lajin kanssa tai joko merotsoiittien tai itiöiden kanssa, ja jotka hillitsevät parasiitin kasvua, pidetään suojaavina antigeeneinä. Suojaavia antigeenejä pidetään mandollisina ehdokkaina linnuissa esiintyvää kokkidioosia vastaan käy- 35 tettävän rokotteen kehittämiseksi.

6 Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä. Esimerkki 1 Kvantitatiivinen radioimmunomääritys Jotta voitaisiin arvioida vasta-aineiden laatua, 5 suoritettiin kvantitatiivinen radioimmunomääritys. Glutaraldehydillä sidottuja itiöitä tai merotsoiittejä (yleensä 2-5 x 10 5 /kuoppa) sentrifugoidaan 96- kuoppaisille polyvinyylikloridi- tai RemovawelIiLlevyille (Dynatech) x g 10 minuutin ajan, jotta organismi 10 kiinnittyisi kuoppien pohjiin. Levyn pohjaan kiinnittyneet itiöt tai merotsoiitit saatetaan reagoimaan seeruminäytteiden kanssa, jotka on saatu parasiitilla immunisoiduista hiiristä, tai hybridoomien viljelyliuoksesta saadun monoklonaalisen vasta-aineen 15 kanssa. Inkubointi vasta-aineen kanssa kesti tuntia 4 C:ssa tai 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Sitoutunut vasta-aine todettiin radioaktiivisesti leimatulla toisella vasta-aineella 187,1, joka on hiiren k-kevytketjulle spe- 20 sifinen rotan monoklonaalinen vasta-aine. Anti-hiiri k-kevytketjuinen vasta-aine leimataan biosynteettisesti S-metioniinilla [D. E. Yelton et al.: Hybridoma 1 (1982), ss. 5-11]. Radioaktiivisuus mitataan neste-tuikelaskennalla. Radioimmunomääritysmenetelmää sovelletaan tämän 25 jälkeen E. tenella'n itiöistä saatuihin pintamembraaneihin, jotta varmistetaan vasta-aineiden reaktiivisuus immuuneissa hiiriseerumeissa membraaniproteiinien kanssa. Esimerkki 2 Hybridoomaviljelmien valmistus 30 Kanan munuaissolujen primääriset viljelmät infektoidaan juuri munarakkuloista puhjenneilla itiöillä noudattaen menetelmiä, jotka ovat tunnettuja alalla. 5 päivää tartunnan jälkeen alustaan vapautuneet merotsoiitit kerätään sentrifugoimalla 350 x g 10 minuutin 35 ajan.

7 viikkoiset BALB/c-naarashiiret immunisoidaan vatsaontelon sisäisesti (i.p.) 1 x 10 7 :11ä joko kokonaisilla tai E. tenella-merotsoiittien osilla Freund'in täydellisessä adjuvantissa. Eläimille annetaan i.p. 2 Merotso- 5 iitti-tehosteruisketta väliaineessa 199 (Gibco) 5 viikon välein alkuperäisen immunisoinnin jälkeen. 3 päivää jokaisen tehosteruiskeen jälkeen saatu seerumi tutkittiin E. tenella'n itiöitä vastaan muodostuneiden vasta-aineiden toteamiseksi epäsuoralla immunofluoresenssimäärityksellä 10 (IFA) ja radioimmunomäärityksellä (RIA). Kummatkin määritykset suoritetaan glutaraldehydillä sidotuille parasiiteille. Hybridoomat saadaan noudattaen tunnettuja menetelmiä [Kwan et al.: (1980) Genetic Engineering; J. K. Setlow 15 ja A. Hollander (toim.), Plenum Publishing Corp., New York, ss ]. E. tenella'n merotsoiiteillä immunisoidut kanden hiiren pernasolut yhdistetään P3-myelooman P3 - x 83. Ag 8.653, erittämättömään klooniin, 30-%:isen polyetyleeniglykolin (PEG 1 000, Baker Chemical) läsnäol- 20 lessa 8 minuutin ajan. Fuusioidut solut levitetään 96- kuoppaisiin kudosviljelyastioihin (LINBRO) ja ylläpidetään HAT-selektio-alustassa [J. W. Littlefield: Science 145 (1964), ss ]. HAT-alusta valmistetaan Dulbecco'n modifioituun Eagle'n alustaan, jossa on 20 % sikiövasikan 25 seerumia (Gibco) ja 10 % NCTC 109:ää (Microbiological Associates). Hybridejä viljellään inkubaattorissa 37 C:ssa ja 10-%:isessa CO 2 :ssa. Viljelmiä analysoidaan ajoittain IFA- ja RIA-menetelmillä E. tenella'n itiöiden kanssa reagoivien vasta- 30 aineiden toteamiseksi. Positiiviset viljelmät siirretään 24-kuoppaisiin kudosviljelmä-astioihin alustassa, jossa ei ole hypoksantiinia, aminopteriiniä eikä tymidiiniä. Hybridoomat kloonataan pehmeässä agaroosissa rotan alkion fibroblastisyöttökerroksen päällä [Coffins et al.: J. Cell 35 Physiol. 79 (1972), ss ]. Positiiviset hybridoo-

8 makloonit nimetään alaklooninumeroilla (ts. klooni 15,84,4 on hybrodooma 15,84 alaklooni 4). Hyvin karakterisoitujen alakloonien erittämien immunoglobuliinien luokka ja alaluokka määritetään agar-kaksoisdiffuusiomenetelmällä. De- 5 tergenttiin (NP-40) liukoisia hybridoomauutteita käytetään kanin anti-hiiri-vasta-ainereagenssien kanssa (Meloy). Esimerkki 3 Anti-merotsoiitti-monoklonaalisten vasta-aineiden karakterisointi 10 8:n anti-merotsoiitti-monoklonaalisen vasta-aineen ominaisuudet on esitetty taulukossa I. Suurin osa monoklonaalisista vasta-aineista reagoi merotsoiittien ja itiöiden kanssa sekä IFA:lla että RIA:lla analysoituna. Monoklonaaliset vasta-aineet 1,90 ja 4,76 eivät reagoineet 15 itiöiden kanssa ja sattumalta RIA:ssa [katso (* taulukossa I]. Monoklonaalinen vasta-aine 15,84 ei reagoinut merotsoiittien kanssa IFA:ssa, mutta reagoi yhtä hyvin sekä itiöiden että merotsoiittien kanssa RIA:ssa. Taulukkoon I kerätyt tiedot osoittavat, että kaikki anti-merotsoiitti- 20 fuusiosta johdetut monoklonaaliset vasta-aineet ovat risti-reaktiivisia sekä E. tenella'n itiöiden että merotsoiittien kanssa. Taulukko I 25 Anti-merotsoiitti-monoklonaalisten vasta-aineiden identi- fiointi Monoklonaalinen IFA RIA vasta-aine Mero Itiö Mero Itiö 30 Ml (1, (* M2 (4,76) (* M3 (2,03) M4 (13,90) M5 (10,08) M6 (10,84) M7 (8,03) M8 (15,84)

9 Esimerkki 4 Anti-merotsoiitti-monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus eri lajien itiöitä vastaan Monoklonaaliset vasta-aineet analysoidaan IFA:lla 5 5:stä taloudellisesti tärkeästä lintu-parasiitti kokkidi- oosilajista johdettuja itiöitä vastaan. Tiedot kokeista on esitetty taulukossa II. 6:tta monoklonaalista vasta-ainetta, jotka reagoivat IFA:ssa E. tenella'sta johdettujen itiöiden kanssa käytetään tutkittaessa lajien ristireak- 10 tiivisuutta. Tulokset osoittavat, että 5 monoklonaalista 15 vasta-ainetta reagoi ristiin E. necatrix'sta ja E. maxima'sta johdettujen itiöiden kanssa ja 1 monoklonaalinen vasta-aine (15,84) reagoi kaikkien viiden kokeessa olleen Eimeria-lajin kanssa. Taulukko II Anti-merotsoiitti-monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus eri lajien itiöitä vastaan 20 Mono- E. te- E.neca- E. acer- E. maxi- E. bru klonaali- nella trix vulina ma netti nen vastaaine M 3 (2,03) M 4 (13,90) M 5 (10,08) M 6 (10,84) /- - M 7 (8,03) M 8 (15,84) Esimerkki 5 In vivo-neutralointianalyysi In vivo-menetelmää monoklonaalisten vasta-aineiden 35 analysoimiseksi käytetään arvioimaan monoklonaalisia vas-

10 ta-aineita. 3 monoklonaalista vasta-ainetta, jotka reagoivat E. tenella'n itiöiden kanssa, analysoidaan tällä tavalla. Juuri eristettyjä itiöitä inkuboidaan steriileissä olosuhteissa lämpö-inaktivoidulla askiites-nesteellä, joka 5 on johdettu kolmesta eri hybridoomasta. Inkubointiaika on 1 tunti huoneen lämpötilassa. Itiöt istutetaan 3 viikon ikäisten kananpoikien umpisuoliin kirurgisesti. Parasiitin kehityksen annetaan tapahtua 5 päivää istutuksen jälkeen. Tämän ajan lopussa haavaumat lasketaan, jotta voitaisiin 10 arvioida tartunnan laajuus. Kokeiden tulokset on esitetty taulukossa III monoklonaalisten vasta-aineiden tarjoamana suojausprosenttina. Tiedot osoittavat, että jokainen vasta-aine on ainakin osittain suojaava joissakin koejärjestelmän olosuhteissa. 15 Taulukko III In vivo-neutralointianalyysi E. tenella'n itiöillä ja anti-merotsoiitti-monoklonaalisilla vasta-aineilla Käsittely I. Kevyt tartunta (200 itiötä/eläin) Eläinten luku- määrä Ei yhtään Suojaus-% Osittain Täysin Kontrolli M 6 (10,84) M 8 (15,84) II. Vakava tartunta 30 (1000 itiötä/eläin) Kontrolli M 4 (13,90) M 6 (10,84) M 8 (15,84) (jatkuu...)

11 Taulukko III (jatkoa) Eläinten Suojaus-% Käsittely luku- Ei Osittain Täysin 5 määrä yhtään III. Vakava tartunta (3000 itiötä/eläin) Kontrolli M 6 (10,84) M 8 (15,84) Esimerkki 6 Antigeenien karakterisointi 15 Monoklonaalisilla vasta-aineilla karakterisoidut E. tenella-antigeenit identifioitiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE), jota seurasi nitroselluloosa-blottins-menetelmä [Towbin et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, ss (1979)]. 20 E. tenella'n itiöitä ja merotsoiitteja hajotetaan ja uutetaan 1-%:isella Nonidet P-40:11ä (Betsheda Research Laboratory) 10 mm:ssä Tris-puskurissa (ph 7,5), jossa on 155 mm NH 4C1:a, 1,5 mm MgAc 2 :a proteaasi-inhibiittoreiden, leupeptiinin ja antipainin 30 pg/ml kanssa, 4 mm fenyyli- 25 metyyli-sulfonyylifluoridia ja aprotiinia (2 trypsiini- inhiboivaa yksikköä/ml). Hajotusmenetelmään kuuluu inkubointi 30 minuutin ajan 0 C:ssa, jota seuraa sentrifugointi x g:ssä 30 minuutin ajan. Pelletti heitetään pois ja liuennut materiaali käytetään geelieletroforeesiin. 30 Suoritetaan SDS-polyakryyliamidigeelielektroforee- si näytteille, jotka on pelkistetty 2-merkaptoetanolilla epäjatkuvassa Tris-glysiinisysteemissä käyttäen 7-15-%:isia polyakryyliamidigradienttigeelejä. SDS-PAGE:lla erotetut proteiinit siirretään nitro- 35 selluloosasuodattimeen elektroforeettisesti 45 minuutin

12 ajan. Nitroselluloosasuodatin saatetaan sitten reagoimaan joko askiites-nesteen (laimennettu 1:100) tai hybridoomille käytetyn elatusnesteen kanssa 1-18 tunnin ajan 4 C:ssa. Tavallista kanin seerumia lisättiin 10 %:n konsent- 5 raatiossa kaikkiin vasta-aineiden kanssa tapahtuviin inkubaatioihin. Sidottu monoklonaalinen vasta-aine havaitaan saattamalla se reagoimaan 125 I-leimatulla kanin anti-hiiri- IgG-vasta-aineella (New England Nuclear). Reaktio toisen vasta-aineen kanssa kestää yleensä 3-5 tuntia huoneen 10 lämpötilassa. Sitoutumaton toinen vapaa vasta-aine poistetaan pesemällä. Nitroselluloosasuodattimet kuvataan Kodakröntgenfilmillä XAR-5 tai SB-5. Vaihtoehtoisesti täplät kehitetään ELISA-menetelmällä käyttäen piparjuuriperoksidaasiin sidottua kanin 15 anti-hiiri-igg:tä (Miles) ja kloorinaftolia (Aldrich) ja H 20 2 :a (Baker) substraatteina. Proteiiniantigeenien molekyylipainot määritetään suhteessa molekyylipainostandardeihin. Monoklonaalisella vasta-aineella 15,84 karakteri- 20 soidut antigeenit ovat kuvaavia. Monoklonaalinen vasta- aine 15,84 reagoi kaksoismuodon kanssa, jonka molekyylipaino on noin 130 ± 20 kd. Kuitenkin 100 kd:n suuruusluokan proteiinien molekyylipainojen arviointi vaihtelee riippuen käytettävistä molekyylipainostandardeista. 130 ± kd-lajien lisäksi 15,84 reagoi myös vyöhykkeen kanssa, jonka näennäinen molekyylipaino on 300 ± 50 kd. Suuremman molekyylipainon omaavaan vyöhykkeeseen kuuluu % antigeenistä ja se on ehkä joko aggregaatti tai 130 ± 20 kd-lajin polymeerinen muoto. 30 Kontrollikoetta monoklonaalisella vasta-aineella, josta tiedetään, ettei se reagoi proteiiniantigeenien kanssa, käytetään todistamaan antimerotsoiitti-vasta-aineiden spesifisyyttä. Lisäksi muut kontrollit osoittavat, että monokionaaliset vasta-aineet ovat parasiittispesifi- 35 siä, eivät reagoi isäntäspesifisen parasiitin kanssa.

13 Yhteenveto eri vasta-aineilla karakterisoitujen geenien molekyylipainotiedoista on esitetty taulukossa IV. Merkittävä piirre on immunogeenisten antigeenien, joiden molekyylipaino on alueella joko 20 kd tai > 100 kd, 5 esiintyminen E. tenella'n merotsoiiteissä. Taulukko IV Molekyylipainotietojen yhteenveto Anti-merotsoiitti- Antigeenin likimääräinen monoklonaalinen vasta-aine molekyylipaino M 1 (1,90) M 2 (4,76) 300 ± 50 kd M 6 (10,84) M 8 (15,84) 130 ± 20 kd M 3 (2,03) M 4 (13,90) 18 ± 3 kd M 5 (10,08) M 7 (8,03) Monoklonaalista vasta-ainetta 15,84 pidetään neut- raloivana vasta-aineena ja karakterisoitua antigeeniä pi- detään suojaavana antigeeninä. Lisäksi 15,84 vasta-aine on 25 risti-reaktiivinen E. tenella'n merotsoiittien ja itiöiden kanssa, samoin kuin itiöiden kanssa, jotka on eristetty E. maxima'sta, E. necatrix'sta, E. acervulina'sta ja E. brunetti'sta. Uudet monoklonaaliset vasta-aineet 1,90, 15,84, 30 13,90, 10,84, 8,03 ja 2,03, jotka on eristetty kuten edellä on esitetty, ovat talletettuina American Culture Type Collection'iin (ATCC) (Rockville, Maryland, USA), ja ne on lisätty sen pysyviin kokoelmiin. Numerolle 1,90 on annettu n:o HB8336; numerolle 15,84 on annettu n:o HB8335; nume- 35 rolle 13,90 on annettu n:o HB8337; numerolle 10,84 on an-

14 nettu n:o HB8387; numerolle 8,03 on annettu n:o HB8388; ja numerolle 2,03 on annettu n:o HB8389. Vasta-aineisiin pääsee tutustumaan patenttihakemuksen ollessa käsittelyn alaisena henkilö, josta päättää patentti- ja tavaramerk- 5 kien tarkastaja, ja joka on siihen oikeutettu 37 C.F.R. 1,14:n ja 35 U.S.C. 122:n nojalla; ja kaikki rajoitukset HB8335:n, HB8336:n, HB8337:n, HB8387:n, HB8388:n ja HB8389:n saatavuuden suhteen yleisölle tullaan peruuttamattomasti poistamaan, kun patenttihakemukselle on myön- 10 netty patentti. Numerot 1,90, HB8336; 15,87, HB8335; ja 13,90, HB8337 talletettiin ATCC:iin 16. elokuuta Numerot 10,84, HB8387; 8,03, HB8388; ja 2,03, HB8389 talletettiin ATCC:iin 20. lokakuuta 1983.

15 Patenttivaatimukset 1. Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka reagoivat Eimeria spp.-itiöiden tai 5 merotsoiittien antigeenien kanssa, tunnettu siitä, että viljellään klooni-n:o 1,90 (ATCC n:o HB8336) 2,03 (ATCC n:o HB8389), 13,90 (ATCC n:o HB8337), 10,84 (ATCC n:o HB8387), 8,03 (ATCC n:o HB8388) tai 15,84 (ATCC n:o 10 HB8335) sopivassa ravintoalustassa ja vasta-aine otetaan talteen yllä mainitun hybridoomaviljelmän supernatantista; tai että hiireen injektoidaan hybridoomaviljelmä, jolle on annettu klooni-n:o 1,90 (ATCC n:o HB8336), 2,03 (ATCC n:o HB8389), 13,90 (ATCC n:o HB8337), 10,84 (ATCC 15 n:o H88387), 8,03 (ATCC n:o HB8388) tai 15,84 (ATCC n:o HB8335) ja vasta-aine otetaan talteen hiiren vesivatsasta tai seerumista. 2. Menetelmä antigeenisen, immunogeenisen ja proteiinipitoisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on liu- 20 koinen detergenttiä sisältävään puskuriliuokseen, ja joka on Eimeria tenella'n merotsoiittien antigeeninä, ja joka on spesifisesti reaktiivinen hybridoomakloonin 1,90 (ATCC n:o HB8336) erittämien merotsoiittivastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, antigeenin keskimääräisen 25 molekyylipainon ollessa 300 ± 50 kd; on spesifisesti reaktiivinen hybridoomakloonien 10,84 (ATCC n:o HB8387) ja 15,84 (ATCC n:o HB8335) erittämien merotsoiittivastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, antigeenin keskimääräisen molekyylipainon ollessa 130 ± 20 kd; tai on eri- 30 tyisen reaktiivinen hybridoomakloonien 8,03 (ATCC n:o HB8388), 2,03 (ATCC n:o HB8389) ja 13,90 (ATCC n:o HB8337) erittämien merotsoiittivastaisten monoklonaalisten vastaaineiden kanssa, antigeenin keskimääräisen molekyylipainon ollessa 18 ± 3 kd; tunnettu siitä, että

16 a) E. tenella'n itiöitä ja/tai merotsoiittejä hajotetaan ja tehdään liukoisiksi uuttamalla ne detergentillä sisältävällä puskurilla tavanomaiseen tapaan; b) liuennut aine erotetaan puhdistetun antigeenin 5 saamiseksi.

17 Patentkrav 1. Förfarande för framställning av monoklonala antikroppar, vilka reagerar med antigener av Eimeria spp.- 5 sporzoiter eller -merozoiter, k ä n n e t c k n a t där- av, att man odlar klonen nr 1,90 (ATCC nr HB8336), 2,03 (ATCC nr HB8389), 13,90 (ATCC nr HB8337), 10,84 (ATCC nr HB8387), 8,03 (ATCC nr HB8388) eller 15,84 (ATCC nr 10 HB8335) i ett lämpligt medium och utvinner antikroppen från supernatanten av nämnda hybridomodling, eller att man i en mus injicerar en hybridomkultur, vilken betecknats med klon nr 1,90 (ATCC nr HB8336), 2,03 (ATCC nr HB8389), 13,90 (ATCC nr HB8337), 10,84 (ATCC nr 15 HB8387), 8,03 (ATCC nr HB8388) eller 15,84 (ATCC nr HB8335) och utvinner antikroppen från askites eller serumet från musen. 2. Förfarande för framställning av en antigen, immunogen och proteinhaltig komposition, vilken är löslig i 20 en detergenthaltig buffertlösning och är en antigen av Eimeria tenella-merozoiter samt är specifikt reaktiv med monoklonala anti-merozoitantikroppar, vilka utsöndrats av hybrodomklonen 1,90 (ATCC nr HB8336) och har en ungefärlig molekylvikt av 300 ± 50 kd; eller är specifikt reaktiv med 25 monoklonala anti-merozoitantikroppar, vilka utsöndrats av hybrodomklonerna 10,84 (ATCC nr HB8387) och 15,84 (ATCC nr HB8335) och har en ungefärlig molekylvikt av 130 ± 20 kd; eller är specifikt reaktiv med monoklonala anti-merozoitantikroppar, vilka utsöndrats av hybrodomklonerna 8,03 30 (ATCC nr HB8388), 2,03 (ATCC nr HB8389) och 13,90 (ATCC nr HB8337) och har en ungefärlig molekylvikt av 18 ± 3 kd; kännetecknat därav att man a) söndrar och solubiliserar sporzoiter och/eller merozoiter av E. tenella genom att extrahera den med de- 35 tergentinnehållande buffert på sedvanligt sätt; b) separerar det solubiliserade materialet för att erhålla renad antigen.