S U O M I- F I N L A N D (FI)

Transkriptio

1 ( B ) ( 11) KUUWTUSJULKA I SU UTLAGGN I NG S SKR I FT '. - (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 A 61K 39/09, C 12N 1/20 (21) Patenttihakemus - Patentansökning S U O M I- F I N L A N D (FI) Patentti- je rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US86/01460 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P (71) Hakija - Sökande 1. Cornell Research Foundation Inc., East Hill Plaza, Ithaca, N.Y , USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Timoney, John F., 120 Ludlowville Road, Lansing, N.Y , USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä Streptococcus equi -kannan valmistamiseksi Förfarande för framställning av Streptococcus equi -stammen (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganism: ATCC ATCC (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksintö koskee uutta rokotetta, joka suojaa hevosia S. equitä vastaan, joka aiheuttaa pääntautia. Rokote tuottaa taudille alttiiseen hevoseen immuunivasteen nenänieluun aikaansaamalla vasta-ainereaktiivisuutta nenänielun limaan. Rokote on S. equi-kanta, joka sisältää M-proteiinifragmentin, jonka molekyylipaino on , ja jota voidaan antaa hevosille joko nenänsisäisesti tai suun kautta. Keksintö tarjoaa uuden S. equi (709-27)-kannan ja menetelmän hyödyllisen rokotteena käytettävän S. equi-bakteerikannan valmistamiseksi ja eristämiseksi, joka kanta tuottaa immuunivasteen taudille alttiiden hevosten nenänielun limakalvossa. Uppfinningen avser en ny vaccin som skyddar hästar mot S. equi, som förorsakar en huvudsjukdom. Vaccinen stimulerar ett nasofaryngealt immunsvar i en häst utsatt för sjukdomen genom frambringande av antikroppaktivitet 1 nasofaryngeal slem. Vaccinen är en 5. equistam innehållande en M-proteinfragment med molekylvikten och som kan administreras tili hästar antingen intranasalt eller oralt. Uppfinningen avser en ny S. equi (709-27)-stam, och ett förfarande för framstallning och isolering av en nyttig, som vaccin användbar S. equi-bakteriestam, vilken stam stimulerar ett immunsvar i nasofaryngeal slemhinna av hästar utsatta för sjukdomen.

2 Menetelmä Streptococcus equi -kannan valmistamiseksi Keksintö koskee menetelmåå sellaisen Streptococcus equi -kannan valmistamiseksi, joka on avirulentti hevosille. S. equi aiheuttaa hevosen pååntaudin, joka on hevosilla esiintyvä äkillinen hengitystiesairaus, jolle on tunnus- omaista kuume, vuoto sieraimista ja mårkåpesåkkeiden muodostuminen nieluntakaisiin ja alaleuanluun imusolmukkeisiin. Hevoset, jotka ovat saaneet tällaisen pååntauti-infektion luonnossa tai kokeellisesti, ja jotka ovat toipuneet pååntaudista, ovat tulleet hyvin vastustuskykyisiksi taudin suhteen. Lisäksi on niin, että luonnossa on tavattu vain yhtä antigeenityyppiå edustavaa S. equita. Edellä sanotusta huolimatta S. equi -bakteriineista tai niiden uuttamalla saaduista jakeista, kuten M-proteiinirikkaista uutteista, valmistetut rokotteet ovat olleet suhteellisen tehottomia saamaan aikaan suojausta S. equita vastaan luonnossa. Tåmå pitåå paikkansa, vaikka P.O. Bazeley jo vuonna 1943 julkaisemassaan artikkelissa ("Studies with Equine Streptococcus", Australian Veterinary Journal 1k:62) esitti laajan tätä ongelmaa koskevan tutkimuksen sellaisten koetulosten tukemana, joita tri Bazeley ja muut luonnehtivat hyvin toiveita herättäviksi. Vuosia on kuitenkin kulunut ilman, että olisi tarjolla riittåvå tai tehokas menetelmä tai välikappale hevosten suojaamiseen pååntaudilta. Eräs aiempiin kenttäkokeisiin liittyvä ongelma oli se, että tiedemiehet ja tutkijat samaistivat hevosen suojaamisen S. equita vastaan siihen, että hevosen veriseerumissa stimuloitui vasta-aineiden tuotanto bakteeria vastaan. Tosiasiassa rokotteiden epäonnistuminen ei johtunut niiden kykenemåttömyydestå stimuloida bakteerin vasta-aineiden syntymistä seerumiin, sillä voitiin osoittaa, etteivät nåmå vasta-aineet suojanneet S. equin aiheuttamalta taudilta luonnossa tai koeolosuhteissa. Tosiasiassa havaittiin, että vastikåån

3 kokeellisesti aiheutetusta pääntaudista toipuneet ponit olivat hyvin vastustuskykyisiä uudelle tartunnalle jo ennenkuin seerumista voitiin havaita bakteerin vastaaineita. Lisäksi voitiin määrittää, että vastustuskykyisten ponien nenänielun limakalvo sisälsi pääasiallista IgG- ja IgA-vasta-aineaktiivisuutta vain yhtä happouutteen proteiinia vastaan, jonka molekyylipaino oli noin , kun taas seerumin vasta-aineissa oli useampia spesifisiä vasta-aineita. Nämä havainnot viittasivat siihen, että onnistunut rokottaminen vaatii nenänielun immuunivasteen stimulointia. Tämän keksinnön tekijä on kirjoittanut seuraavat tähän kehitystyöhön liittyvät julkaisut: 1) Tiivistelmä no. 172, Abstracts, IXth Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Fuji, Japan, September 10, 1984; 2) Infection and Immunity, March 1985, Vol 47, No. 3, ss ; 3) Infection and Immunity, April 1985, Vol. 48, No. 1, ss Kuva 1 esittää käyrän muodossa omissa koordinaatistoissaan 14 ponin sierainten huuhteluissa saatujen liuosten IgA- ja IgG-vasta-ainetiittereitä sen vuorokausimäärän funktiona, joka on kulunut S. equi :11ä tapahtuneesta immunisoinnista. Radioimmunomäärityksessä käytetyt antigeenit olivat S. equin happouuteproteiini ja viljelmän supernatantin (luontainen muoto) proteiini. Kuvan 2 käyrästö esittää 40 hiiren ryhmissä ilmenevää kumulatiivista kuolleisuutta sen vuorokausimäärän funktiona, joka on kulunut infektoinnista, kun ryhmien hiiret olivat S. equi :11ä tai S. equi :n happouutteella rokotettuja tai edustivat immunisoimatonta vertailuryhmää.

4 Kaikille hiirille annettiin årsykkeenä 5 x 10 7 CFU:ta (CFU = colony forming unit, pesäkkeenmuodostusyksikk6) virulenttia S. equi CF32:ta. Kuvan 2 esittåmå informaatio on tårkeåtå, koska se osoittaa, ettå S. equi kantaa ehjåå M-proteiinia, joka on samanlainen kuin S. equi CF32 -peruskannan proteiini. Kuva 3 on immunoblot-kuvio, joka esittåå ponin nenånielun liman ja seerumin IgG:n ja IgA:n tunnistamia S. equin ja S. zooepidemicusin proteiineja (SDS-PAGE) sen jälkeen kun on suoritettu nenånsisäinen rokotus S. equi :11å. Tåplåt käsiteltiin nenånielun limalla tai seerumilla ja sen jälkeen ne pestiin hevosen IgA:ta tai IgG:tå vastaan kohdistuvassa monospesifisesså seerumissa. Kaistat: A - S. zooepidemicusin happotuute B - S. equin (CF32) happouute C - S. equin (CF32) viljelmån emåliuoksen proteiini S. zooepidemicusin antigeenit sisållytettiin myös mååritykseen, koska useimmilla hevosilla on tämä organismi nenånielussaan, ja nåin ollen ne ovat stimuloituneet tuottamaan vasta-aineita sen proteiineille, joista jotkin ovat samoja kuin S. equilla. Kuvissa esitetty mittaustekniikka on sama kuin seuraavissa julkaisuissa kuvattu: a) Infection and Immunity, Vol. 47, No. 3, ss (March 1985); b) Infection and Immunity, Vol. 48, No. 1, ss (April 1985). Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on annettu oheisissa patenttivaatimuksissa. Esillå oleva keksintö tarjoaa tavan, jolla voidaan stimuloida nenånielun immuunivastetta esimerkiksi kåyttåmållå bakteerikloonia, joka on johdettu voimakkaan virulentista S.

5 equi -kannasta, jonka nimi on S. equi CF32, ja joka on talletettu American Type Culture Collection -kokoelmiin, Rockville, Maryland, numerolla ATCC No ja vapaasti yleisön saatavissa tämän patenttihakemusjulkaisun julkiseksi tulosta lähtien. CF32 tuottaan suuria (1-3 mm) låpikuultavia, limaisia pesäkkeitä, joilla on taipumus virrata yhteen, ja joita ympäröi laaja (5-10 mm) beeta-hemolyysivyöhyke. American Type Culture Collection -kokoelmiin on myös talletettu S. equi CF32:n johdannainen, joka on tehty avirulentiksi esillä olevan keksinnön mukaisesti. Kyseinen avirulentti S. equi -bakteeri tunnetaan nimellä Cornell S. equi ja se on saatavissa ko. kokoelmista numerolla ATCC Cornell tuottaa pieniä (halkaisija 0,5 mm) valkoisia, kuperia, sileäpintaisia pesäkkeitä, joita ympäröi kapea (1 mm) beeta-hemolyysivyöhyke. Virulentti S. equi -kanta voidaan muuntaa avirulentiksi millä tahansa menetelmållå, kunhan näin syntynyt avirulentti S. equi -kanta on såilyttånyt M-proteiinifragmentin, jonka molekyylipaino on noin , ja joka stimuloi samanlaisen immunologisen vasteen hevosen nenånielulimaan kuin sellaisella hevosella on, joka on toipunut S. equin aiheuttamasta pååntaudista. Tällä hetkellä etusijalle asetettava menetelmä on tarkoituksellisesti aikaansaatu mutaationmuodostus esimerkiksi kemikaaleja tai såteilytystå käyttämällä. Kemiallinen mutatointi, esimerkiksi nitrosoguanidiinia käyttämällä, on erityisen hyödyllinen. (ks. kappale 13, Gene Mutation, Manual of Methods of General Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1981). Happouuteproteiini eristetään menetelmillä, joita on selostettu julkaisussa R.C. Lancefield, "The Antigenic Complex of Streptococcus Hemolyticus I Demonstration of a Type Specific Substance in Extracts of Streptococcus Hemolyticus", J. Exp. Med. 47:91. Proteiinin molekyylipaino mååritetåån SDS-PAGE-elektroforeesilla ja käyttämällä molekyylipainostandardeja.

6 M-proteiinirikkaat uutteet olivat suhteellisen tehottomia, koska ne eivät stimuloineet taudille alttiin hevosen nenänielun immuunivastetta, vaikka ne kykenivätkin saamaan aikaan immuunivasteen eläimen veriseerumissa. Jotta vaadittava vaste saataisiin stimuloiduksi,tarjoaa esillä oleva keksintö menetelmän sellaisten avirulenttien S. equi-bakteerien valmistamiseksi, joita voidaan käyttää rokotteena joko nenänsisäisesti tai suun kautta annettuna, jolloin rokote tuottaa pääasiallisesti IgG- ja IgA-vasta-ainevasteen taudille alttiin hevosen nenänielun limaan. Avirulentti S. equi (cornell )-kanta edustaa tällaista bakteeria. Tästedes tuota erityisvalmisteista bakteeria kutsutaan S. equi (Cornell ):ksi. Menetelmä tehokkaan avirulentin rokotekannan valmistaminen S. equista S. equi ( c n )-kanta, jok,t on dvilulvidli hii- rille ja poneille, saatiin seuraavalla tavalla: Lähtöbakteerina käytetty S. equi CF32 saatettiin alttiiksi nitrosoguanidiinin mutatoivalle vaikutukselle noudattamalla B.C. Carltonin ja B.J. Brownin artikkelissaan (1981) selostamia menetelmä, joka artikkeli sisältyy käsikirjaan Manual of Methods for General Bacteriology (toim. P. Gerhardt et al.), American Society for Microbiology, Washington, D.C., s Noudatettiin sivun 226 ensimmäisessä sarakkeessa esitettyä menetelmänmuunnosta. kemmin sanottuna kaikissa toimenpiteissä käytettiin Todd-Hewitt-ravinnelientä kasvualustana. Kapselittomien pesäkkeiden virulenssinmenetys seulottiin antamalla niitä hiirille (ICR) vatsaonteloon. Kannat, jotka eivät Tar- tappaneet hiiriä, katsotiin positiivisiksi kannoiksi. Hiirissä positiivisiksi osoittautuneita kantoja käytettiin sitten hiirten rokottamiseen vatsaontelonsisäisesti, jotta niiden positiivinen laatu saatiin määritetyksi. Ne kannat, jotka suojasivat hiiriä, siirrostettiin hevosiin nenänsisäisesti. Lopuksi, kuten tässä julkaisussa on se-

7 lostettu, S. equi johdannaiskannan havaittiin olevan avirulentti annoksena 3 x 10 9 pesäkkeenmuodostusyksikköä (engl. colony forming unit, CFU) ja tehokas rokotteena S. equita vastaan tartunnalle alttiissa hevosissa, kun sitä annettiin hevosille nenänsisäisesti tai suun kautta. Lisäksi positiivisesta kannasta, joka suojasi myös hevosia, löydettiin immunoblottauksella M-proteiinifragmentti, -jonka molekyylipaino on Tuon kannan tunnistusnumero on S. equi S. equi (Cornell )-kannan happouutteen havaittiin immunoblottauksen perusteella sisältävän samoja immunologisesti reaktiivisia proteiineja kuin S. equi-peruskannan (CF32). ImmunoblollausmeneUelmä oli sama kuin se, joka on selostettu artikkelissa sivuilla aikakauslehdessä Infection and Immunity, Vol. 48, No. 1 (April 1985). Hevosten immunisointi ja infektointi Tämän jälkeen S. equi (Cornell )-kannan tehokkuutta rokotteena hevosille kokeellisesti aiheutettua S. equiinfektiota vastaan testattiin. Saadut koetulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

8 Taulukko 1. Ponien vastustuskyky nenän kautta saadulle Streptococcus equi-infektiolle kun ne on ensin immunisoitu nenän kautta annetulla avirulentilla S. equi kannalla Käsittely Infektointi Ponien Vastusluku- tusky- (rokotus S. (CFU:ta virulentmäärä kyisten equi :11ä) tia S. equi CF32:ta) lukumää- 3 x x rä 14 vrk:ina 0 ja 30 vrk:ena 59 kontaktivertailuryhmä 2 2 eristetty vertai- IP luryhmä 6 0* *Kaikki vertailuryhmän eläimet kehittivät äkillisen pääntaudin 4 vuorokauden kuluessa infektoinnista Neljälletoista vuoden ikäiselle ponille, jotka oli kasvatettu eristyksessä eivätkä koskaan olleet olleet alttiina S. equille, annettiin suihkeen muodossa (nenänsisäisesti) 18-tunnin viljelmää (3 x 10 9 CFU), joka oli Todd-Hewitt-liemessä. 29 vuorokautta myöhemmin annettiin tämä annos Loisen kerran. Ponit infektoitiin 30 vuorokautta myöhemmin 5 x 10 8 CFU:lla yön yli kasvatettua S. equi CF32-viljelmää. Viljelmät annettiin nenäsumuttimen avulla (malli no. 281, Devilbiss Co., Somerset, PA). Kuudelle rokottamattomalle ponille, joita pidettiin erillään rokotetusta ryhmästä, ja kandelle kontaktissa olleelle vertailuponille annettiin edellä mainittu CF32-tartutusannos. Kaikki immunisoidut ponit ja 2 kontaktissa ollutta vertailuponia olivat vastustuskykyisiä S. equilla aiheutetulle tartunnalle, mutta kaikki eristetyn vertailuryhmän ponit kehittivät äkillisen pääntaudin 4 vuorokauden kuluessa infektoinnista. Lisäksi noin 800 hevosta maatiloilla, joilla oli endee-

9 misiä S. equi-infektio-ongelmia, rokotettiin nenänsisäisesti tai suun kautta S. equi :11ä ja tähän mennessä vain kandelle hevoselle on kehittynyt pääntauti. Kolmen aiemman vuoden kokemuksiin perustuen olisi noilla maatiloilla pitänyt ilmetä pääntauti noin 40 %:lla hevosista. Käytettäessä tämän keksinnön perustana olevaa menetelmää hevosten rokottamiseen S. equita vastaan on osoittautunut, että suun kautta tapahtuva rokotus vastaa nenänsisäistä rokotusta samana annoksena. Rokoteannos (organismien lukumäärä) tässä selostetussa rokotuksessa oli 100 kertaa suurempi kuin villin, virulentin S. equi-kannan (CF32) lukumäärä annoksessa, jonka viimeksimainitun annoksen odotettaisiin aiheuttavan sairauden normaalissa hevosessa. Kuitenkin kaupallisessa S. equi-rokoteohjelmassa tultaisiin käyttämään valmistajan ja kyseeseen tulevien hallintoelinten välisissä neuvotteluissa määritettyjä annostuksia. Syväjäädytys tai kylmäkuivaus eivät vaikuta rokotteeseen haitallisesti. Näin ollen näitä menetelmiä voidaan käyttää rokotteen massatuotannossa ja jakelussa. Rokotteen ei ole havaittu aiheuttavan mitään sivuvaikutuksia täysikasvuisille eläimille, mutta 3 kuukauden ikäisillä varsoilla esiintyi vähäisessä määrin (n. 5 %:lla) leuanalaisia märkäpesäkkeitä. Tämä ei-toivottu reaktio ilmeni, kun annettiin hyvin suuri rokoteannos tarkoituksena saada aikaan yhdenmukainen serokonversio rokotteen saaneissa hevosissa. Kuten jo muussa yhteydessä on mainittu, aiheutuu immunologinen suojaus alttiina olevien eläinten nenänielun liman sisältämistä vasta-aineista. Vasta-ainemääritykset - kuva 1 S. equi (CF32):n IgA- ja IgG-vasta-aineet määritettiin

10 seerumeista ja sieraintenhuuhteluliuoksista ennen rokotusta tai infektointia, niiden aikana ja jälkeen. Määritykset suoritettiin kiinteässä faasissa tapahtuvalla radioimmunologisella menetelmällä (G. Mancini, A.O. Carbonara ja J.H. Heremans, Immunochemical Quantitation of Antigens by Single Radial Immunodiffusion, Immunochemistry 2, ss Kolot päällystettiin S. equin happouuteproteiinilla (AE) tai viljelmän emäliuosproteiinilla (CS). Kaikkien rokotettujen eläinten sieraintenhuuhletuliuoksista löydettiin S. equin happouutteen ja viljelmän emäliuoksen proteiinien IgA- ja IgG-vasta-ainevasteet (kuva 1). Seerumeissa havaittiin myös vasta-ainevasteet, mutta ne olivat epäyhtenäisiä. Kontaktissa olleiden ponien sieraimista ja seerumista löydettiin vasta-ainekonversio samanaikaisesti - viite siitä, että rokotekannan läpäisy oli tapahtunut ryhmässä. Rokotetutja kontaktissa olleet ponit olivat vastustuskykyisiä virulentilla S. equilla suoritetulle infektoinnille, kun taas rokottamattomissa poneissa kehittyi tyypillinen pääntauti neljän vuorokauden kuluessa infektoinnista (taulukko 1). Hiirten immunisointi ja infektointi - kuva 2 Hiiri on jo historiallisesti ollut mallina S. equi-infektion immunologialle. Näin ollen rinnakkaisena suoritettavaa tehokkuuskoetta varten aikuiset ICR-hiiret immunisoitiin subkutaanisti S. equi :n happouutteesta saadulla, hydroksiapatiitilla puhdistetulla proteiinilla. Tässä yhteydessä viitataan julkaisuun K.L. Vosti, Journal of Med. Microbiol. 11:453 (1978): Proteiini absorboitiin alumiinihydroksidiin ja annettiin subkutaanisti kahtena 50 pg:n annoksena 21 vuorokauden välein. Kaikki hiiret, joukko rokottamattomia verrokkeja mukaanluettuna, infektoitiin myöhemmin virulentilla S. equilla (5 x 10 7 CFU), joka annettiin vatsaonteloon. Hiirten kuolleisuus merkittiin muistiin 7 vuorokauden kuluttua infektoinnista.

11 Ero verrokkiry män ja rokotetun ryhmän kuolleisuudessa oli erittäin merkitsevä tilastotieteessä käytetyn khin neliöanalyysin perusteella laskettuna. Joko S. equi :n happouutteella lai elävillä soluilla immunisoiduissa hiirissä ilmeni merkitsevä suojaava vaste (todennäköisyys = 0,01) verrattuna rokottamattomiin verrokkeihin (kuva 2). Saatu tulos viittasi siihen, että S. equi oli säilyttänyt S. equin suojaa antavan antigeenin M. Vaikka S. equi ei ollutkaan virulentti, sen happouutteen havaittiin immunoblottauksen perusteella sisältävän samoja immunologisesti reaktiivisia proteiineja kuin S. equi-peruskannan. Kuva 3: Immunoblottaus, joka osoittaa liman ja seerumin vasta-aineiden tunnistamat proteiinit Immunologisesti reaktiiviset proteiinit, joita oli S. equin happouutteessa ja viljelmän emäliuoksessa ja S. zooepidemicusin happouutteessa, blotattiin nitroselluloosalle SDS- PAGE-geeleistä. Blotit käsiteltiin seerumilla tai nenänielun limalla, jotka oli kerätty 7 vuorokautta infektoinnin jälkeen surmatuilta poneilta. Tämä määritysteknikkka on selostettu julkaisussa Infection and Immunity, Vol. 47, No. 3, ss (March 1985). Immunoblottaus paljasti, että rokotettujen eläinten nenänielun liman IgA- ja IgG-vasta-aineet kohdistuivat pääasiassa M - proleiinifraymenttiin (molekyylipaino ), kun taas seerumin vasta-aineilla oli paljon laajempi spektri, mikä havainto on tehty jo aiemmin poneilla, jotka ovat toipuneet kokeellisesti aikaansaadusta pääntaudista. Koska vasta-ainevaste, joka kohdistuu M-proteiinifragmenttiin, jonka molekyylipaino on , on vakioominaisuus vastustuskykyisten hevosten nenänielun immuunivasteessa, on se tärkeä suojaava antigeeni.

12 Vasta -ainevaste on myös ominainen S. equille, sillä vastaavasti reagoivia S. zooepidemicusin proteiineja ei voitu havaita immunoblot-kuviossa (kaista A). Muut tutkimukset ovat viitanneet siihen, että voimakkaasti bakterisidiset seerumit reagoivat voimakkaasti M-proteiinifragmenttien kanssa, joiden molekyylipaino on noin ja Hypoteesi sille, miksi seerumin ja nenänielun vasta-aineet tunnistavat S. equin molekyylipainoltaan erilaiset proteiinifragmentit, on se, että S. equin M-proteiinimolekyylin se osa tai alue, joka on tärkeä nenänielun vasteessa, eroaa siitä, joka aiheuttaa bakterisidisen vasta-aineen stimuloitumisen seerumissa. Tiivistetysti sanottuna, esillä oleva keksintö tarjoaa uuden ja paremman rokotteen, jolla voidaan suojata hevoset pääntautia aiheuttavaa S. equita vastaan. Rokote stimuloi taudille alttiiden hevosten neneänielun immuunivastetta siten, että nenänielun limaan ilmestyy vasta-ainetta. Rokote on S. equi-kanta, joka sisältää M- proteiinifragmentin, jonka molekyylipaino on , ja on saatettu sellaiseen muotoon, että se voidaan an- taa hevosille rokotteena joko nenänsisäisesti tai suun kautta. Esillä oleva keksintö koskee uutta menetelmää hyödyllisen, rokotteena toimivan S. equi-bakteerikannan aikaansaamiseksi ja eristämiseksi, joka bakteerikanta stimuloi vasta-ainevasteen taudille alttiiden hevosten nenänielun limakalvossa. Huomattakoon, että tässä selostetut tämän keksinnön toteutustavat ovat vain tämän keksinnön periaatteiden soveltamista valaisevia. Selostettujen toteutustapojen yksityiskohdilla ei ole tarkoitus rajoittaa patenttivaatimusten kattamaa alaa, sillä patenttivaatimukset määrittelevät tämän keksinnön kannalta oleelliset seikat.

13 Patenttivaatimukset Menetelmä sellaisen Streptococcus equi -kannan aikaan- saamiseksi, joka on avirulentti hevosille, tunnettu siitä, että se sisältää seuraavat vaiheet: 1) saatetaan virulentti S. equi CF32 -kanta (ATCC 53185) alttiiksi mutaationmuodostukselle käsittelemällä kemiallisella mutageenilla tai säteilyllä, ja 2) valitaan saatu avirulentti ja suojaava kanta tutkimalla kapselittomia pesäkkeitä ja valitsemalla kanta, joka on avirulentti, sisältää M-proteiinifragmentin, jonka molekyylipaino on ja saa aikaan S. equi -vasta-ainevasteen. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virulentti Streptococcus equi -kanta mutatoidaan kemiallisesti indusoidulla mutageneesilla tai säteilyindusoidulla mutageneesilla. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virulentti S. equi -kanta mutatoidaan käsittelemällä nitrosoguaniinilla ja avirulentti ja suojaava kanta valitaan tutkimalla kapselittomia pesäkkeitä ja valitsemalla kanta, joka on avirulentti hiirille vatsakalvonsisäisesti annettaessa, suojaa hiiriä virulenttia kantaa vastaan, ja joka sisältää M-proteiinifragmentin, jonka molekyylipaino on noin ja joka aikaansaa S. equi -vasta-ainereaktion. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu sii- tä, että avirulentti S. equi -kanta on Streptococcus equi , joka on talletettu ATCC:hen numerolla

14 13 P,7530 Patentkrav 1. Förfarande för framstållning av en sadan stam av Streptococcus equi som år avirulent f6r håstar, kännetecknat av att det omfattar följande steg: 1) man utsåtter en virulent stam av S. equi CF32 (ATCC 53185) fi5r mutationsbildning vid behandling med kemisk mutagen eller strålning, och 2) den resulterande avirulenta och skyddande stammen selekteras vid unders6kning av icke-inkapslade kolonier och med selektering av stammen, som år avirulent, innehåller M- proteinfragment, vars molekylvikt år och som medför S. equi -antikroppsförsvar. 2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att den virulenta stammen av Streptococcus equi muteras vid kemisk induserad mutagenes eller vid strålninginduserat mutagenes. 3. Förfarande enligt patentkravet 2, kännetecknat av att den virulenta stammen av S. equi muteras vid behandling av nitrosoguanin och den avirulenta och skyddande stammen våljs ut vid undersökning av icke-inkapslade kolonier och selektering av en stam, som år avirulent på måss efter intraperitoneal inokulering, skyddar möss mot den virulenta stammen och som innehåller M-proteinfragment, vars molekylvikt år cirka och som medför S. equi -antikroppsreaktion. 4. Förfarande enligt patentkravet 3, kännetecknat av att den avirulenta stammen av S. equi år Streptococcus equi , som deponerats tili ATCC med nummer

15 87530 CPM IgA FIG. 1 x CPM IgG x vrk I FIG. 3 Nenänielun limakalvo ABC CBA " IgG IgA 18 Seerumi CBA ABC IgG IgA ;100 FIG. 2 c. (,) = Verrokki,-- 0) r- aci,- > r0 25- E 0 9 ei :n O happouute i, 'll Vrk:tta injektoinnista