S UOM 1 FI N LAN D 0 KUULUTUSJULKAISU UTLÄGGNINGSSKRIFT

Transkriptio

1 S UOM 1 FI N LAN D 0 KUULUTUSJULKAISU UTLÄGGNINGSSKRIFT Kv. lk./int. Cl. C 12 k 5/00 (5:» Uc./KI. 30 h 6 Patentti myönnetty Patent meddelat 11 IX 1972 Patenttihakemus Patentansökning 547 /6 9 Hakemispäivä Ansäkningsdag Alkupäivä Giltighetsdag '969 Tullut julkiseksi Blivit offentlig Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och Pantu nähtäväksi Utlagd IQ Pyydetty etuoikeus Begärd prioritet Sakea-BRD-Tyeklan d B (71) Behringwerke Aktiengesellschaft, Marburgilahn, Saksa -BRD-Tyskland (72)Keksijät -Uppfinnares Anton Mayr, Wöhlerstrasse 72, MUnchen, Kurt Wagener, Haeckel - strasse 1, Hannover 1 Johann Ditrioh Adolf Heinrich Pette, Klaus Petzoldt, 'Neste- Strasse 44, Hannover, Saksa -BRD-Tyskland Asiamies -Ombud: Oy Kolster Ab (54) Menetelmä rokotteen valmistamiseksi hevosten rhinopneumonitisvirusinfektiota vastaan - Förfarande för framställning av ett vaccin mot rhinopneumonivirusinfektion hos häst. Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä rokotteen valmistamiseksi hevosten rhinopneumonitisvirusinfektiota vastaan. Rhinopneumonitisvirus (tammojen virusabortti-virus) aiheuttaa varsoissa hengitystiehytsairauksia ja kantavissa tammoissa tavallisesti keskenmenon. Taudinaiheuttaja kuuluu herpesvirusten ryhmään, joka on levinnyt laajalti. Virus saattaa aiheuttaa suuria taloudellisia menetyksiä hevossiittoloissa. Aikaisemmin ei ole ollut mandollista estää rokotteilla ennenaikaista varsomista, jonka tämä kulkutaudinomaisesti levinnyt virus aiheutti. Kaikki yritykset valmistaa rokote inaktivoitujen tai laimennettujen virusten joukosta, joka pystyisi estämään keskenmenot tammoilla, ovat onnistuneet huonosti, koska immuniteettia ei ole saavutettu tai rokote on ollut liian elinvoimaista. Kun käytettiin kultahamsterista saatua elävää rokotetta tammoille, oli seurauksena ns. rokoreabortti. Nyt on kuitenkin keksitty menetelmä rokotteen valmistamiseksi hevosten rhinopneumonitisvirusinfektiota (tammojen virusabortti) vastaan jolle menetelmälle on tunnusomaista se, että rhinopneumonitisvirusta viljellään kudoksien primäärisissä soluviljelmissä, jotka eivät ole A 61 k 23/00

2 45766 peräisin hevoskudoksista, jatkuvina sarjaviljelminä kunnes sopiva viruksen heikentyminen on aikaansaatu hevosorganismiin sairautta aiheuttavissa ominaisuuksissa, saatuihin tuotteisiin lisätään mandollisesti tavanomaisia muita aineita tai ne kuivataan lyöfiilisesti tarvittaessa. On aikaisemmin tunnettua vähentää tai poistaa viruksien virulenssi heikentämismenetelmän mukaan(esim. Rhodes-van Rooyen: Textbook of Virology 1968 s , brit.pat , A 61 k 3/62, US , , ). Rhinopneumonitisviruksen heikentäminen ei sen sijaan ole aikaisemmin tunnettua. Rhinopneumonitiksen (tammojen virusabortin) kehittäjänä käytetään keksinnössä hevoseläinten herpesvirusta 1, eli rhinopneumonitisvirusta. Esimerkkeinä rhinopneumonitisviruiskannoista mainittakoon kannat RAC-H, Hannover 1835, Army 183 ja Ky-D. Rhinopneumonitisvirusta saadaan esim. varsojen nenälimaa pyyhkäisemällä tai keskenmenneen hevossikiön homogenoiduista elimistä. Virusten viljeleminen voidaan suorittaa tunnetulla tavalla soluviljelmissä (vertaa DULBECCO ja VOGT, J. exp. Med. 99, (1954), sivu 167, ja YOUNGNER, Proc. Soc. exp. Biol. Med. 85, (1954),s. 202) tai eläimissä. Näitä tapoja käyttämällä saadaan virus eristetyksi ja lisääntymään, jotta materiaalia olisi saatavissa riittävästi lisätutklmaksia varten, kuten sarjojen valmistamiseen titraus- ja neutraloimiskokeisiin etc. Tavallisesti käytetään eristämiseen ja viruksen liaännyttämisee; puhdarginwawl Lähtömateriaalina viruksen viljelemistä ja lisäämistä varten soluviljelmässä voidaan käyttää hevosten, nautakarjan, sikojen, lampaiden, vuohien, apinoitten sekä pienien koe-eläinten, kuten kultahamsterin ja kanien elimiä, joista mainittakoon munuaiset, perna, kivekset ja nahka, mutta myös stabiileja solukantoja, kuten esim. BHK 21-soluja, AND-soluja, HeLa-soluja, PK-15-soluja ja RK-13-soluja. Virusten kasvattaminen voidaan myös suorittaa koe-eläimissä esim. kultahamsterissa. Edullisinta on kuitenkin käyttää hevosen tai porsaan munuaisia, tai kultahamstereita. Attenuointi tapahtuu soluviljelmissä, jotka eivät ole peräisin hevoseläimistä. Primääreistä soluviljelmistä mainittakoon esim. ne jotka on saatu elimistä, jotka ovat kuuluneet kavio- ja sorkkaeläimille - ei kuitenkaan hevoselle - ja tällöin tulee kysymykseen ennenkaikkea lampaan ja sian sekä erityisesti porsaan munuaiset. Attenuointiin voidaan myös käyttää keetosolulinjoja. Käytettyjen sarjaviljelmien lukumäärä, joka on tarpeen iaäntäelimistössä ts. hevosessa ilmenevän sairaudenaiheuttajan torjumiseksi,

3 45766 on huomattavassa määrin riippuvainen siitä, mitä soluviljelmää käytetään. Sopiva attenuointi saadaan aikaan käyttämällä ja sopivimmin sarjaa, kun on kysymys lampaan munuaisviljelmäsarjoista, mutta esim , lähinnä sarjaa, silloin kun on kysymys sarjaviljelystä porsaan munuaisissa. teeriot: Onnistuneen virulenssin heikentämisen edellytyksenä on seuraavat kri- a) Kultahamstereilla tulee infektiotiitterin intraperitonaalisen injektion jälkeen laskea alkuperäarvosta vähintäin kolme kymmenluvun potenssia. Titrausta varten valmistetaan laimennussarjoja, joissa konsentraatiot suhtautuivat toisiinsa, kuten luvun kymmenen ekeponentit. Saatua laimennussarjaa käyttäen rokotettiin neljä kultahamsteria annostamalla jokaiselle näistä intraperitonaalisesti 0,2 ml rokotetta. Laskenta suoritettiin käyttämällä seuraavia menetelmiä: BEHRENS, B. Arch.exp.Path.Pharmak. 140, s. 237 (1929) ja KÄRBERG, G. Arch. exp. Pharmak. 162, (1931). b) Kultahamstereissa on immunoivien ominaisuuksien (antigeniteetin) säilyttävä lähtöviruksen suhteen. Tämän takia kultahamsterit rokotetaan viruslaimennoksella (0,5 ml parenteraalisesti) ja lisäksi kolmen viikon kuluttua elinvoimaisella lähtöviruksella (0,5 ml intraperitionaalisesti) ( LD 50 /ml). Testiinfektion saaneista koe-eläimistä on tällöin yli 70 % säilyttävä elossa. c) Tiineet, 7. ja 9. kantokuukauden välillä olevat tammat, jotka ovat alttiita virusabortti-virus tartunnalle, eivät saa sairastua eivätkä saa saada keskenmenoa, kun niille oli annettu elinvoimaista virusta (5 ml, virustiitteri välillä 10 6,5-10 7,5 KID 50 /ml. Paikallisia rokotereaktioita ei saa esiintyä. Lyhytaikaista kakaivaiheista lämmönnousua saattaa esiintyä 18 ja 48 h:n välisenä aikana sekä 8. ja 9. päivänä ensirokotuksen jälkeen, jolloin lämmönnousu on vaaratonta. Toisen rokotuksen jälkeen ei kuumereaktioita saa enää esiintyä. d) 2-3-kuukautisissa varsoissa, joiden elimistössä ei ole rhinopneumonitisviruksen vasta-aineita, ei saa esiintyä sairautta, kun niille annetaan elinvoimaista virusta parenteraalisesti (5 ml, virustiitteri välillä 10 6 ' ' 5 /ml). Lyhytaikainen lämmönnousu on vaaratonta (vertaa c)-kohtaan). KID 50 Lisättäessä adjuvanttia voidaan tätä tarkoitusta varten käyttää epäorgaanisia adjuvantteja (edullisesti aluminiumhydroksidia tai aluminiumfosfaattia ). Tällöin voidaan lisätä myös muita, rokotteen valmistuksessa käytettyjä tavanomaisia apuaineita, esim. stabilisaattoreita. Rokotteen tiitterin tulee olla välillä 106, ,50 KID 50 /ml, lähin. nä 10 7,50 KID 50 /ml. Tarvittaessa voidaan rokote kuivata lyofiilisesti. Keksinnön mukaisten rokotteiden vaikutusta tutkittiin käyttä-

4 45766 mällä kohteina kantavia tammoja. Kokeita varten annettiin 3:11e kantavalle tammalle, joiden kantoaika oli kestänyt 2-3 kk ja/tai, jotka olivat kantokuussa, 5 ml keksinnön mukaista rokotetta. Kontrollitammaa ei rokotettu kantokuulla (virusaborttia esiintyy tammoissa kantoajan viimeisellä kolmanneksella) oleville koeeläimille annettiin 10 ml tarttuvaa rhinopneumonitisvirusta (kanta: Hannover 1835) subkutaanisena injektiona. Kolme immunoitua eläintä varsoi normaalin kantoajan sisällä saaden terveitä varsoja, kun puolestaan kontrollieläinten kohdalla tapahtui keskenmeno virusinfektion seurauksena. Soluviljelmän valmistaminen ja sarjaviljelyjen suoritus tapahtuu tunnettuja menetelmiä käyttäen. Keksinnön mukaiseen menetelmään soveltuva suoritustapa on esitetty lähemmin seuraavassa. Lampaan tai porsaan munuaiset hienonnetaan mekaanisin keinoin ja käsitellään 0,25 %:lla trypsiiniliuoksella fosfaattipuskurissa ph 7,6. Solut vapautuvat kudoksesta yksittäisinä trypsiinin niihin vaikuttamatta ja niiden jakautumiskyky säilyy. Trypsiiniliuokseen suspendoituneet solut eristetään sentrifugoimalla, pestään useaan kertaan esim. fosfaattipuskuroidulla 0,85 %:lla natriumkloridiliuoksella ja suspendoidaan sitten uudelleen viljelmänesteeseen. Sopivia viljelmänesteitä ovat Hanks'in- tai Earlen liuokset ja Eaglen väliaine, Tissue Culture Medium 199 (TCM 199) laktalbumiinihydrolysaatin kera, vasikanseerumi ja sikiöneste, lähinnä naudansikiövesi sekä virusväliaine VM 2a. Edullisia viljelmänesteitä ovat Hanks'in- tai Earlen liuokset, joissa 0,5 % laktoalbumiinihydrolysaattia, 10 % vasikanseerumia, antibiootteja, kuten esim. 100 KY-penitilliiniä ja 50 gammaa streptomysiiniä tai 100 gammaa dihydrostreptomysiiniä/ml ja indikaattorina 0,01 % fenolipunaista. Viljelmänesteen ph säädetään välille 7,0-7,5, sopivimmin 7,3:een lisäämällä natriumbikarbonaattia tai johtamalla siihen 5 %:ta hiilidioksidia. Väliaineeseen suspendoidut solut siirretään lasiastioihin, joissa hautominen tapahtuu 37 C:ssa. Munuaissolut tarttuvat lasiin sen pinnalle, lisääntyvät solujen jakaantuessa ja muodostavat toisiinsa tiiviisti tarttuen kiinteän solumaton. 3-4 vrk:n kuluttua korvataan käytetty ravintoalusta uudella. Kun soluviljelmämatto on kasvanut riittävän suureksi, mikä tapahtuu seuraavien 2-3 vrk:n sisällä, ympätään niihin virussuspensiotal0,5 ml, kun kyseessä on ROUX- tai muu, kuten PETRI-maljaalusta-astia, tai kun viljeleminen on suoritettu koeputkissa käytetään virussuspensiota 0,1 ml. Viruksen ymppäys ja kasvuvaiheet tapahtuvat yleensä 37 C:ssa.

5 Kudosviljelmäsolut lisäävät virusta, jolloin sen kasvu edistyy ravintoalustallaan. Soluviljelmän viruspitoista väliainetta käytetään seuraavassa vaiheessa, kun sarjaviljelmillä valmistetaan sopivaa laimennosta. Täten valmistetun virussuspension ohella voidaan käyttää viljelmäväliainetta VM 2a tai muuta ei-seerumipitoista ainetta,synteettietä väliainetta. Tarkoituksenmukaista on myös tarvittaessa lisätä apuaineita, kuten esim. alumiinihydroksidia ja/tai valmistaa kylmäkuivaamalla kuivapreparaatti. Kuivapreparaatti liuotetaan käytettäessä esim. puskuroituun tislattuun veteen. Esimerkki 1 Infektion saaneen varsan sieraimista otetaan nenälimaa steriilin vanutupon avulla. Vanutuppo huuhdotaan 5 ml:aan Hanks'in väliainetta. Huuhteluneste sentrifugoidaan alhaista kierroslukua käyttäen ( 3000 U/min) 15 minuutin ajan. Jäännöstä (4,5 ml) inkuboidaan puolen tunnin ajan 0,5 ml:n kanssa streptomysiini-penisilliiniliuosta ja sitten lisätään 2 mlhevoeenmunuaiekudoeviljelylle, joka on 100 ml:n erienmeyerkolvissa ja jonka pinnalle on pantu 10 ml viljelyväliainetta. Täten saatu ympätty viljelmä huuhdotaan 24 h:n adsorptioajan jälkeen, jonka jälkeen se peitetään elatusväliaineella (Hanks'in liuos, jossa 0,5 % laktalbumiinihydrolysaattia ja 2,0 % vasikanseerumia, antibiootteja sekä fenolipunaista) ja pidetään 37 C:ssa. Virusviljelmästä teftffin 5 sarjaviljelmää hevosenmunuaisalustalla ja siirretään sitten lampaanmunuaisalustalle. Ymppäykseen käytetään kulloinkin 2 ml edellistä sarjaviljelmää, mutta 20. sarjaviljelmän jälkeen 1 ml on riittävä. Elantoalustana käytetään, kuten edellä, Hanks'in liuosta, jossa on 0,5 % laktalbumiinihydrolysaattia ja 2,0 % vasikanseerumia, antibiootteja sekä fenolipunaista. Viljelmiä tarkkaillaan mikroskooppisesti päivittäin 6-10 vrk:n ajan. Joka 5. sarjaviljelmä valmistetaan ilman seerumia ja kiskeillaan kultahamstereihin virulenssin voimakkuuden toteamiseksi. Tulokseen päästään 25 lampaanmunuaissarjaviljelyn jälkeen. Tällöin viruspitoinen viljelmä eristetään 3a siihen lisätään 0,1 % alumiini- hydroksidia. Saadun rokotteen viruspitoisuus on 10 6, KID 50 /ml. Esimerkki 2 Steriilien olosuhteiden vallitessa eristetään keskenmenneestä hevossikiöstä maksa, keuhkot, perna sekä munuaiset ja saatuihin eri elimiin lisätään natriumkloridi-fosfaattipuskuria (ph 7,2), 100 KY/ml penisilliiniä ja 100 gammaa/ml dihydrostreptomysiiniä sekä merihiekkaa

6 jonka jälkeen saatu seos hierretään huhmarissa ja sentrifugoidaan (20 min., 3000 U/min.). Sentrifugoimisjäännös siirretään 0,5 ml erin vähintäin neljään lasiseen koeputkeen, joissa on porsaanmunuaisalusta (ilman elantoväliainetta), adsorptoitumista varten. Kun viljelmiä oli haudottu hautomakaapissa 37 C:ssa 2 h:n ajan, siirretään ymppäysmateriaali soluviljelmästä ja kukin näistä peitetään 2,0 ml:11a elantoväliainetta (steriiliä naudansikiönestettä, antibiootteja ja fenolipunaista). Viljelmiä tarkkaillaan mikroskooppisesti päivittäin. Kun ominainen solusairaus on todettu, siirretään viljelmäylimäärä adsorptiomenetelmin uudeksi viljelmäksi jatkamalla siitä uusia sarjoja. 5. sarjaviljelmän jälkeen riittää 0,1 ml kunkin seuraavan sarjaviljelmän valmistamiseen sarjaviljelmän jälkeen siirtoon tarvitaan enää vain 100 KY/ml. Joka 20. sarjaviljelmää kokeillaan kultahamstereihin sarjan jälkeen on infektiotiitteri kultahamstereissa laskenut kolme kymmenluvun potenssia. Tämä sarjaviljelmä eristetäzn ja lisätään siihen 0,1 % alumiinihydroksidia. Saadun rokotteen viruspitoisuus on 107$0K1D50/ml.

7 Patenttivaatimukset: 1. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi hevosten rhinopneumonitisvirusinfektiota (tammojen virusabortti) vastaan, t u n n e t t u siitä, että rhinopneumonitisvirusta viljellään kudoksien primäärisissä soluviljelmissä, jotka eivät ole peräisin hevoskudoksista, jatkuvina sarjaviljelminä kunnes sopiva viruksen heikentyminen on aikaansaatu hevosorganismiin sairautta aiheuttavissa ominaisuuksissa, saatu= tuotteeseen lisätään mandollisesti tavanomaista adjuvanttia ainetta tai se kuivataan lyofiilisesti tarvittaessa. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että virulenssin heikentäminen suoritetaan lampaan- tai porsaanmunuaisviljelmällä. 3. Patenttivaatimuksen 1 ja 2 mukainen menetelmä,tunnett u siitä, että virulenssin heikentäminen suoritetaan kestosolulinjoja käyttäen.

8 Patentkrav: 1. Förfarande för framställning av ett vaccin mot rhinppneumonivirusinfektion hos hästar (viruskastsjuka hos ston),kännetecknatdärav, att rhinopneumonivirus odlas i primära cellkulturer av vävnader, som ej härstammar från hästvävnader, såsom kontinuerliga serieodligar tills en lämplig attenuering av viruset har åstadkommits i de för hästorganismen patogena egenskaperna, attden erhållna produkten eventuellt försättes med en övlig adjuvans eller vid behov torkas genom lyofilisering. 2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att attenueringen av virulensen genomförs på får- eller grisnjurcellkulturer. 3. Förfarande enligt patentkraven 1 och 2,känneteckn a t därav, att attenueringen av virulensen genomförs på permanenta cell-lifijer. ViiteJulkaisuja-Anförda oublikationer Julkisia suomalaisia patenttihakemuksia:-offentliga finska patentansökningar: 1032/61, /63 (A 61 k 3/62). Patenttijulkaisuja:-Patentskrifter: Suomi-Finland (A 61 k 3/62). Iso-Britannia- Storbritannien (A 61 k 3/62). USA , (167-78). Muita julkaisuja:-andra publikationer: Rhodes-vanRooyen: Textbook of Virology 1968, p