!

Transkriptio

1 ! (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats SUOMI - FINLAND (FI) PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (51) Kv.lk.7 - Int.k1.7 A61K 39139, 39/02, 39/12 (21) Patenttihakemus - Patentansökning (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US91/05231 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P (73) Haltija - Innehavare 1 Research Development Foundation, 402 North Division Street, Carson City, NV 89703, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Six,Howard R., 2 Bog Road, East Stroudsburg, PA 18301, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 2 Garcon,Nathalie, 10 Avenue Alexandre, 1330 Rixens, BELGIA, (BE) (74) Asiamies - Ombud: Kolster Oy Ab Iso Roobertinkatu 23, Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä antigeenin liposomaalisen immunogeenisen kantajan valmistamiseksi Förfarande för framställning av en liposomal immunogen bärare för antigen (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer EP A (A61 K 39/385), EP A (A61K 39/385), USA (A61K 39/00), USA (A61 K 39/12), US A (A61 K 39/00) (57) Tiivistelmä - Sammandrag Vasta-ainevastetta kohdeantigeenille voidaan tehostaa sisällyttämällä antigeeni liposomiin lisärakenneosan ohella, joka sisältää ainakin yhden T-avustajaimusolutunnistuskeskuksen. Liposomit voivat käsittää laajan valikoiman lipidimateriaaleja. Sekä antigeeni että T-avustajaimusolutunnistuskeskuksen sisältävä rakenneosa voidaan liittää liposomiin käyttämällä hydrofobisia vuorovaikutuksia tai kiinnittämällä kovalenttisesti lipidiin. Antikroppgensvaret gentemot en målantigen kan ökas genom införlivande av antigenen i ett liposom tillsammans med en ytterligare beståndsdel, vilken innehåller åtminstone ett T-hjälplymfocytigenkänningsställe. Liposomerna kan inkludera en hel del olika lipidmaterial. Beståndsdelen, vilken innehåller både antigenen och T-hjälplymfocytigenkänningsstället, kan förenas med liposomet genom utnyttjande av hydrofobisk växelverkan eller kovalent förenande med en lipid.

2 1 Menetelmä antigeenin liposomaalisen immunogeenisen kantajan valmistamiseksi Keksinnön tausta 5 1. Keksinnön aihepiiri Keksintö koskee vasta-ainevasteen kohdeantigeenille tehostamista sisällyttämällä antigeeni liposomiin lisärakenneosan ohella, joka sisältää ainakin yhden T-avustajaimusolutunnistuskeskuksen. Tarkemmin keksintö koskee mene- 10 telmää antigeenin liposomaalisen immunogeenisen kantajan valmistamiseksi, joka oleellisesti koostuu lipidistä, N- 2(2,4-dinitrofenyyli)-E-aminokaproyylifosfatidyylietanoliamiinikohdeantigeenistä, ja ainakin yhdestä avustajapeptidistä, jossa on ainakin yksi T-avustajasolutunnistuskes- 15 kus, jolloin avustajasolutunnistuskeskus on liposomissa tai liposommilla, kohdeantigeeni ja avustajapeptidi eivät ole sidottu toisiinsa ja avustajapeptidi on influenssaviruksen HA2 -polypeptidialayksikkö. 2. Kuvaus liittyvästä teknologiasta 20 Rokoteantigeeni tuottaa immuniteetin tartunnalle indusoimalla organismin tuottamaan immuunivasteen. Antigeenien käyttökelpoisuus vaihtelee täten riippuen niiden indusoiman immuunivasteen voimakkuudesta. On olemassa vaihtelevassa määrin luontaisesti voimakkaita ja heikkoja 25 antigeeneja. Lisäksi antigeenit voidaan luokitella kateenkorvasta ("T"-) riippuvaisiksi tai T-riippumattomiksi antigeeneiksi sen perusteella, kykenevätkö ne synnyttämään avustaja-aktiivisuutta T-soluista. Tämä T-soluaktiivisuus liittyy IgG- ja IgA-luokkien vasta-aineiden tuotantoon. T- 30 riippumattomat antigeenit indusoivat IgM-vasta-aineiden tuotannon, mutta eivät indusoi B-soluja vaihtamaan IgGtai IgA-vasta-aineiden synteesiin. IgM-luokan immunoglobuliinien tuotanto on ohimenevä vaste laboratorioeläimissä ja ihmisissä kestäen vain muutamia kuukausia; kun taas 35 IgG- ja IgA-luokkien vasta-aineiden tuotanto tavallisesti

3 jatkuu vuosia. T-riippuvaisen vasteen synnyttäminen jollekin nimenomaiselle antigeenille on tämän vuoksi edullista. Hiilihydraatti- tai polysakkaridipohjaiset antigeenit ovat T-riippumattomia antigeeneja ja niiden käyttökelpoisuus 5 rokotteina lapsissa on rajallinen. Samoin monet polypeptidit, jotka edustavat vasta-ainetunnistuskeskuksia, ovat T- riippumattomia antigeeneja, jolloin ne ovat samoin kykenemättömiä muodostamaan rokotteelta toivottavia IgG- ja IgA-vasta-ainevasteita. 10 Tiedetään, että heikolle antigeenille voidaan synnyttää voimakkaampi vasta-ainevaste konjugoimalla (kovalenttisesti kiinnittämällä) antigeeni immuunivastetta tehostavaan avustajaproteiiniin. Esimerkiksi US-patenttijulkaisussa nro osoitettiin, että heikko immunogee- 15 ninen vaste tietyille bakteerikapselipolymeereille tehostui konjugoimalla antigeeni bakteeriavustajaproteiiniin, joka sinänsä indusoi antigeenivasteen. Toksiinin, kuten esimerkiksi difteriatoksoidin käyttäminen avustajaproteiinina on tavanomaista. Tällaisen myrkyllisen avustajapro- 20 teiinin käyttö luo kuitenkin ongelman, koska avustajaproteiinin luontainen myrkyllisyys voi rajoittaa antigeeniavustajaproteiinikonjugaatin annostusta ja siten rajoittaa sen tehokkuutta. On samoin tavanomaista, että immuunivaste kohdean- 25 tigeenille tukahtuu organismin aiemman immunoinnin avustajaproteiinille johdosta tämän luodessa epitooppitukahdutusvaikutuksen. Kun isäntäorganismi on pohjustettu reagoimaan avustajaproteiiniin, organismi poistaa kohdeantigeeni-avustajaproteiinikonjugaatin elimistöstä ennen kuin 30 organismi voi käynnistää immunologisen vasteen kohdeantigeenille. Nämä aiemmin käytetyt konjugaatit muodostetaan kytkemällä antigeeni kovalenttisesti kantaja-avustajaproteiiniin. Immuunivasteen tehostuksella on erityistä mer- 35 kitystä T-riippumattomille antigeeneille, jotka voidaan

4 3 konjugoida peptidiin, joka sisältää ainakin yhden T-avustaj asolutunnistuskeskuksen, jolloin saadaan T-riippuvainen vaste T-riippumattomalle antigeenille. Tällä hetkellä käytettyjen kovalenttisesti kytkettyjen konjugaattien tehok- 5 kuus on kuitenkin rajoitettu, mikä johtuu kovalenttisen sitomisprosessin asettamista rakenteellisista rajoituksista, eli konformaation muutoksista, siitä, ettei sitoutumiskohtia mandollisesti voida lähestyä, sekä siitä, ettei rakenneosien suhteita voida vaihdella. Lisäksi näillä kon- 10 jugaateilla voi ilmetä annosrajoituksia ja epitooppitukah- dutusvaikutus. Liposomit ovat membraanin käsittäviä rakkuloita, joita muodostetaan dispergoimalla lipidejä vesiväliaineeseen. Menetelmät liposomien valmistamiseksi ovat alan am- 15 mattilaisille hyvin tuttuja ja niistä ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, esimerkkejä mitkä tahansa seuraavat patenttijulkaisut, jotka sisällytetään tähän viitteeksi: US-patenttijulkaisut nro ja Liposomeilla on useita in vivo -kantajalta vaadittuja 20 ominaisuuksia: alhainen myrkyllisyys, alhainen immunogeenisyys ja biohajoavuus. On samoin osoitettu, että liposomit voivat tehostaa vasta-ainevastetta antigeeneille laboratorioeläimissä. Antigeenit on joko pidätetty liposomin vesirakenneosiin tai ne liittyvät kaksikerrokseen. Esimer- 25 kiksi US-patenttijulkaisussa nro kuvataan menetelmää immunogeenien kytkemiseksi kovalenttisesti liposomin pintakaksikerrokseen ja immuunivasteen tehostamiseksi täten. Keksinnön yhteenveto 30 Esillä oleva keksintö koskee tehostetun antigeenivasteen tuottamista kohdeantigeenille sisällyttämällä antigeeni liposomivalmisteeseen ainakin yhden avustajapeptidin, kuten avustajapeptidin, joka sisältää ainakin yhden T-solutunnistuskeskuksen, ohella. Esillä olevaa keksintöä 35 voidaan käyttää tehostetun antigeenivasteen syn-

5 4 nyttämiseksi mille tahansa antigeenille mukaan lukien, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, polysakkaridit, kuten Hemophilus influenza-, Meningococci-, Pneumococci- ja Streptococci-lajit, ja peptidit, kuten hepatiitti-b-pinta- 5 proteiinit, HIV-pintaproteiinit, influenssavirusproteiinit, parainfluenssaviruspeptidit tai hemagglutiniini, hengitysteihin liittyvät synkytiaaliset viruspintaglykoproteiinit ja kolerapintaglykoproteiinit. Keksinnön mukaiselle menetelmäile antigeenin li- 10 posomaalisen immunogeenisen kantajan valmistamiseksi, joka oleellisesti koostuu liposomeja muodostavasta lipidistä, N-2(2,4-dinitrofenyyli)-E-aminokaproyylifosfatidyylietanoliamiinikohdeantigeenistä, ja ainakin yhdestä avustajapeptidistä, jossa on ainakin yksi T-avustajasolutun- 15 nistuskeskus, jolloin avustasolutunnistuskeskus on liposomissa tai liposomilla, kohdeantigeeni ja avustajapeptidi eivät ole sidottu toisiinsa ja avustajapeptidi on influenssaviruksen HA 2 -polypeptidialayksikkö, on tunnusomaista se, että kohdeantigeeni ja avustajapeptidi si- 20 säilytetään liposomeihin. Kohdeantigeeni (jolle tehostunutta immunogeenistä vastetta toivotaan) voi olla sisällytetty liposomirakkulaan kiinnittämällä antigeeni yhteen laajasta valikoimasta lipidimateriaaleja, jotka sisältävät aktiivisen funktio- 25 naalisuuden. Näitä lipidimateriaaleja ovat fosfatidyylieetterit tai fosfatidyyliesterit (esim. fosfatidyylietanoliamiini ja fosfatidyylikoliini), glyseridit, kerebrosidit, gangliosidit, sfingomyeliinit ja steroidit (esim. kolesteroli) jne. US-patenttijulkaisussa nro ja 30 US-patenttijulkaisussa nro julkistetaan muita lipidimateriaaleja käytettäviksi liposomien valmistuksessa. Vaihtoehtoisesti kohdeantigeeni voidaan sisällyttää liposomirakkulaan hydrofobisten voimien välityksellä, jos 35 antigeeni käsittää lipofiilisen ryhmän, katso US-patentti-

6 5 julkaisu nro , tai antigeeniin voidaan kiinnittää hydrofobinen ryhmä. Avustajapeptidin sisällyttäminen voi myös tapahtua käyttäen joko kovalenttisia tai hydrofobisia vuorovaiku- 5 tuksia. Esimerkiksi influenssaviruksen hemagglutiniini (HA) -proteiini koostuu kandesta polypeptidiketjusta (HA 1 2 ). HA2 -polypeptidiketju sisältää sekvenssin hydrofobisia aminohappoja, joka sijaitsee lähellä polypeptidin ja HA karboksyylipäätä ja sisältää ainakin yhden T-avustajaso- 10 lutunnistuskeskuksen. Täten HA 2 -polypeptidiketju voidaan sisällyttää liposomeihin membraanin lävistävän hydrofobisen alueen kautta. US-patenttijulkaisussa nro kuvataan influenssavirusalayksiköiden sisällyttämistä liposomeihin ja se sisällytetään tähän viitteeksi. Hydrofo- 15 binen rakenneosa voidaan vaihtoehtoisesti lisätä avustajapeptidiin liittymisen liposomimembraaniin helpottamiseksi, tai avustajapeptidi voidaan kiinnittää kovalenttisesti suoraan lipidimateriaaleihin, jotka sisältävät aktiivisen funktionaalisuuden. 20 Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetulla kantajalla on useita etuja aiemmin käytettyihin antigeeni-kantajakonjugaatteihin nähden, kuten esimerkiksi julkistetaan US-patenttijulkaisussa nro Kovalenttisesti sidotuissa konjugaateissa muu- 25 tokset kantajaproteiinin konformaatiossa sekä muutokset antigeenin konformaatiossa ovat mandollisia kovalenttisen sidoksen johdosta. Tämä haitta voidaan voittaa esillä olevassa keksinnössä, jossa kohdeantigeeni ja avustajapeptidi liitetään liposomiin. Esillä olevan keksinnön mu- 30 kaisella menetelmällä valmistettu kantaja välttää alan tekniseen tasoon liittyvät myrkyllisyys- ja epitooppitukandutusvaikutukset. Esillä olevassa keksinnössä käytetään ei-myrkyllisiä lipidejä ja sitä käytetään edullisesti eristettyjen, ei-myrkyllisten T-avustajakeskuksen sisältä- 3 5 vien peptidien kanssa.

7 6 Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu kantaja on samoin edullinen aiemmin käytettyihin konjugaatteihin nähden, koska se sallii modifikaatiot antigeenitiheydessä, kohdeantigeenin suhteessa avustaja- 5 peptidiin sekä useamman kuin yhden T-avustajasolutunnistuskeskuksen käsittävän avustajapeptidin sisällytyksen. Nämä tekijät voivat vaikuttaa kohdeantigeenia vastaan tuotettujen spesifisten vasta-aineiden määriin. Näitä tekijöitä ei helposti kontrolloida konjugaatteja syntetisoi- 10 taessa, koska kyseisten kanden rakenneosan on oltava kovalenttisesti sidottuja, mikä luo fysikaalisia rajoituksia niiden tekijöiden lukumäärään ja tyyppiin nähden, jotka voidaan liittää yhteen säilyttäen samalla pääsy tunnistuskeskuksiin. Lisäksi esillä olevan keksinnön mukaisella 15 menetelmällä valmistettu kantaja on edullinen konjugaatteihin nähden, koska antigeenin sisällytyksen liposomiin on osoitettu tehostavan vasta-ainetuotantoa. Täten esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu kantaja käyttää liposomien tätä ominaisuutta vasta-aineiden 20 tuotannon tietylle antigeenille ja etenkin heikoille antigeeneille, jotka eivät aikaansaisi riittävää vasta-ainetuotantoa, edelleen tehostamiseksi. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut liposomirakkulat antavat käyttöön uuden lähestymistavan 25 synteettisten rokotteiden suunnitteluun. Monilukuinen määrä kohdeantigeenin ja avustajapeptidin tai -peptidien kopioita voidaan sisällyttää mukaan nopeassa ja helpossa menetelmässä. Sen lisäksi, että lähestymistavalla saadaan tehokas ja tehostunut immunointi kohdeantigeenille, se 30 mandollistaa antigeenien ja avustajapeptidien helpon testauksen. Esimerkiksi keksinnön mukaisella menetelmällä annetaan käyttöön yksinkertainen väline erilaisten T-avustajapeptidien kyvyn tehostaa immunogeenistä vastetta tietylle antigeenille vertailemiseksi. Täten keksinnön mukai-

8 sella menetelmällä ann e taan samoin käyttöön käyttökelpoinen väline immuunivasteen mekanismin tutkimiseksi. Muita ja seuraavia suoritusmuotoja, piirteitä ja etuja ilmenee seuraavasta, keksinnön tällä hetkellä edul- 5 lisen suoritusmuodon kuvauksesta. Yksityiskohtainen kuvaus edullisesta suoritusmuodosta Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavaa rokotekoostumusta voidaan käyttää immuunivasteen mille ta- 10 hansa kohdeantigeenille ja edullisimmin T-riippumattomille antigeeneille tehostamiseksi. Esillä olevasta keksinnöstä ja keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun kantajan sovelluksista esitetään esimerkki viitaten DNP-CapPE:hen, jota on runsaasti tutkittu T-riippumattomana antigeenina. 15 Alan ammattilaiselle olisi kuitenkin ilmeistä, että esillä olevaa keksintöä voidaan soveltaa mihin tahansa antigeeniin. Esillä olevan keksinnön edullisessa suoritusmuodossa syntetisoidaan synteettinen rokote, joka indusoi T- riippuvaisen immunologisen vasteen T-riippumattomalle an- 20 tigeenille. Kohdeantigeeni sisällytetään liposomivalmisteeseen avustajapeptidin tai -peptidien ohella, joka sisältää/jotka sisältävät T-solutunnistuskeskuksen. Mitä tahansa T-solutunnistuskeskuksen sisältävää peptidiä voidaan käyttää avustajapeptidinä, esimerkiksi natiiveja tai 25 myrkyttömäksi tehtyjä peptidejä sellaisista toksoideista, kuten influenssa-, tetanus-, difteria-, Pseudomonas-, Staphylococcus-, StrelDtococcus-, pertussis- ja Escherichia coli -lajit. Sen määrittämiseksi, sisältääkö ehdokaspeptidi T-solutunnistuskeskuksen, voidaan suorittaa yksinker- 30 tainen testi. Peptidi sisällytetään liposomivalmisteeseen antigeenin, kuten DNP-CapPE:n, ohella, joka sisältää vain B-soluepitoopin. Jos isäntäorganismissa ilmenee IgG-vaste saadulle liposomivalmisteelle, peptidissä on T-solutunnistuskeskus, ja se voi toimia esillä olevan keksinnön mu- 35 kaisena avustajapeptidinä.

9 8 Influenssahemagglutiniiniproteiinin HA2 -alayksikköä käytettiin edullisesti avustajapeptidinä, koska se on hyvin määritelty ja siinä tiedetään olevan ainakin yksi T-avustajasolutunnistuskeskus mutta ei B-solutunnistus- 5 keskusta. Täten tämä peptidi aikaansaa T-riippuvaisen immunologisen vasteen konjugoidulle antigeenille, mutta se ei indusoi vasta-ainevastetta itseään vastaan. Tämä rajoitus ei ole edellytys keksinnön mukaisesti valmistetun kantajan toiminnalle; mitä tahansa B-solutunnistuskeskuk- 10 sen sisältävää avustajapeptidiä voidaan myös käyttää, jos immunologista vastetta avustajapeptidille toivotaan ja jos se voidaan hyväksyä vasteen kohdeantigeenille lisäksi. Edullista kuitenkin on, että avustajapeptidi on puhdas T- avustajasoluepitooppi. Samoin mitä tahansa T-sytotoksinen- 15 imusolutunnistuskeskuksen sisältävää avustajapeptidiä voidaan myös käyttää, jos sytotoksista vastetta toivotaan tai jos se voidaan hyväksyä vasteen kohdeantigeenille lisäksi. HA2 -alayksikkö on lisäksi tarkoituksenmukainen avustajapeptidinä, koska se käsittää hydrofobisen amino- 20 happosekvenssin lähellä karboksyylipäätä, joka normaalisti jatkuu viruksen lipidikuoren läpi. Tämä membraanin lävistävä alue helpottaa liittymistä liposomien lipidikaksikerroksiin ja HA2 liittyy kvantitatiivisesti liposomirakkuloihin. Kuten aiemmin mainittiin, vaihtoehtoiset me- 25 netelmät avustajapeptidin sisällyttämiseksi ovat samoin mandollisia, kuten esimerkiksi peptidin kiinnitys kovalenttisesti lipidiin, tai hydrofobisen aminohapposekvenssin kiinnitys peptidin yhteen päähän. Alan ammattilaiselle olisi ilmeistä, että erilaiset menetelmät avustajapeptidin 30 sisällyttämiseksi liposomiin ovat mandollisia. DNP-CapPE valittiin kohdeantigeeniksi, koska sitä on tutkittu runsaasti ja se on T-riippumaton antigeeni. Täten seuraavissa kokeissa T-riippuvainen vaste DNP- CapPE:lle syntyy avustajapeptidin vaikutuksesta. Esillä 35 olevan keksinnön mukaisesti valmistettavaa liposomivalmis-

10 9 tetta voidaan käyttää yksilön immuunivasteen lisäämiseksi. Ilmaisun "yksilö" tarkoitetaan kattavan minkä tahansa eläimen, edullisesti nisäkkään, joka edullisimmin on koira, kissa, lehmä, hevonen tai ihminen. 5 Esimerkki 1 - Liposomien valmistus Laajaa valikoimaa lipidimateriaaleja voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä mukaan lukien, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, fosfatidyylieetterit tai fosfatidyyliesterit (esim. fosfatidyylieta- 10 noliamiini ja fosfatidyylikoliini), glyseridit, kerebrosidit, gangliosidit, sfingomyeliinit ja steroidit (esim. kolesteroli). Seuraava on esimerkki valmistuksesta, jossa käytetään fosfatidyylikoliinia, vaikka alan ammattilainen huomaisikin, että voitaisiin käyttää mitä tahansa liposo- 15 mivalmistustekniikkaa, joka mandollistaa kohdeantigeenin ja avustajaproteiinin tai -proteiinien sisällytyksen. Ennen liposomin valmistusta voi olla välttämätöntä kiinnittää kohdeantigeeni ja/tai avustajapeptidi kovalenttisesti yhteen lipidirakenneosaan yhden hyvin tunnetuista menetel- 20 mistä mukaan sisällytyksen helpottamiseksi. Liposomien valmistamiseksi käytettiin fosfatidyylikoliinia (PC) (Avantin polaariset lipidit, Pelham, AL), joka oli puhdistettu kananmunankeltuaisesta (EYPC). EYPC:tä lisättiin pyöreäpohjaiseen kolviin haluttu määrä ja kloroformi 25 poistettiin pyöröhaihduttimessa (Buchi 461). Kuivattua lipidikalvoa uudelleenlietettiin steriiliin veteen tai fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) riittäviä määriä 10 mm EYPC-liuoksen saamiseksi. Kun DNP-CapPE-antigeeni sisällytettiin liposomeihin, N-2-(2,4-dinitrofenyyli-E- 30 aminokaproyylifosfatidyylietanoliamiinia (DNP-CapPE) lisättiin EYPC:n kloroformiliuokseen. Lipidikalvoon lisättiin myös puhdistettua HA 2 -alayksikköä (joka saatiin Doris Bucherilta, Mt. Sinia, NY), joka oli saatu A/USSR-90/77- H in,-viruksen hemagglutiniinista (HA), liposomeihin sisäl- 35 lytettäväksi. Liposomit muodostettiin sitten joko liettä-

11 10 mällä lipidiseos steriiliin PBS:ään tai liuottamalla lipidiseos n-oktyyliglukosidiin (5 % w/v PBS:ssä), mitä seurasi 16 tunnin dialyysi PBS:ää vastaan. DNP-CapPE:n ja HA 2 :n määriä, jotka sisällytettiin yksittäisiin liposomivalmis- 5 teisiin, vaihdeltiin kokeen tarpeiden täyttämiseksi. Esimerkki 2 - Liposomin karakterisointi HA2 :n liittymisen liposomirakenteisiin määrittämiseksi käytettiin 125 I-HA2 :ta. DNP-CapPE:n sisällytyksen liposomeihin määrittämiseksi näyte-eriä (10 gl) alkuperäi- 10 sestä lietteestä liuotettiin 990 gl:aan metanolia ja luettiin absorbanssi 360 nm:n aallonpituudella spektrofotometrillä. HA2 :n liittymisprosentti valmisteissa rekonstituoinnin PBS:ään ja dialyysin jälkeen ei muuttunut merkittävästi HA 2 -määrien vaihdellessa ja oli yli 90 %. DNP- 15 CapPE:n liittymisprosentti valmisteessa oli enemmän kuin 95 % kaikissa valmisteissa. DNP:n vapautumista ei havaittu ruiskeiden välillä. DNP-CapPE pysyi liittyneenä liposomirakenteisiin. Esimerkki 3 - Immunoinnin menettelyjärjestely 20 Käytettiin 6-8 viikon ikäisiä naaraspuolisia ulkokasvatettuja albiino-irc-hiiriä (Timco, Houston, Tx). Eläimistä otettiin verta häntälaskimosta, minkä jälkeen niille annettiin 0,1 ml lumelääkettä (PBS), verrokkiliposomeja (ei HA 2 :ta tai hapteenia) tai liposomeja, jotka 25 sisälsivät ilmoitetut määrät hapteenia ja/tai HA 2 -peptidiä. 3-4 viikkoa myöhemmin hiiristä otettiin verta häntälaskimosta ja niille annettiin tehosterokote samaa valmistetta ja sama määrä kuin alkuperäinen rokote päivää myöhemmin eläimistä otettiin jälleen verta häntälaskimos- 30 ta. Hiirille annettiin mandollisesti 3. rokote 8 viikon kuluttua viimeisestä ruiskeesta ja niistä otettiin verta 2 viikkoa myöhemmin. Kaikki rokotukset annettiin lihaksensisäisesti (i.m.) takakäpäliin. Hiiriä pidettiin muovihäkeissä (4 eläintä häkkiä kohden), joissa oli välisuodatti- 3 5 met, ja niille annettiin ruokaa ja vettä ad libitum. See-

12 11 rumi erotettiin sentrifugoimalla x g:ssä 5 minuutin ajan 4 C:ssa ja varastoitiin -20 C:seen testaukseen asti. Kaikista seeruminäytteistä kustakin kokeesta määritettiin vasta-ainetuotanto yhdessä testissä. 5 Esimerkki 4 - Antidinitrofenyyli (DNP) -seerumivasta-ainetestit Antigeenin testaamiseksi käytettiin dinitrofenyloitua nautaseerumialbumiinia (DNP-BSA). Verrokkiantigeenina käytettiin BSA:ta, josta ei ollut muodostettu johdannais- 10 ta. DNP-BSA valmistettiin lisäämällä dinitrofluoribentseeniä BSA-liuokseen moolisuhteessa 10:1; trietanoliamiinia lisättiin, kunnes päästiin ph:hon 9-9,5. 16 tunnin inkuboinnin 20 C:ssa jälkeen sitoutumatta jäänyt DNP poistettiin dialysoimalla PBS:ää vastaan. Alustavissa kokeissa 15 määritettiin, että BSA, josta oli muodostettu johdannainen tässä moolisuhteessa, totesi seerumivasta-aineen tehokkaammin kuin proteiini, joka sisälsi korkeampia tai alhaisempia moolisuhteita DNP:tä. Seerumin vasta-ainetasot määritettiin sekä ELISA- että SPIRA-menettelyillä. 20 ELISA Immulon I -levyjä (Dynatech, Detroit, MI) päällystettiin DNP-BSA:lla (10 gg kuoppaa kohden) 0,05 M karbonaattipuskurissa (ph 9,6), verrokkikuopat päällystettiin 10 kg:lla kuoppaa kohden BSA:ta. 16 tunnin 4 C:ssa ku- 25 luttua levyt päällystettiin toistamiseen 5-%:isella (v/v) FCS-liuoksella PBS:ssä. Tämän ja kunkin muun inkuboinnin jälkeen levyt pestiin PBS:llä, joka sisälsi 1 %:n FCS:ää ja 0,2 % Tween 20 -valmistetta. Seerumista valmistettiin kaksinkertaisia sarjalaimennoksia rinnakkaismäärityksin 30 lähtien suhteesta 1:100 PBS:ään, joka sisälsi 1 %:n BSA:ta, ja 0,1 ml:n näytteitä kustakin laimennoksesta lisättiin antigeeni- ja verrokkikuoppiin. Inkuboitiin 5 tunnin ajan 20 C:ssa, minkä jälkeen lisättiin vuohivastaaineita, jotka olivat spesifisiä hiiren IgG:n raskaalle 35 ketjulle, alkaliseen fosfataasiin konjugoituina (Fc-spesi-

13 12 finen, Cappel Lab, West Chester, PA), tai vuohen antihiiri-igg-alaluokkia pitoisuutena, jonka oli alustavissa kokeissa määritetty ylittävän vasta-aineen optimaaliseen toteamiseen tarvittavan pitoisuuden. IgG-alaluok- 5 kien kyseessä ollen lisättiin sitten alkaliseen fosfataasiin konjugoituja sikavasta-aineita, jotka olivat spesifisiä vuohi-igg:lle. p-nitrofenyylifosfaattia (1 mg/ml) 10-%:isessa dietanoliamiinipuskurissa, ph 9,8, lisättiin (0,1 ml/kuoppa). Optiset tiheydet 410 nm:ssä luettiin puo- 10 len tunnin kuluttua Dynatech MR 600 -spektrofotometrillä. Vasta-ainetiitterit ilmaistaan korkeimpana seerumilaimennoksena, josta saatiin optinen tiheys, joka ylitti verrokkikuopat 0,2:11a. SPIRA 15 DNP-vasta-ainetasojen määritykset SPIRA:lla suoritettiin, kuten kuvattiin ELISA-määritykselle, tehden kaksi modifikaatiota. Käytettiin joustavia polyvinyylikloridimikrotiitterilevyjä ja 125 I-leimattua affiniteettipuhdistettua (raskasketjuspesifistä) kaniinin antihiiri-igg:tä 20 käytettiin DNP-antigeeniin sitoutuneen hiirivasta-aineen toteamiseksi. Vasta-ainetiitterit laskettiin, kuten kuvattiin aiemmin, ja leimattujen kaniinin åntihiirivasta-aineiden spesifisyys määritettiin tavanomaisilla ristiviivatesteillä käyttäen hiiren monoklonaalisia vasta-aineita, 25 jotka ovat spesifisiä influenssaviruksen HA 2 :lle, kuten on kuvattu. Vasta-ainetiitterien vertailut tehtiin Mann-Witneytestin mukaan, kun 2 ryhmää hiiriä sisältyi yhteen kokeeseen. Kun vertailut useamman kuin kanden ryhmän välillä 30 olivat kyseessä, käytettiin Krusdall-Wallisin menetelmää. Esimerkki 5 - DNP-CapPE:tä ja/tai HA2-alayksikön sisältävien liposomien immunogeenisyys Ryhmiin ulkokasvatettuja hiiriä ruiskutettiin kahdesti 4 viikon välein EYPC-liposomien valmisteita ( gg), tai EYPC-liposomeja, jotka sisälsivät HA 2 :ta (3,7 gg),

14 13 DNP-CapPE:tä (30 gg) tai molempia (taulukko 1). IgG- ja IgM-vasteet analysoitiin epäsuoralla ELISA:lla ja ne ilmaistaan vasta-ainetiitterien keskiarvona. Lipidin ja DNP:n ja HA2 :n välinen moolisuhde oli 6 000:200:1. ELISA- 5 lukemat osoittivat, että kumpikin DNP-CapPE:tä (HA2 :n kanssa tai ilman sitä) sisältävä valmiste tuotti IgM-vasteen seitsemässä seitsemästä hiirestä. Kuitenkin, kun titrattiin anti-dnp-igg-seerumivasta-aineita, tulokset alenivat näyttävästi liposomi-dnp-ryhmässä, jolloin saatiin 10 verrokkiryhmiin nähden samankaltaisia tiittereitä, kun taas DNP/HA2 -liposomeilla immunoidut hiiret indusoivat merkittävästi korkeampia tasoja seerumispesifistä anti-dpn- IgG:tä Taulukko 1 Liposomi- IgG- Vastetuot- IgM- Vastetuot- koostumus tiitteri tajasuhde tiitteri tajasuhde PBS 210 ± 55 3/7 119 ± 21 3/7 Liposomi,tyhjä 313 ± 145 3/7 290 ± 85 3/7 HA2 205 ± 65 3/7 384 ± 190 3/7 DNP 188 ± 73 3/ ± 791 3/7 DNP-CapPE/HA ± 925 3/ ± 506 3/7 Tämän muutoksen immunoglobuliiniluokissa voidaan katsoa johtuvan yksinomaan HA 2 :n ja DNP:n liitosta samoissa 25 liposomirakenteissa, koska IgG-anti-DNP-vasta-aineita ei muodostunut lainkaan, kun hiiret immunoitiin joko seoksella, jossa oli HA 2 :ta ja DNP-CapPE:tä vesiliuoksessa, tai DNP-CapPE-liposomeilla ja HA 2 -liposomeilla, jotka ruiskutettiin yhdessä (taulukko 2). Molemmat rakenneosat tarvi- 30 taan yhdessä samassa liposomissa IgG-anti-DNP-vasta-ainei- den tuotannon stimuloimiseksi.

15 Taulukko 2 Liposomikoostumus DNP-CapPE HA2 IgG- tiitteri 10pg lgg logg 3pg pg 9gg gg lpg pg 3gg 1241 ± gg 9gg logg DNP-BSA 2245 _ logg DNP-CapPE ja 0 HA2 logg* vesiliuoksessa + lpg* 0 3gg* 0 9gg* 0 Vastetuot- IgM- Vastetuottajasuhde tiitteri tajasuhde 6/ /6 6/ /6 6/ /6 6/ /6 6/ /6 6/ /6 6/6 0 0/6 0/6 155 ± 63 2/6 0/6 ** 0/6 * * 0/6 ** * DNP-CapPE ja HA2 sisällytettiin erillisiin liposomeihin ja annettiin yhdessä. 20 ** Koetta ei suoritettu. Esimerkki 6 - Annosvasteet liposomaaliseen DNP:hen ja HA2 :een Tässä kokeessa tutkittiin 3 immunointiryhmää. 25 Tiettyä DNP-CapPE-määrää (5, 10, 30 gg/ruiske) kohden vaihtelevia määriä HA2 :ta (1, 3 tai 9 gg) sisällytettiin myös EYPC:stä (750 µg/ruiske) koostuviin liposomivalmisteisiin. Eläimistä otettiin verta yksi päivä ennen identtistä tehosteruisketta ja 9 päivän kuluttua siitä. 30 Seerumeista analysoitiin anti-dnp-igg ja -IgM ELISA-määrityksellä. Lisäksi kaksi hiiriryhmää immunoitiin joko 10 gg:lla DNP-BSA:ta, tai DNP-CapPE:llä ja HA2 :lla, jotka oli sekoitettu yhteen vesiliuoksessa. Analysoitaessa IgM-ELISA-arvoja (taulukko 2) tilas- 35 tollisesti ne kaksi ryhmää, jotka edustivat 5 gg ja 10 gg

16 15 DNP-CapPE:tä, eivät osoittaneet merkitseviä eroja HA2 -määrän kasvaessa, minkä vuoksi tuloksia 5 gg:n DNP-CapPE-ryhmälle ei esitetä. Kuitenkin merkitsevä ero havaittiin immunoitaessa hiiret liposomeilla, jotka sisälsivät 30 gg 5 DNP-CapPE:tä ja 1, 3 tai 9 gg HA2 :ta, 10 sessa. jolloin korkeampi suhde antoi korkeamman IgM-tiitterin. Mitään IgM-vastetta ei havaittu, kun hiiret immunoitiin 10 gg:lla DNP-BSA:ta, ja vain kaksi kuudesta hiirestä antoi IgM-vasteen ryhmässä, joka immunoitiin DNP-CapPE:llä ja HA 2 :lla vesiliuok- Analysoitaessa ELISA-arvoja (taulukko 2) tilastollisesti vasteet tietylle määrälle HA 2 :ta (1, 3 tai 9 gg) ja kasvavalle määrälle DNP-CapPE:tä (5, 10 tai 30 gg) osoittivat merkitseviä eroja, mikä osoitti annos-vaste- 15 vaikutuksen sekä DNP:lle että HA2 :lle. Tämä puolestaan osoittaa, että tehostunut IgG-tuotanto johtuu sekä kohdeantigeenin että avustajapeptidin esiintymisestä samassa liposomissa. Hiiret, jotka oli immunoitu DNP-BSA:lla, antoivat IgG-vasteen, jota voitiin verrata ryhmään, joka oli 20 immunoitu korkeimmilla annoksilla HA 2 :ta ja DNP:tä testatuissa liposomeissa. IgG-vastetta ei todettu hiirille, jotka oli immunoitu DNP/HA 2 :lla vesiliuoksessa. Esimerkki 7 - DNP-CapPE-liposomien 3. ruiskutuksen vaikutus vasta-ainevasteeseen hiirissä, jotka on aiemmin 25 immunoitu DNP/HA2 -liposomeilla Muistivasteen DNP-kohdeantigeenia vastaan ilmaantumisen määrittämiseksi immunoitaessa hiiret aiemmin DNP- CapPE/HA 2 -liposomeilla 7 hiiren ryhmään ruiskutettiin 3. kerralla liposomeja, jotka sisälsivät vain DNP-CapPE:tä 30 (ja antoivat siten käyttöön vain B-solukeskukset). Tämä koe osoittaa, että muistivaste muodostuu vain, kun DNP- CapPE ja HA2 esiintyvät yhdessä alkuperäisessä liposomivalmisteessa. Se osoittaa niinikään, että esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettu kantaja tuottaa bona fide 35 kateenkorvasta riippuvaisen immunologisen vasteen ja koh-

17 16 deantigeenille immunologisen muistin, joka voi tuottaa IgG-vasta-aineita vasteena kohdeantigeenille, ilman että T-solutunnistuskeskuksen tarvitsee enää olla läsnä. Kuten esitettiin aiemmin, hiiret, jotka oli immu- 5 noitu DNP-CapPE/HA2 -liposomeilla, muodostivat IgG-anti-DNPvasteen. Kun samoihin hiiriin ruiskutettiin sitten 3. kerralla liposomeja, jotka sisälsivät vain DNP-CapPE:tä (ryhmä 1), SPIRA-lukemat kasvoivat näyttävästi verrattuina ensimmäisiin tai toisiin verenottoihin, mikä osoitti spe- 10 sifisten B-solujen restimulaation korkeammalla tasolla, kuin minkä tuotti ensimmäinen immunointi. Hiiret, jotka immunoitiin HA2 -liposomeilla ja joita sitten restimuloitiin DNP-CapPE-liposomeilla (ryhmä 3), eivät tuottaneet mitään todettavaa anti-dnp-igg-vasta-ainetiitteriä. Hiiret, joi- 15 hin ruiskutettiin DNP-CapPE/HA2 -liposomeja kerran (ryhmä 2), antoivat primaarisen immunoinnin anti-dnp-igg-vastaaineiden tason. Verrokkiryhmä (ryhmä 4), johon ruiskutettiin tyhjiä EYPC-liposomeja, ei osoittanut anti-dnp-iggvasta-ainetuotantoa. 20 Taulukko 3 Vastetuot- Ryhmä nro Verenotto nro Tiitteri tajasuhde ± 975 7/ ± 270 7/ ± / ± 28 3/ ± 75 3/ Esimerkki 8 - Ulkomembraani-HA 2 verrattuna sisäiseen EA2 :een immuunivasteessa Neljä ryhmää ulkokasvatettuja hiiriä immunoitiin EYPC-liposomeilla, jotka koostuivat 30 kg:sta DNP-CapPE:tä 35 ja vaihtelevista määristä HA 2 :ta (3, 1, 0,5 ja 0 gg). Li-

18 17 säksi ryhmä hiiriä immunoitiin DNP-CapPE/HA 2 -liposomeilla (30 ja vastaavasti 3 gg), kun liposomeja oli aiemmin käsitelty bromelaiinilla (100 gg/ml). Bromelaiinikäsittely lohkoo pintaproteiinåja jättäen vain membraaniin työnty- 5 neen jatkeen ja ehyttä sisäistettyä HA2 :ta. Analysoitaessa ELISA-tiitteriä tilastollisesti havaittiin jälleen annosvastevaikutus HA 2 -määrän kasvaessa; taulukko 4. Niinkin vähän kuin 0,5 gg HA2 :ta DNP-CapPE-liposomeissa ruisketta kohden riitti indusoimaan IgG-vasteen, joka poikkesi ti- 10 lastollisesti DNP-CapPE-liposomeista. Tilastollista eroa, kun hiiret immunoitiin bromelaiinilla käsitellyillä liposomeilla, ei kuitenkaan havaittu verrattuna vasteeseen, joka saatiin samoille ei-käsitellyille liposomeille. Nämä tulokset osoittavat, että liposomien ulkoista HA 2 :ta ei 15 tarvittu ja että liposomeja on prosessoitava, jotta toteutettaisiin B- ja T-soluepitooppien yhteinen esittäminen immunologisesti kykeneville soluille. Taulukko 4 Liposomikoostumus IgG- Vastetuot- 20 Ryhmä nro DNP-CapPE HA2 tiitteri tajasuhde 1 30 gg 3 1.4g 944 ± 291 7/ gg 1 gg / gg 0,5 gg 438 ± 121 7/ gg ± 88 2/ Ryhmä 1 liposomien 808 ± 315 7/7 bromelaiinikäsittelyn jälkeen Esimerkki 9 - IgG-Immunoglobullinialaluokkien ja- 30 kauma immuunivasteen aikana ELISA-lukemia analysoitaessa IgGl - vasta - aine oli vallitseva alaluokka. Ulkokasvatettujen hiirten IgGl-vaste DNP:lle oli samanlainen alhaisilla DNP-CapPE-annoksille (taulukko 1) 35 eri HA2 - pitoisuuksilla. Korkeammalle DNP-CapPE-pitoisuu-

19 18 delle (30 gg) havaittiin annos-vastevaikutus kasvaville HA2 -määrille. Liposomivalmiste, jossa oli EYPC:tä, DNP- CapPE:tä ja HA2 :ta 750, 30 ja vastaavasti 9 gg, antoi IgG1- vasteen, joka oli verrattavissa hiiriryhmään, joka immu- 5 noitiin 10 gg:lla DNP-BSA:ta, tyypillinen hapteenikantajasysteemi. Merkittäviä eroja ei havaittu IgG2a- ja IgG2b-vasta-aineiden alaluokilla (taulukko 5). Ainoat ryhmät, joille IgG2a- tai IgG2b-vasta-aineita ei voitu todeta, olivat 10 hiiriryhmät, jotka oli immunoitu EYPC-liposomeilla, jotka sisälsivät 1 gg HA2 :ta ja 10 gg DNP-CapPE:tä (IgG2a ja IgG2b) ja 3 gg HA2 :ta ja 10 gg DNP-CapPE:tä (IgG2b). Korkeammalle DNP-CapPE- tai HA2 -annokselle ei havaittu merkittäviä eroja vasteissa. Vasteet olivat verrattavissa vas- 15 teisiin, kun hiiret immunoitiin DNP-BSA:lla. Merkittäviä eroja ei havaittu IgG3-vasta-ainealaluokalla. Kullekin ryhmälle tiitteri todettiin ja ainakin neljä kuudesta immunoidusta hiirestä tuotti vasteen (taulukko 5). Kuitenkin vain kaksi 10 gg:lla DNP-BSA:ta immu- 20 noitua hiirtä tuotti vasteen nostaen tiitterin merkittävästi alemmas kuin liposomivalmisteilla immunoiduissa hiiriryhmissä.

20 Taulukko 5 Liposomikoostumus Iggi JgGu 5 Vastetuot- Vastetuot- DNP -CapPE fla2 tajasuhde Tiitteri tajasuhde Tiitteri loug lpg 3/6 180 ± 70 0/6 10pg 3pg 4/6 222 ± 79 4/ loug 9pg 6/ /6 241 ± pg lpg 4/6 275 ± 102 4/6 326 ± 92 30pg 3pg 6/ /6 366 ± mg 9pg 6/6 803 ± 402 6/6 371 ± g DNP-BSA 6/6 941 ± 578 6/6 258 ± pg DNP-CapPE 0/6 0/6 3ug HA2, vesiliuos Liposomikoostumus Igq2b ig...q3 20 Vastetuot- Vastetuot- DNP - CapPE -- HA 2 tajasuhde Tiitteri tajasuhde Tiitteri 10pg 13.1g 0/ /6 177 ± 20 logg 3pg 0/6 4/6 217 ± 93 10pg 9pg 5/6 308 ± 23. 5/6 280 ± pg lpg 2/6 223 ± 104 5/6 280 ± pg 3pg 5/6 250 ± 141 6/ pg 9pg 6/6 275 ± 91 6/6 376 ± 71 10pg DNP-BSA 5/ /6 190 ± pg DNP-CapPE 0/6 0/6 3pg HA2, vesiliuos Kun keksintö nyt on täysin kuvattu, alan keskimääräisellekin taitajalle on ilmeistä, että siihen voidaan tehdä muutoksia ja modifikaatioita poikkeamatta keksinnön tässä esitetyn mukaisesta hengestä tai kattavuudesta.

21 20 Patenttivaatimukset.. 1. Menetelmä antigeenin liposomaalisen immunogeenisen kantajan valmistamiseksi, joka oleellisesti koostuu 5 liposomeja muodostavasta lipidistä, N-2(2,4-dinitrofenyyli)-E-aminokaproyylifosfatidyylietanoliamiini-kohdeantigeenistä, ja ainakin yhdestä avustajapeptidistä, jossa on ainakin yksi T-avustajasolutunnistuskeskus, jolloin avustajasolutunnistuskeskus on liposomissa tai liposomil- 10 la, kohdeantigeeni ja avustajapeptidi eivät ole sidottu toisiinsa ja avustajapeptidi on influenssaviruksen HA2 - polypeptidialayksikkö, tunnettu siitä, että kohdeantigeeni ja avustajapeptidi sisällytetään liposomeihin. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että lipidi valitaan ryhmästä, jonka muodostavat fosfatidyylieetteri, fosfatidyyliesteri, kerebrosidi, gangliosidi, sfingomyeliini ja niiden seokset. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että fosfatidyyliesterit valitaan ryhmästä, jonka muodostavat fosfatidyylietanoliamiini ja fosfatidyylikoliini. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t unnettu siitä, että avustajapeptidi liitetään 25 hydrofobisten vuorovaikutusten avulla liposomin sisälle. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t unnettu siitä, että avustajapeptidi liitetään kovalenttisella sidoksella liposomeja muodostavaan lipidiin liposomin sisälle Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t unnettu siitä, että valmistetaan liposomaalinen immunogeeninen kantaja, joka sisältää noin yhden HA2 - molekyylin lipidimolekyyliä kohti. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 t u n n e t t u siitä, että lipidi on kolesteroli.

22 21 Patentkrav 1. Förfarande för framställning av en liposomal 5 immunogen bärare för antigen, som väsentligen består av en liposombildande lipid, en N-2 (2,4-dinitrofenyl) -Eaminokaproylfosfatidyletanolamin-målantigen, och åtminstone en hjälparpeptid med åtminstone ett T-hjälparcelligenkänningsställe, varvid hjälparcelligenkänningsstället 10 är i eller på liposomen, målantigenen och hjälparpeptiden inte är bundna vid varandra och hjälparpeptiden är en HA2- polypeptidunderenhet av influensavirus, kännetecknat av att målantigenen och hjälparpeptiden ingår i liposomerna Förfarande enligt patentkrav 1, kännet ecknat av att lipiden väljs från gruppen bestående av fosfatidyleter, fosfatidylester, cerebrosid, gangliosid, sfingomyelin och blandningar av dessa. 3. Förfarande enligt patentkrav 2, känne- 20 tecknat av att fosfatidylestrar väljs från gruppen bestående av fosfatidyletanolamin och fosfatidylkolin. 4. Förfarande enligt patentkrav 1, kännet ecknat av att hjälparpeptiden förenas inuti liposomen med hjälp av hydrofob växelverkan Förfarande enligt patentkrav 1, kännet ecknat av att hjälparpeptiden förenas inuti liposomen till en liposombildande lipid med en kovalent bindning. 6. Förfarande enligt patentkrav 1, kännet ecknat av att en liposomal immunogen bärare 30 framställs, vilken innehåller cirka en HA2-molekyl per lipidmolekyler. 7. Förfarande enligt patentkrav 1, kännet ecknat av att lipiden är kolesterol.