S U O M I- F I N L A N D (FI)

Transkriptio

1 ( B) (11)KUULUTUSJULICAISU UTLAGGNINGSSICRIFT (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 A 61K 39/215 (21) Patenttihakemus - Patentansökning S U O M I- F I N L A N D (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P (71) Hakija - Sökande 1. Norden Laboratories, Inc., 601 W. Cornhusker Highway, Lincoln, Nebr , USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Gill, Michael Alonzo, 6400 Meeker Circle, Lincoln, Nebr , USA, (US) 2. May, Stephen Wayne, 3343 N Street, Lincoln, Nebr , USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä koiran Coronavirusrokotteen valmistamiseksi Förfarande för producering av ett Coronavirusvaccin (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmä - Sammandrag Koiran Coronaviruerokote valmistetaan solukytkeisesta peplomeerlantigeenista. Hundene Coronaviruevaccin frametalle fran cell - aesocierad peplomeranttgen.

2 Menetelmä koiran Coronavirusrokotteen valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää eläinlääkintärokotteiden valmistamiseksi, ja erityisesti rokotteen valmistamiseksi koiraeläinten suojaamiseksi koiran Coronavirusinfektiolta. Coronavirukset kuuluvat useiden tautien tärkeimpiin aiheuttajiin, mukaan lukien aivotulehdus, maksatulehdus, keuhkotulehdus, nenä-nielutulehdus, vatsakalvontulehdus ja maha-suolitulehdus monella eri eläinlajilla. Mitä tulee suolistoinfektioihin, Coronaviruksia on todettu ihmisen, sikojen, vasikoiden, hiirten, rottien, kanojen, kalkkunoiden, koirien, kissojen ja hevosten ulosteista. Koiran Coronaviruksen (CCV) aiheuttamasta suolistotulehduksest.a raportoivat ensimmäisinä Binn, et al,, vuonna 1974, Proc. 78th Ann. Mtg. U.S. Anim. Health Assoc. Roanoke VA Oct: (1974). Virus eristettiin alunperin vuonna 1971 sota- Koirista, jotka kärsivät epäillystä viruksen aiheuttamasta maha-suolitulehduksesta. Toistaiseksi tuntemattomista syistä, 1970-luvun loppupuolella, Coronaviruksen aiheuttama suolitulehdus tuli esille koirien merkittävänä tautina. Pääasiallinen infektiolähde näyttää olevan infektoituneiden eläinten ulostemateriaali. Suun kautta levinnyt infektio johtaa monistumiseen ohutsuolen epiteelisoluissa. Virus voidaan yleensä eristää infektoituneiden koirien ulosteista 3-14 päivän välillä taudin istuttamisen jälkeen. CCV-maha-suolitulehdukselle on tunnusomaista lievä alakuloisuus, ruokahaluttomuus ja löysä uloste, johon liittyy erityisen epämiellyttävä haju. Taudin äkilliseen puhkeamiseen liittyy usein ripulia, johon liittyy, tai jota vähän ennen edel-

3 tää, oksentamista. Oksentamiskertojen määrä vähenee tavallisesti sairastumisen ensimmäisen tai toisen päivän jälkeen. Ulosteet sisältävät usein limaista ja vaihtelevia määriä verta, mikä antaa sille oranssinpunaisen värisävyn. Esiintuleva ripuli nähdään joskus joko vetisenä tai verisenä nesteenä. Nuoret pennut voivat kuivua nopeasti, vaikka nestehoito aloitetaan varhain sairastumisen kuluessa. Kuolemia on esiintynyt niinkin varhain kuin tuntia kliinisten oireiden ilmaannuttua huolimatta hyvästä vahvistavasta hoidosta. Stressi näyttää lisäävän taudin ankaruutta. Kohonneita ruumiinlämpöjä on todettu joissain tapauksissa, mutta useimmat eläimet pyrkivät pysymään kuumeettomina, ja joillain sairastuneilla koirilla lämmöt voivat olla selvästi alle normaalin. Katso Carmichael, "Infectious canine enteritis caused by a coronalike virus,", Laboratory Report, The James A. Baker Institute for Animal Health, Cornell U. 1(9) (1978). Useimmat tartunnan saaneet koirat toipuvat 7-10 päivän kuluttua, mutta koirat, joille on annettu varhaisoireellista hoitoa, ja joita on pidetty lämpiminä ja paikoillaan, toipuvat joskus nopeammin. Appel et al., Cornell Vet. 69: (1979). Pysyvästä, 3-4 viikkoa kestävästä ripulista, joka oli vaikeasti hoidettavissa, on raportoitu eräissä tapauksissa. Appel et al., Canine Prac. 7:22-36 (1980). Samanaikaista silmän ja nenän vuotoa on todettu, mutta niiden yhteys primääri-infektioon on tuntematon. Morfologiset vammat CCVsuolitulehduksessa rajoittuvat suoleen ja mesenteerisiin imusolmukkeisiin. Histologiset muutokset ovat huomattavan samanlaisia kuin ne, joita on kuvailtu gnotobioottisilla vasikoilla, jotka on infektoitu naudan coronavirukeella. Ongelmaton infektio koekoirilla on lievä, ja patologisia muutoksia ei joko havaita, tai ne käsittävät laajentuneita euolenmutkia, jotka ovat täynnä vetistä, vihreänkeltaista ulostemateriaalia. Mesenteeriset imusolmukkeet ovat tavallisesti laajentuneet ja verentungoksiset tai verta vuotavia.

4 Erääseä tapauksessa inkubointiaika kokeellisesti infektoiduilla koirilla oli noin tuntia. Koirilla ei esiintynyt tyypillisiä kliinisiä oireita tai tyypillistä coronaviruksen aiheuttamaan maha-suolitulehdukseen liittyvää ripulia. Mikroskooppiset muutokset olivat vaatimattomia, ja niille oli tunnusomaista surkastunut suolinukka ja syventyneet kuopakkeet, lisääntynyt limakalvon tukikerroksen soluisuus, epiteelisolujen litistyneisyys, ja pikarisolujen vuotaminen ulos. Keenan et al., Am. J. Vet. Res. 37: (1976). Lievät oireet voivat johtua eristämismenetelmistä, joita käytettiin kokeellisesti infektoitujen koirien taudinistutuksessa, ja siitä seikasta, että koirilla ei ollut muita huomattavia patogeeneja eikä parasiitteja. CCV-euolitulehdukseen ei ole saatavilla erityishoitoa. Hoito on tukea antavaa, johon kuuluu yritykset korvata nesteja elektrolyyttimenetykeiä, ripulin kontrolloimiseksi, ja estää tai kontrolloida sekundäärisiä bakteeri-infektioita. Seerumin sisältämät vasta-ainetiitterit niillä koirilla, jotka oli tartutettu parenteraalisesti CCV:llä, olivat korkeampia kuin suun kautta altistetuilla koirilla. Suun kautta tartuttamisen jälkeen koirat reagoivat anamneatistyyppisellä vasta-ainevasteella ja levittävät virusta lyhyemmän ajan kuin mitä altistamattomat kontrollikoirat. Vaikutti siltä, että paikallinen immuniteetti, mandollisesti suoliston sisältämien IgA-vasta-aineiden välittämänä, oli välttämätön suojaamisen kannalta CCV-infektiota vastaan, samalla tavalla kuin sikojen tarttuvassa maha-suolitulehduksessa. Appel et al., Canine Prac. 7:22-36 (1980). CCV-suolitulehduksen riittävä diagnoosi perustuu kliinisiin oireisiin. Muihin akuutin oksentamisen ja ripulin aiheuttajiin koirilla, jotka voitaisiin myös ottaa huomioon, lukeutuvat myrkytykset, bakteerinen suolitulehdus, kokkidioosi, äkillinen haimatulehdus, äkillinen munuaisen tai maksan häiriöti-

5 la, ja toiset virusinfektiot. Osoitus nopeasta leviämisestä viittaa vahvasti CCV-suolitulehdukeeen. Tiedetään useita raportteja, joiden mukaisesti kuvaillaan koiran parvovirukeen elektronimikroskooppinen havaitseminen CCV-partikkelien yhteydessä koiran ulostenäytteissä. Katso esimerkiksi Carmichael, siteerattu edellä; Evermann et al., J. Am. Vet. Med. Ase. 177: (1980); Reseto et al., Arch. Virol. 66:89-93 (1980). Yhden raportin mukaan havaittiin lisäksi koiran rotavirus yhdessä ulostenäytteessä. McNulty et al., Vet. Res. 106: (1980). Tämä osoittaa sen, että kenttätapausten vakavuus voi osaksi johtua monesta virusinfektiosta yhdessä. CCV:n eristämiseen ulostenäytteistä tai suolan sisällöstä on useiden tutkijoiden mukaan raportoitu liittyvän joitain vaikeuksia. Vaativasta luonteestaan ja vastaanottavaisten eolueubetraattien puuttumisesta johtuen coronavirukset eivät usein tule erietetyikei tai diagnoeoiduiksi. Serokonversioita tai kuolemanjälkeieiä havaintoja fataaleissa tapauksissa, mukaanlukien jäädytettyjen suolileikkeiden immunofluoresenssi, voidaan kaikkia käyttää oikeaan etiologiseen diagnooeiin. Coronavirukset ovat suuria (noin 100 nm halkaisijaltaan), vaipallieia RNA-viruksia, jotka sisältävät kierukkamaisen nukleokapsidin, johon liittyy tunnusomaisia, suuria nuijamaisia ulokkeita tai piikkejä, joita nimitetään peplomeereiksi. RNA käsittää yksinkertaisen, lineaarisen yhden juostaan, joka 6 on positiivisesti polaarinen, käsittäen suunnilleen 5,5 x 10 daltonia. Ultraohuissa kudosleikkeissä virus näyttää, elektronimikroskoopilla, muodostuvan silmikoimalla sytoplasman vakuoleihin. Virus muistuttaa antigeenisesti läheisesti sian tarttuvaa maha-suolivirusta. US-pantenteisea ja US tuodaan esille inaktivoitu ja heikennetty koiran coronaviruerokotte, vastaavasti, molempien sisältäessä neetemäisen kasvualustan.

6 Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetaan rokote koiraeläinten suojaamiseksi taudilta, jonka aiheuttaa koiran Coronavirusinfektio, joka rokote sisältää tehokkaan määrän solukytkeistä CCV-peplomeeriproteiinia. Keksintö koskee menetelmää sellaisen rokotteen valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää: a. soluviljelmän infektoimisen CCV-infektion paljousarvolla (Multiplicity of Infektion (MOI)) 0,2 2,0; b. solujen viljelemisen 6-18 tuntia; c. nestemäisen kasvualustan poisheittämisen; d. solujen hajottamisen; e. solukytkeisen peplomeeriproteiinin talteenottamisen hajotetuista soluista; ja f. solukytkeisen peplomeerin sekoittamisen parenteraaliseeti hyväksyttävän kantajan kanssa. Toisessa keksintöä koskevassa näkökohdassa valmistetaan polyvalenttinen rokote, joka käsittää tehokkaan määrän solukytkeist.ä CCV-peplomeeriproteiinia ja tehokkaan määrän antigeenista komponenttia, joka suojaa yhtä tai useampaa muuta patogeenista organismia tai virusta vastaan. CCV monistuu solunsisäisesti infektion jälkeen. Monistumissyklin aikana CCV RNA tulee luetuksi erilaisten rakenneproteiinien ja ei-rakenteellisten proteiinien muodostamiseksi viruksen monietuessa. Kapsidiproteiinit, mukaan lukien peplomeeri- eli E2-proteiini, näyttävät muodostuvan membraaniin sidottujen polyribosomien pinnalla karkeassa endoplasmisessa retikulumissa. Viruksen muodostumisen aikana sytoplasmiset nukleokapsidit silmikoituvat endoplasmiseen retikulumiin, ottaen mukaansa kapsidiproteiineja valmiiden viruspartikkelei-

7 den muodostamiseksi, ja poistuvat sen jälkeen Golgin laitteen kautta. Peplomeeriproteiini saattaa jakaantua tai muutoin modifoitua posttranslationaalisesti partikkelin muodostuksen jälkeen. Samanaikaisesti jotkin peplomeeriproteiineista näyttävät pysyvän aolumembraanin lipidikaksoiskerroksen sisällä alkutunkeutumisen yhteydessä infektoitavaan soluun. Nyt on havaittu, että soluun kytkeytynyt peplomeeriproteiini, se. peplomeeriproteiini sellaisena, kun se esiintyy infektoituneessa solussa ennen partikkelinmuodostusta, indusoi immuunivasteen parenteraalisen antamisen yhteydessä koiraeläimessä, joka vaate suojaa taudinoireita vastaan, jotka normaalisti liittyvät virulenttiin CCV-infektioon. Tämä havainto on odottamaton siinä mielessä, että kokonainen virus, heikennetty tai inaktivoitu, antaa suhteellisen heikon immuunisuojan. Soluun kytkeytyvää peplomeeri-proteiinia (molekyylipaino noin ) voidaan tuottaa sopivalla viljelyllä, ja ottaa talteen infektoidut solut synteesin avulla tai geenitekniikan avulla. Peplomeerin tuottamiseksi soluviljelyn avulla, vastaanottavainen soluviljelmä infektoidaan viruksella ja viljellään. Mitä tahansa primääristä tai jatkuvaa soluviljelmää, joka pystyy pitämään yllä viruksen replikointia, tai jossa virus voidaan mukauttaa replikoimaan, voidaan käyttää. Esimerkkeinä ovat koiran primäärisolut, kuten koiran munuaissolut ja koiran kateenkorvasolut; koiran solulinjat kuten Madin Darby-koiran munuaissolulinja ja koiran A-72-fibroblastisolulinja (ATCC CRL 1542); kissan primäärisolut, kuten kissan primääriset munuaissolut; kissan solulinjat kuten Crandallkissan munuaissolulinja ja Woodin kissan solulinja; ja muut primääriset tai jatkuvat nisäkässolut kuten Vero-apinan munuaissolulinja. Virus voidaan eristää kliinisista infektioista tunnetuilla menetelmillä. Sellaiset menetelmät sisältävät infektoituneen

8 eläimen ulostemateriaalin suspendoimisen esimerkiksi kudosviljelyalustaan polykationin läsnä ollessa, ja siirrostamalla sen jälkeen primäärisoluviljelmä kudosviljelysupernatantilla. Katso esimerkiksi Binn et al., Proc. 78th Ann. Mtg. U.S. Anim. Health Assoc., Roanoke VA October: (1974), Keenan et al., Am. J. Vet. Res. 17: (1976) ja Tingpalapong et al., Am. J. Vet. Res. 43: (1982). Virulentti kanta, I-71-kanta, jonka alunperin eristivät Binn et al. vuonna 1971, kuuluu niiden joukkoon, joita on julkisesti saatavilla. Sitä voi saada esimerkiksi American Type Culture Collection' eta, Rockville, Maryland, USA talletusnumerolla VR-809. Muihin eristettyihin kantoihin lukeutuvat K-378, S-378, A76-5 ja ATCC VR 2068, joihin viitataan US-patenteissa ja Solukytkeisen peplomeeriantigeenin tuottamiseksi ja talteenottamiseksi soluviljemä infektoidaan 0,2-2,0 viruapartikkelilla solua kohti, so., mikä vastaa infektion paljousarvoa (MOI) 0,2-2,0, ja edullisesti MOI-arvolla 0,4-1,5. Infekoituja soluja viljellään noin 6-18 tuntia, edullisesti 9-16 tuntia, ja edullisimmin 9-12 tuntia, infektoinnin jälkeen. Kasvualusta poistetaan sen jälkeen, ja peplomeeri otetaan talteen soluista. Tämä toteutetaan edullisesti korvaamalla nestemäinen viljelyalusta tuoreella nestemäisellä alustalla, hajottamalla sen jälkeen solut, soluun liittyneen peplomeerin vapauttamiseksi, joka kerätään talteen tuoreeseen neetemäiseen kasvualustaan. Solukytkeinen peplomeeri sekoitetaan parenteraalisesti hyväksyttävän laimentimen tai kantajan kansaa rokotteen valmistamiseksi. Nämä vaiheet voidaan sopivaati yhdistää korvaamalla käytetty nestemäinen kasvualusta sellaisella, joka on parenteraalisesti sallittu, ennen hajotueta. Hajotue voidaan toteuttaa esimerkiksi mekaanisilla, ultraääneen perustuvilla tai kemiallisilla keinoilla, tai niiden yh-

9 distelmän avulla. Se toteutetaan sopivasti jäädyttämällä so- 0 0 lut noin noin -70 C :een. Sulatusvaiheessa otetaan talteen neste, joka sisältää solukytkeistä peplomeeriä. Koska kasvualusta, jossa infektoitu soluviljelmä oli kasvanut, on heitetty pois, tuore nestemäinen alusta on pääasiallisesti vapaa ekstrasellulaarisesta viruksesta, joka oli tullut ulos infektoituneen soluviljelmän kasvun aikana. Nestettä tulisi kuitenkin käsitellä jäljelle jääneiden ekstrasellulaaristen ja intrasellulaaristen virusten ja nukleokapsidien inaktivoimieeksi, jotka intrasellulaariset partikkelit ja nukleokapsidit vapautuvat hajotuksen yhteydessä. Mitä tahansa standardia viruksen inaktivointimenetelmää voidaan käyttää, kunhan peplomeeri ei denaturoidu. Sellaisiin menetelmiin kuuluvat säteilytys ja kemiallinen inaktivointi esimerkiksi lisäämällä binääristä etyleeni-imiiniä, beeta-propiolaktonia, formaldehydiä, fenolia tai asetyylietyleeni-imiiniä. Stabilaattoreita, apupuskuriaineita ja/tai säilöntäaineita, jotka ovat parenteraalisesti sallittuja, voidaan myös lisätä lopullisen rokoteformulaation valmistamiseksi. Edullinen rokote sisältää esimerkiksi mertiolaattia, esim. 1:60 000, ja etyleenimaleiinihappoanhydridiä apuaineena, esim., 0,2 X. Valmietettaesea keksinnön mukaista rokotetta soluviljelmän avulla, on tärkeätä, vastoin aikaisempia CCV-rokotevalmistusta käsitteleviä raportteja, poistaa käytetty nestemäinen alusta soluista ennen soluhajotusta. Vaikkakaan syytä ei tiedetä, edellä kuvatulla tavalla valmistetut rokotteet, mutta käyttämällä mieluummin käytettyä alustaa kuin tuoretta nestettä, tuottivat alhaisempia virusta neutraloivia vasta-ainetiittereitä, kuin rokote, joka sisältää tuoretta kasvualustaa. Jäljempänä, taulukossa 1, esitetään virukeen neutraloiva vasta-ainetiitteri pennuilla, käyttäen rokotetta, joka on valmistettu käyttäen käytettyä alustaa ja soluja <"nesterokote"), verrattuna rokotteeseen, joka on valmistettu olennaisesti samalla tavalla, paitsi että käytetty alusta dekantoitiin ja korvattiin tämän keksinnön mukaisesti ("solurokote").

10 Taulukko 1 Solurokotteen ja käytettyä nestettä sisältävän rokotteen teho pennuilla Virusta neutraloiva vasta-ainetiitteri Pentu Ennen toista Toisen rokotteen Ryhmä nro rokotetta jälkeen DE DE Solurokote DE DE Geometrinen keakitiitteri DE DE Neeterokote DE DE Geometrinen keakitiitteri Pentujen neutraloivat viruavaata-ainetiitterit osoittavat, että solurokote stimuloi suojaavan immunologieen varteen (geometrinen keakitiitteri 32) toiseen rokottamiseen mennessä. Rokotukeen jälkeiseen näytteenottohetkeen mennessä vasta lisääntyi geometrisen keskitiitterin arvoon 108. Päinvastaisesti, neeterokotteella rokotetut pennut pysyivät negatiivisina koko koejakaon ajan. Tämä on yllättävä tuloa, koska käytetty alusta sisältää CCV-virusta, jonka odottaisi edistävän immuunisuojaa.

11 Kokeessa, joka oli suunniteltu osoittamaan ajan merkitystä infektoitumisen jälkeen soluun liittyvän peplomeeriantigeenin muodostumiseen, soluun liittyvän proteiinin määrä ja soluviljelyalustassa oleva määrä eli virukseen liittynyt, määritettiin tunneittain entsyymikytkeisellä immunomäärityksellä (ELISA). Vastaavat antigeenimäärit esitetään taulukossa 2. Taulukko 2 Tuntia Peplomeeri-proteiini infektoinnin jälkeen solukytkeinen viruskytkeinen Vaikkakaan tarkoituksena ei ole olla sidoksissa tiettyyn mekanismiin tai selitykseen, näyttää siltä, että solujen viljelyajan pituudella on merkitystä, johtuen muutoksista, joita peplomeerille tapahtuu infektioeyklin myöhemmässä vaiheessa. Solukytkeisen peplomeeriantigeenin määrän todettiin myös olevan riippuvainen MOI-luvusta. Taulukossa 3 esitetään tuloksia koesarjasta, jossa MOI vaihteli 0,01-1,1.

12 Taulukko 3 Peplomeeri-proteiini MOI solukytkeinen viruskytkeinen 0, , , , , Kaikki viljelmät otettiin talteen 12 tunnin kohdalla infektoinnin jälkeen, ja antigeenin määrä määritettiin ELISAmäärityksellä. Solukytkeistä peplomeeriantigeenia voidaan valmistaa vaihtoehtoisilla menetelmillä. Peplomeeri voidaan esimerkiksi puhdistaa immunoaffiniteettikromatografian avulla, sekventoida ja sen jälkeen valmistaa peptidisynteesillä, tai ilmentämällä rekombinantti-isäntämikro-organismissa tai -solussa peptidieekvenssistä peräisin olevaa koodittavaa DNA-sekvenssiä. Peplomeerijohdannaisia, joissa on tallella soluperäisen antigeenin immunologisesti suojaavia ominaisuuksia, voidaan lisäksi valmistaa tavallisilla yhdietelmä-dna-, proteiinimanipulointi- tai kemiallisilla menetelmillä. Olkoon valmistustapa mikä tahansa, rokote annetaan parenteraalisesti, esimerkiksi lihaksensisäisesti tai ihonalaisesti, edullisesti vähintään 3 kuukauden ikäisille koirille. Toinen annos annetaan edullisesti 2-4 viikkoa ensimmäisen antamisen jälkeen. Vuosittaista uusintarokottamista suositellaan. Jos nuorempia koiria rokotetaan, ne rokotetaan edullisesti uudelleen 3 kuukauden ikäisinä. Kantavien naaraiden rokottamista on luultavasti parasta välttää.

13 Jokainen rokoteannos sisältää tehokkaan määrän solukytkeistä peplomeeriä, Bo., määrän, joka on tehokas parenteraalisen kaksinkertaisen rokottamisen yhteydessä, suojattaessa koiraeläimiä vakavien taudinoireiden, so., maha-suolitulehdus, kehittymistä vastaan, joita CCV-infektio aiheuttaa. Noudattamalla edellä kuvailtua menetelmää antigeenin tuottamiseksi infektoimalla soluviljemä, saadaan aikaan neste, joka sisältää tehokkaan määrän. Sellaista nestettä voidaan tyypillisesti laimentaa niinkin paljon kuin 1/10, ja se sisältää yhä tehokkaan määrän. Jokaisen rokoteannokeen kokonaistilavuus on tyypillisesti 0,5-2 ml, edullisesti 1-1,5 ml. Keksinnön mukainen rokote voidaan myös sekoittaa muiden rokotekomponenttien kanssa polyvalenttiseesa rokotteessa, esimerkiksi yhdessä muiden inaktivoitujen (tapettujen) tai heikennettyjen koiravirueten kanssa. Sellainen toinen rokotekomponentti on edullisesti toinen suolietotautia aiheuttava virus, kuten rotavirue tai parvovirus, tai se voi käsittää muita, niistä eristettyjä immunologisesti suojaavia antigeenejä. Monia sellaisia inaktivoituja ja heikennettyjä virusrokotteita ja antigeenejä tunnetaan. Edullinen polyvalenttinen rokote on kaksi komponenttia sisältävä rokote, joka käsittää yhdistelmänä keksinnön mukaisen rokotteen ja modifioidun, elävän tai tapetun parvoviruksen. Sellainen rokote sisältää rokotteeksi riittäviä määriä keksinnön mukaista solukytkeistä peplomeeriä ja modifioitua elävää tai tapettua parvovirusta Cesim. 6,3 Log 10 TCID 50 annosta kohti). Annoksen kokonaistilavuus on 0,5-2 ml, edullisesti 1-1,5 ml. US-patentisea tuodaan esille modifioitu, elävän koiran parvoviruerokote, mukaanlukien rokotekanta ja sen tehokkaita määriä sisältävä valmiete, joka voidaan yhdistää keksinnön mukaisen rokotteen kanssa, keksinnön mukaisen bivalenttisen rokotteen valmistamisekei.

14 13 '37531 Seuraavat esimerkit ovat keksintöä valaisevia mutta eivät rajoittavia. Esimerkki 1. Rokotteen valmistaminen. Koiran Coronavirus, kanta NL-18, eristettiin äkillisestä mahasuolitulehduksesta kärsivän koiraryhmän uloetenäytteestä. Alkueristys koiran munuaisen primäärisoluilla vaati 50 i ug dietyyliaminoetyyli(deae)-dekstraania per ml säilytysalustaa (perusalueta Eagle (BME) Earlen suolojen kanssa) (Grand Island Biological Co., Grand Ieland, New York). DEAE-dekstraania ei tarvittu jatkosiirroetuksisea. Virus adaptoitui soluviljelmään 4 siirrostuskierron aikana koiran munuaisen primäärieoluissa, ja vielä 36 siirrostuekierron aikana kissan munuaieen solulinjasea, joita käytettiin siirtotasoilla 73 päivää - 93 päivää. Gill, "Ieolation and Characterization of a Coronavirus," Doctoral Diesertation, University of Nebraeka, elokuu 1982, kuvailee CCV-kannan NL-18 eristämietä, jota aikaisemmin nimitettiin CCV-18-kannaksi. Pyöröpulloviljelmien siirroetueta varten virukeella, kissan munuaiesolulinjan solujen hyvin kiinnittyneen yksisolukerroksen kasvualusta dekantoidaan pois. Alusta korvataan eäilytysalustalla, johon on lisätty 4-8 % polybreneä <Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), joka sisältää 2-10 X virusta, joka sisältää laimentamattoman viruetiitterin vähintään 107,0 TCID 50 ml (0,2-1,0 MOI). Siirroetettuja viljelmiä inkuboi- 0 daan 9-16 tuntia C:sea. Infektio ilmenee tyypilli- senä sytopaattisena vaikutuksena (CPE) yksisolukerrokeeen, nimittäin, pyörietyneiden solujen muodostamina laikkuina. Inkuboinnin ja mikroskooppisen tarkastelun jälkeen, CPE:n varmistamiseksi, säilytysalusta dekantoidaan ja heitetään pois. Jokaiseen 500 ml pyöröpulloon lisätään 100 ml tilavuus Halein alustaa. Halein alusta käsittää Eaglen perusalustan (BME) varustettuna Hankin suoloilla (Grand Ieland Biological

15 Co., Grand Island, NY), johon on lisäty vielä 0,5 % laktalbumiinihydrolysaattia (Humko Sheffield, Memphis, Tennessee). 0 Viljelmiä jäädytetään sen jälkeen -50 C:sea 6 tunnin ajan. Sulamisen jälkeen lisätään binääristä etyleeni-imiini <BEI)- liuosta loppupitoisuuteen 1 % <til./til.) jäljelle jääneiden viruspartikkeleiden inaktivoimiseksi. BEI-liuos valmistetaan lisäämällä 2,05 g 2-bromietyyliamiinia ja 0,8 g natriumhydrok- 0 sidia 100 ml:aan vettä. Inaktivointia ylläpidetään C:ssa jatkuvasti sekoittaen aina kanden päivän inkuboinnin 0 verran. Inaktivointi lopetetaan lisäämällä kylmää <4 C) natriumtiosulfaattiliuosta siten, että natriumtiosulfaatin loppupitoisuudeksi tulee noin 0,25 % <paino/til.). Mertiolaattia lisätään eäilöntäaineeksi loppupitoisuuteen 1: Lopullinen rokote-erä valmistetaan sekoittamalla soluviljelyneste säilytysalustan kanssa, ja lisäämällä sen jälkeen apuaineekei etyleenimaleiinianhydridiä loppupitoisuudeksi 0,2 %. Rokotteen bulkkierä sisältää tyypillisesti 20 % soluviljelynestettä, 60 % säilytysalustaa ja 20 % apuaineliuosta, tilavuuden mukaan ilmoitettuna. Apuaineliuoe valmistetaan hydratoimalla etyleenimaleiinianhydridin <EMA 91, Moneanto, St. Louis, Missouri) kantaliuoe lisäämällä 10 N natriumhydroksidia. EMA-kantaliuos sisältää: Kemikaali Grammaa/litra NaC1 0,5 KH 2 PO 4 0,565 Na 2 HPO 4 0,135 EMA 91 10,0 Fenolipuna 0,135 Esimerkki 2. Suojatutkimus. CCV-71, joka oli neljännessä siirtovaiheessa koiran munuaieen primäärisoluilla, siirrettiin kerran A-72-solulinjaan (ATCC CRL 1542), jaettiin sopiviin tilavuuksiin, ja säilytettiin

16 C:ssa. Tätä virusta nimitettiin virulentiksi tartuttaja- 5,3 virukseksi, ja se standardoitiin sisältämään 10 TCID 50 /ml (Kanta CCV-71 on sama kuin ATCC VR-809. A-72-eolulinja saatiin ATCC:ltä siirtotasolla 33. Tällä siirtotasolla A-72-solut eivät olleet herkkiä CCV-infektiolle. Solulinjaa jatkettiin sarjassa yli 100 peräkkäistä siirtoa, ja sitä käytettiin siirtotasoilla CCV-lisäyksiin ja titrauksiin. Tällä siirtotasolla A-72-solulinja oli hyvin vastaanottavainen CCV:n kiinnittymiselle ja monistumiselle. Nuoria, terveitä pentuja <8-14 viikkoa vanhoja), joilla ei esiintynyt ELISA-vasta-ainetiittereitä CCV:lle, käytettiin kokeissa. Ne sijoitettiin eristyshäkkeihin koko koetestaukeen keston ajaksi. Kaikkiaan 20 pennulle annettiin kullekin kaksi 1 ml:n rokoteannosta, jotka oli valmistettu pääasiallisesti siten, kuin on kuvattu esimerkissä 1, ihonalaisesti, välin ollessa 21 päivää. Viisi pentua jätettiin rokottamatta tartutuskontrolleiksi. 20 rokotetusta ja 5 kontrollista otettiin verinäytteet rokotushetkellä. Niistä otettiin verinäytteet myös 21 päivää rokottamisen jälkeen (jolloin rokotetut uudelleenrokotettiin), 14 päivää toisen rokottamisen jälkeen (jolloin pennut tartutettiin) ja 14 päivää tartuttamisen jälkeen. Rokotetuille ja kontrolleille ei annettu ruokaa tuntia ennen tartutusta. Tartutue tapahtui siirrostamalla suun kaut- 5,3 ta 5 ml virulenttia tartutusvirusta <10 TCID 50 /ml). Hetkel- lä tuntia tartuttamisen jälkeen, tartutetut pennut palautettiin normaaliin ruokavalioaikatauluun. Tartutuksen jälkeen pentuja tarkkailtiin 14 päivää oireiden tai taudin tai reaktion osalta. Tarkkailujakson aikana ruumiinlämmöt mitattiin, ja verinäytteet otettiin valkosolulas-

17 kentaa varten. Ulostenäytteitä otettiin päivittäin 21 päivän ajan ulostevasta-aineen (suoliston IgA-vasta-aine) määrittämistä varten CCV:tä vastaan. Jokaisen rokottamisen jälkeen kaikki pennut pysyivät terveinä ja normaaleina. Taulukossa 4 esitetään pentujen VN-vastaainetiitterit hetkillä ennen rokottamista, ennen toista rokottamista ja ennen tartuttamista. Kaikki pennut olivat VNseronegatiivisia ensimmäisen rokottamisen hetkellä, ja pysyivät negatiivisina, kun toinen annos annettiin. Tartutushetkellä <kaksi viikkoa toisen rokottamisen jälkeen), VN-tiitterit vaihtelivat 0-16, geometrisen keekitiitterin ollessa 5. Taulukossa 5 kuvataan pentuja ja verinäytteenottopäivämääriä kuten taulukossa 4, mutta käyttäen ELISA-määrityetä vastaainetiitterien määrittämiseen. Pennut olivat seronegatiivisia ensimmäisellä rokottamiehetkellä, ja vain 7 näistä osoitti vasta-ainevaeteen toisella rokottamishetkellä. Tartuttamishetkellä kaikilla pennuilla ilmeni hyvät ELISA-vasta-ainetiitterit. 14 päivää tartuttamisen jälkeen, tartutuskontrollipentujen geometrinen keski-elisa-vasta-ainetiitteri oli 3880, kun taas rokotettujen geometrinen keski-elisa-vasta-ainetiitteri oli ' (taulukko 5). Rokotettujen elimistön neeteisiin liittyvä korkea vasta-ainetiitteri johtuu rokottamisesta ja hyvästä sekundäärivasteesta tartuttamisen jälkeen, ja osoittaa suojan olemassaolon. Tartuttamisen jälkeen joillakin rokotetuilla eläimillä oli lyhyitä tai ohimeneviä kliinisiä oireita, vaihdellen ruokahaluttomuudesta oksentamiseen. Tartutuskontrollipennuilla oli merkkejä ruokahaluttomuudesta vain tartuttamisen jälkeen. Näitä oireita havaittiin yleensä päivinä 6-10 tartuttamisen jälkeen. Tartutuskontrollipennuilla todettiin enemmän kliinisiä oireita kuin rokotetulla ryhmällä.

18 Valkoisten verisolujen määriä seurattiin päivittäin tartuttamisen jälkeen taudin arvioimiseksi. Mitään merkitsevää valkosolujen vähäisyyttä ei todettu rokotetuissa eikä tartutuskontrollipennuissa. Lievää valkosolujen runsautta esiintyi tartutuskontrollipennuissa alkaen päivän 9 kohdalla ja jatkuen päivään 13 asti.

19 Taulukko 4 Pääsiirroksen immunogeenisyystesti Neutraloivat virusvasta-ainetiitterit Neutraloivat viruevasta-ainetiitterit Pentu Ennen rokot- Ennen 2. Ennen tar- Tartuttami- nro tamista rokottamieta tuttamista sen jälkeen Rokotetut 1 DE DE DE DE DE DE DE DE DE DE F F F F F F F F F F Geometrinen keskiarvo

20 Taulukko 4 (jatkoa) Pääsiirroksen immunogeenisyystesti Neutraloivat virusvasta-ainetiitterit Neutraloivat virusvasta-ainetiitterit Pentu Ennen rokot- Ennen 2. Ennen tar- Tartuttami- nro tamista rokottamista tuttamieta sen jälkeen Kontrollit 2 DF-53 ND ND 0 64 DF-54 ND ND DF-55 ND ND DF-56 ND ND DF-57 ND ND 0 64 Geometrinen keskiarvo Vasta-ainetiitteri ilmaistuna suurimman seerumilaimennuksen käänteisarvona osoittaen täydellistä neutralointia. 2 Ei määritetty.

21 20 r37531 Taulukko 5 Pääsiirroksen immunogeenieyysteeti Neutraloivat ELISA-vasta-ainetiitterit Neutraloivat ELISA-vasta-ainetiitterit Pentu Ennen rokot- Ennen 2. Ennen tar- Tartuttami- nro tamieta rokottamieta tuttamieta sen jälkeen Rokotetut 1 DE > DE > DE > DE DE > DE DE > DE DE > DE F > F > F > F F > F > F > F F > F > Geometrinen keskiarvo > 19106

22 Taulukko 5 (jatkoa) Pääsiirroksen immunogeenisyystesti Neutraloivat ELISA-vasta-ainetiitterit Neutraloivat ELISA-vasta-ainetiitterit Pentu Ennen rokot- Ennen 2. Ennen tar- Tartuttami- nro tamista rokottamista tuttamista sen jälkeen Kontrollit 2 DF-53 ND ND DF-54 ND ND DF-55 ND ND DF-56 ND ND DF-57 ND ND Geometrinen keskiarvo Vasta-ainetiitteri, ilmaistuna sen seerumilaimennoksen käänteisarvona, jossa ero absorbanssissa 410 nm:ssä coronaviruksen sisältävien mikrotiitterilevykuoppien ja solukontrollin sisältävien kuoppien välillä on )P0,05. 2 Ei määritetty.

23 Ruumiinlämpöreaktiota tartuttamisen jälkeen seurattiin kliinisen CCV-taudin parametrina. Lämpotilareaktio ilmeni tartuttamisen jälkeen sekä rokotetuilla että kontrolleilla. Lämmön suhteellinen kohoaminen oli dramaattisempaa kontrolleilla kuin rokotetuilla. Lämmön kohoaminen ei ollut riittävän korkea aiheuttaakseen merkitystä. Lämpötilaprofiili kontrollipennuilla näyttää olevan kaksivaiheinen sekundäärisen lämpötilareaktion ilmetessä 10 päivässä tartuttamisen jälkeen. Tällainen kaksivaiheinen lämpötilaprofiili on todettu aikaisemmin pennuilla, jotka on tartutettu virulentilla CCV:llä. Kontrolleilla ei todettu sellaista kaksivaiheista lämpötilareaktiota. ELISA-määritys kehitettiin mittaamaan suoraan rokotettujen pentujen ruoansulatuskanavaan tuotettu suoja vasten ruoansulatuskanavan infektiota virulentilla CCV-tartutuksella. Taulukossa 6 esitetään anti-ccv-iga-määrityksiä, jotka on tehty päivittäin tartutuksen jälkeen. Anti-CCV-IgA pysyi peruslinjan tasoilla tai lähellä niitä. Anti-CCV-IgA:n merkitsevä lisääntyminen rokotetuilla, alkaen 7. päivänä tartuttamisen jälkeen, johtuu suoliston limakalvopintojen parenteraalisesta esikäsittelystä apuaineisella inaktivoidulla CCV-rokotteella. Suun kautta tapahtuva tartuttaminen stimuloi limakalvon IgA-muistireaktion paljastaen merkitsevän anti-ccv-iga-vasteen ruoansulatuskanavassa. Tämä korkea IgA-vaste on riittävä suojaamaan infektiota vastaan. Tartutetuilla kontrolleilla oli vähän tai ei lainkaan anti- CCV-IgA-vastetta, osoittaen esikäsiteltyjen muistisolujen puutteen ja suojan puutteen. Tämä esimerkki osoittaa, että CCV-rokote, joka sisältää solukytkeisen CCV-peplomeerin, suojaa CCV-infektion aiheuttamaa tautia vastaan.

24 4. 0 a Pentu no Rokotetut S 6 7 Taulukko 6 Iääsiirroksen immunogeenisyystesti Ulosteen anti-ccv-immunoglobuliini A Päiviä tartuttamisen jälkeen DC i DE Dt CC DE DL DC DE DE DE F F F F F ].23 F C, 4 F AW F *7 r Keskiarvo Kontrollit p -s : _.06.0* OF _ Dr , pr fi I rvw * oe

25 Esimerkki 3. Yhdistelmärokote. Bivalenttieta rokotetta, joka sisälsi keksinnön mukaista CCVrokotetta ja modifioitua elävää koiran parvovirus-rokotetta <6,3 Log i TCID 50 /annos) annettiin kuudelle vastaanottokykyiselle pennulle, 9-12 viikkoa vanhoille. Kolmen viikon kohdalla rokottamisen jälkeen, pentujen geometrinen keski-elisa-vasta-ainetiitteri CCV-fraktiolle oli 113, ja geometrinen keski-vn-tiitteri CPV-komponentille oli 912. Tällä kohdalla pennut saivat toisen annoksen yhdietelmätuotetta. Kaksi viikkoa toisen rokottamisen jälkeen, CCV geometrinen keski-elisa-vasta-ainetiitteri oli 3620 ja CPV geometrinen keski-vn-tiitteri oli Toinen kuuden vastaanottavaisen pennun ryhmän rokotettiin monovalenttiaella, modifioidulla elävällä CPV-rokotteella <6,3 Log 10 TCID 50 ). CPV modifioitiin solueiirron avulla. Kolme viikkoa rokottamisen jälkeen, pentujen geometrinen keski-vnvasta-ainetiitteri CPV:lle oli Tässä vaiheessa pennut saivat toisen annoksen CPV-rokotetta. Kanden viikon kohdalla toisen rokottamisen jälkeen CPV geometrinen keski-vn-tiitteri oli Eri verinäytteenottojen seerumien CCV-tiittereitä seurattiin, ja niiden todettiin olevan negatiivisia tämän kokeen kestäessä. Yhtä pentua lukuunottamatta, kaikilla pennuilla oli hyvä CPVvaate. Kaikilla pennuilla, paitsi tuolla yhdellä, oli yhtä hyvä CPV-vaate joko yhdessä CCV:n kanssa tai monovalenttieena tuotteena. Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukaista CCV-rokotetta voidaan käyttää yhdessä muiden rokotekomponenttien kanssa, ja erityisesti koiran parvoviruerokotekomponentin kanssa.

26 Vaikkakin keksintöä ja sen edullisia suoritusmuotoja tuodaan täysin esille edellä, tulisi ymmärtää, että keksintö sisältää kaikki suoritusmuodot ja modifikaatiot, jotka sisältyvät seuraavien patenttivaatimusten piiriin.

27 Patenttivaatimukset 1. Menetelmä rokotteen tuottamiseksi eläinten suojelemiseksi taudilta, jonka aiheuttaa koiran Coronavirusinfektio (CCV), tunnettu siitä, että menetelmä käsittää: a. infektoidaan soluviljelmä CCV:n infektiopaljousluvulla (MOI) 0,2-2,0; b. kasvatetaan soluja 6-18 tuntia; c. heitetään pois käytetty nestemäinen kasvualusta; d. rikotaan solut; e. otetaan talteen solukytkeinen peplomeeriprot.eiini hajotetuista soluista; ja f. sekoitetaan solukytkeinen peplomeeri parenteraalisesti hyväksyttävän kantajan kanssa. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii- tä, että solut hajotetaan parenteraalisesti hyvaksyttävässä nesteesså, ja vaiheet. (e) ja (f) siten yhdistetään. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet- tu siitä, että lisäksi sekoitetaan solukytkeisen peplomeeriproteiinin sisältävä kantaja apuaineen kanssa.

28 Patentkrav 1. Förfarande för producering av ett vaccin för att beskydda djur för sjukdom förorsakad av hundens Coronavirusinfektion (CCV), kännetecknat av att man: a. infekterar cellkultur med CVV's infektionsmångdtal (MOI) 0,2-2,0; b. odlar celler 6 till 18 timmar; c. kastar bort begagnat flytande mediet; d. sönderdelar celler; e. utvinner cell-associerad peplomerprotein från sönderdelade celler; f. blandar cell-associerad peplomer med en parenteralisk acceptabel bårare. 2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att man söderdelar celler i en parenteralisk acceptabel våtska, och stegerna (e) och (f) sålunda kombineras. 3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, kännetecknat av att man tillblandar bårare som innehåller cell-associerad peplomerprotein med adjuvant.