KUULUTUSJULKAISU. C (45) P2t2::Lti,t ' 11 1=C. (51) Kv.W. 4/Inta.* C 12 P 1/00, A 61 K 39/002, C 07 K 15/04 // C 12 R 1:90

Transkriptio

1 KUULUTUSJULKAISU [B] (11) UTLÄGG N I N GSSKRIFT C (45) P2t2::Lti,t ' 11 1=C SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (51) Kv.W. 4/Inta.* C 12 P 1/00, A 61 K 39/002, C 07 K /04 // C 12 R 1:90 (21) Patenttlhakemus Patentansökning (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (23) Alkupäivä Giltighetsdag (41) Tullut julkiseksi Blivit offentlig (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm Ansökan utlagd och utl.skrlften publicerad (86) Kv. hakemus Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus Begärd prioritet Ranska-Frankrike(FR) Toteennäytetty-Styrkt (71) Institut Mdrieux, 17, Rue Bourgelat, Lyon (2), Ranska- Frankrike(FR) (72) Micha Roumiantzeff, Lyon, Maryvonne Gagnard, Lyon, Pierre Ambroise Thomas, Meylan, Ranska-Frankrike(FR) (74) ForsAn & Salomaa Oy (54) Menetelmä toksoplasma-antigeenin valmistamiseksi toksoplasmaimmuniteetin tutkimiseksi - Förfarande för framställning av toxoplasma-antigen undersökning av toxoplasma-immunitet (57) Tiivistelmä Toksoplasminen antigeeni toksoplasmisen immuniteetin ilmaisemiseksi ihmisessä, joka antigeeni koostuu ekso-antigeenistä, joka on saatu viljelystä, joka on suoritettu ihmisen diploidisoluista peräisin olevassa viljelyväliaineessa. Antigeeni ei sisällä soluseinämän jätteitä eikä seerumia, ja se on konsentroitu tiitteriin vähintään viisisataa toksoplasmista HSR Mrieux marsun yliherkkyysyksikköä ja deaktivoitu. Antigeeni on suspendoitu glyseroliin siten, että sitä voidaan antaa multipunktuuria soveltaen. (57) Sammandrag Toxoplasmisk antigen för detektering av toxoplasmisk immunitet hos människan, sammansatt av exo-antigen som härrör sig från kultur i odlingsmedium som härstammar från människans diploida celler. Antigenen innehåller inga cellväggläingar och inget serum, och den är koncentrerad till en titer om minst femhundra HSR Mrieux toxoplasmiska enheter för hypersensibilitet i marsvin, och är inaktiverad. Antigenen är suspenderad i glycerol för att kunna ges med multipunktur.

2 1 Menetelmä toksoplasma-antigeenln valmistamiseksi toksoplasmaimmuniteetin tutkimiseksi Förfarande för framställning av toxoplasma-antignn för undersökning 5 av toxoplasma-imnitet Keksinnön kohteena on menetelmä toksoplasma-anti.geenin valmistamiseksi toksoplasma-immuniteetin tutkimista varten, jonka menetelmän mukaan soluviljelmään ympätään sopivassa väliai.neessa Toxoplasma gondii ja otetaan 10 talteen viljelyväliaine, josta solut ja toksoplasmat on poistettu, ja joka sisältää toksoplasma-eksoantigeenejä. Toksoplasmoosi on tauti, jolle koko väestö näyttää tulevan yhä herkemmäksi. Se on erikoisen vakava sikiöille, ja toksoplasmisen immuniteetin ha- vaitseminen ennen avioitumista on nyt tehty esim. Ranskassa pakolliseksi. 20 Immuniteetti voidaan tutkia serologisilla kokeilla, mutta yksinkertaisuus- ja kustannussyistä on pyritty käyttämään ihokokeita hidastuneen yliherkkyyden havaitsemiseksi. Jo vuonna 1948 on J.K. Frenkel esittänyt toksoplasma-antigeenejä, ' joita on sanottu "Toksoplasmiineiksi", hidastuneen yliherkkyyden havaitsemiseksi (Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 1948, 68, ). Nämä antigeenit oli muodostettu eläin- 25 ten, kuten hiirien tai hamsterien vatsaontelokalvon tulehdusnesteessä olevien loisten raakajauheesta, jolloin 0,25-prosenttista fenolia on käytetty suoja-aineena reagenssin mandollisten saastumisten estämiseksi varastoinnin aikana. Tämän tyyppinen reagenssi on sitten tuotu markkinoille, ja sitä on laajalti käytetty (katso julkaisuja W.F. Mc 30 CULLOCH - Public Health Reports 1963, 78 n:o 8, " ja J.L. 35 KRAHENBUHL - Infection and Immunity 1971, 3, n:o 2, ). Tällainen valmiste ei kuitenkaan ole tyydyttänyt nykyisiä vaarattomuusnormeja hiirien tulehdusnesteessä mandollisesti esiintyvien kontaminanttien takia. Sittemmin on yritetty valmistaa antigeenivalmisteita viljelemällä loista Toxoplasma gondii apinan munuaissoluista peräisin olevia solulinjoja

3 2 1 käyttäen. Antigeeni on saatu jäähdyttämällä ja sulattamalla talteenotettuja loisia (katso S.D. CHAPARAS et al. - Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 1966, 121, ). Näillä antigeenisillä valmisteilla, joita on käytetty ruiskuttamalla aiheutettua ihonsi- 5 säistä reaktiota soveltaen, esim. käyttämällä reagenssia, joka on valmistettu J.K. Frenkel'in töiden perusteella, on kuitenkin haittana, että ne sisältävät lukuisia loisista peräisin olevia hiukkasia. Tämän jälkeen on voitu osoittaa viljelyistä, joissa on käytetty ihmi- 10 sen diploidisoluista peräisin olevia solulinjoja tai apinan munuaissoluista peräisin olevia solulinjoja, että toksoplasmat vapauttavat viljelyväliaineessa ekso-antigeenejä (P.T. DESGEORGES, X. BILLIAULT, P. AMBROI- SE-THOMAS ja M. BOUTTAZ, Lyon Medical 30, 06, , 12, ). On täten voitu osoittaa edulliseksi käyttää tällaisia toksoplasma-ekso-anti- geenejä toksoplasmisen immuniteetin tutkimiseksi. Näiden antigeenien etuna on itse asiassa, että niissä ei ole käytännöllisesti katsoen mitään toksoplasmoista kotoisin olevia hienojakoisia materiaaleja, ja että ne eivät sisällä soluista kotoisin olevia saasteita. Täten selitetyt antigeeniset valmisteet eivät kuitenkaan sovellu käytettäviksi ihmislää- 20 kinnän alalla. Keksinnön tarkoituksena on näin ollen aikaansaada tällainen toksoplasma-antigeeni toksoplasmisen immuniteetin tutkimiseksi, jolla antigeenillä on suuri puhtausaste, eikä siinä ole saasteita, jotka voisivat aiheut- 25 taa suuria herkistymisvaaroja ihmisissä. Keksinnön toisena tarkoituksena on aikaansaada sellainen antigeeni, jonka 30 avulla voidaan tutkia toksoplasma-immuniteettia ihokokeilla multipunktuuria soveltaen. Keksinnön tarkoituksena on edelleen aikaansaada sellainen antigeeni, jota myös voidaan käyttää serologisissa kokeissa. Keksinnön tarkoituksena on lisäksi aikaansaada sellainen antigeeni, joka 35 ei aiheuta vaaroja virussaastumisesta. Keksinnön mukainen menetelmä toksoplasma-antigeenin valmistamiseksi tokso-

4 3 1 plasmisen immuniteetin ilmaisemiseksi ihmisessä tai eläimessä on tunnettu siitä, että viljely suoritetaan toksoplasmojen ollessa läsnä väliaineessa, josta eläinseerumi, varsinkin vasikanseerumi on poistettu, että poistetaan soluista tai toksoplasmoista peräisin olevat toksoplasmojen ja seinämän 5 jätteet steriloivasti suodattamalla, että suodatuksen jälkeen saadussa liukoisessa antigeenissä mandollisesti läsnä olevat virushiukkaset deaktivoidaan edullisesti formaliinilla, ja että liukoinen antigeeni konsentroidaan deaktivoinnin jälkeen. 10 Yksi HSR-yksikkö on määritelty antigeenimääräksi, joka ihonalaisesti ruiskutettuna 0,1 ml:n annoksena erikoisesti herkistettyyn marsuun antaa 100 mm reaktion 18 tunnissa tai 24 tunnissa. Antigeenin konsentraatio on edullisesti suuruusluokkaa kaksisataakertainen, verrattuna alkuperäiseen saantoon. Soluviljelyssä voidaan käyttää eri eläinlajien, kuten apinan, sian, kananpoikasten primäärisistä munuaissoluista peräisin olevien solujen solulinjoja, mutta edullisesti käytetään joko ihmisen diploidisoluista peräisin 20 olevia tai eläinten heteroploidisista soluista peräisin olevia solulinjoja. Edullisesti käytetään ihmisten diploidisoluista peräisin olevina solulinjoina erästä solulinjaa MRC5, jota ovat kuvanneet J.P. JACOBS et al Nature 1970, 227, n:o 5254, , ja sitä on esim. saatavissa laitoksesta National Institute for Medical Research Holly Hill - London NW3 - Iso-Britannia. Eläinten heteroploidisten solujen solulinjana käytetään edullisesti ei- 30 tuumorigeenisiä solulinjoja, kuten erästä solulinjaa VERO, jota ovat kuvanneet B.J. MONTAGNON et coll. Intern. Symp. julkaisussa Reassessment of Inactivated Poliomyelitis Vaccine, Bilthoven 1980, Develop. Biol. Standard, 47, s (S. Karger, Basel 1981). 35 Keksinnön eräässä erikoisen edullisessa suoritusmuodossa suoritetaan riittävän suuri konsentroiminen, joka on vähintään 190-kertainen ja edullisesti noin 200-kertainen siten, että saadaan antigeeni, jonka

5 4 1 tiitteri on vähintään 160 yksikköä ELISA-kokeessa, mikä likimain vastaa 500 HSR Me"rieux-yksikköä, minkä jälkeen antigeeni suspensoidaan glyseroliin siten, että voidaan käyttää tätä antigeeniä naarmuttamismenetelmän, varsinkin multipunktuurimenetelmän avulla. 5 Antigeenin ELISA-tiitteri on laimennukseu käänteisarvon log, joka laimennus vastaa 507 optisesta maksimitiheydestä, joka määritellään käyttämällä levyä, joka sisältää antigeeniä ylimäärin. Tuntemattoman antigeenin aktiviteetti lausutaan suhteessa samoissa olosuhteissa 10 titratun standardi-antigeenin aktiviteettiin. Lasketaan suhteellinen tehokkuus, joka on yhtä kuin tuntemattoman antigeenin EL1SA-tiitterin ja standardi-antigeenin välisen eron antilogaritmi. Kokeiltavan antigeenin lopullinen tiitteri saadaan kertomalla sen suhteellinen tehokkuus standardi-tiitterillä, ja tulos esitetään yksikköinä millilitraa kohden. Soluviljelyä jatketaan edullisesti ymppäyksen jälkeen noin 6 päivää 37C:ssa. 20 Suodatusvaiheeseen voi edullisesti sisältyä ensimmäinen steriloiva suodatus, minkä jälkeen seuraa ultrasuodatusdialyysi ja sitten uusi steriloiva suodatus. Deaktivointi suoritetaan edullisesti formaliinilla suhteessa 1: noin 24 tunnin aikana huoneenlämmössä ja jatkuvasti sekoittaen. Erään edullisena pidetyn suoritusmuodon mukaan suspendoidaan täten konsentroitu antigeeni glyseroliin tai muuhun kantoaineeseen siten, että sitä voidaan käyttää naarmutusmenetelmää, varsinkin multipunk- 30 tuuria soveltaen. Keksinnön muut edut ja tunnusmerkit selviävät luettaessa seuraavaa selitystä, joka on esitetty esimerkkinä. 35 Suoritetaan solujen MRC 5 viljely EAGLE BME-väliaineessa, johon on lisätty 10% vasikanseerumia. Tämä viljely suoritetaan pullossa, jonka pinta on noin 500 cm 2.

6 5 Viljely suoritetaan 37C:ssa 3 päivän aikana, jolloin solujen alkukonsentraatio on 20 miljoonaa pulloa kohden EAGLE BME-väliaineessa, jossa lisäksi on 10% vasikanseerumia. Kolmantena päivänä väliaine korvataan EAGLE BME-väliaineella, johon on lisätty 2% vasikanseerumia. Pulloja 5 pidetään jälleen 37C:ssa 4 päivää. Tämän jälkeen pestään solukerros väliaineen tultua poistetuksi kolmasti fysiologisella suolavedellä ja pannaan solut jälleen EAGLE BME-väliaineeseen, jossa ei ole vasikanseerumia. Kaksikymmentäneljä tuntia näiden pesujen jälkeen vaihdetaan jälleen BME-väliaine uudeksi ilman vasikanseerumia, ennen kuin loiset 10 lisätään. Toksoplasmat, joita on ylläpidetty Swiss-tyyppisissä naarashiirissä, ympätään 2,4 x 10 toksoplasmaa suuruisena määränä viljelyväliaineen millilitraa kohden. Tämän jälkeen suoritetaan viljely kuuden vuorokauden aikana 37C:ssa. Kuudennen päivän jälkeen viljelyn pinnalle nouseva kerros otetaan talteen ja suoritetaan sillä ensimmäine steriloiva suodatus (esisuodatin AP 20 -AW 0,6-steriilit Millipore -suodattimet 0,22 ). 20 Tämän jälkeen lisätään formaliinia suhteessa 1:1000, ja liuos pidetään huoneenlämmössä jatkuvasti sekoittaen 24 tunnin aikana. Tätä deakti- 25 vointivaihetta seuraa ultrasuodatusdialyysi ja vähintään noin 200- kertainen konsentroiminen Amicon-materiaalilla (kolonni ja solut) kaivoa PM 10 käyttäen. Tämän jälkeen konsentraatilla suoritetaan vielä steriloiva uudelleensuodatus peräkkäisillä (AP 20,8...0,45, 0,22 ). 30 Tässä vaiheessa on saadun antigeeniliuoksen hidastunut yliherkkyystiitteri marsussa vähintään % toksoplasmista HSR Merieuxyksikköä. Puhdistettu liukoinen antigeeni, joka on konsentroitu ja deaktivoitu, 35 titrataan tämän jälkeen serologisesti "in vitro" ELISA-kokeella, minkä jälkeen sen hidastunut yliherkkyysaktiviteetti kalibroidaan titraamalla "in vivo" marsuissa, jotka on ennalta herkistetty Toxoplasma

7 6 1 gondii'n erikoisuutteella. 5 Lopuksi antigeeni suspendoidaan 70 prosenttiseen glyseroliin. Tämä valmista on tarkoitettu pantavaksi multipunktuurilaitteen kärkiin. Esikliinisillä tutkimuksilla on saatu seuraavat tulokset: Marsuilla 10 Laimennus Antigeenit puhdas kolmas- osa, kymmenes- osa kolmaskymme- nesosa sadasosa Koeryhmä X 5,5 mm 4,2 2,5 0 0 Koeryhmä Y 5,8 mm 4,2 3,2 2,

8 7 1 Ihmisissä Ser. Antigeeni X Antigeeni X Antigeeni X 5 puhdas 1/3 1/10 T.L. p.i. 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h kohde 160 4,5 4,5 3, A u.i. kohde , B u.i. kohde , C u.i. 20 kohde D Edellä esitetyn taulukon lyhenteiden selitys: - Ser. : serologia 25 - T.L. :lukuajankohdat - p.i. : immunofluoresenssin avulla - u.i. : kansainvälistä yksikköä 30 35

9 8 1 Patenttivaatimukset 1. Menetelmä toksoplasma-antigeenin valmistamiseksi toksoplasma-immuniteetin tutkimista varten, jonka menetelmän mukaan soluviljelmään ympä- 5 tään sopivassa väliaineeseessa Toxoplasma gondii ja otetaan talteen viljelyväliaine, josta solut ja toksoplasmat on poistettu, ja joka sisältää toksoplasma-eksoantigeenejä, tunnettu siitä, että viljely suoritetaan toksoplasmojen ollessa läsnä väliaineessa, josta eläinseerumi, varsinkin vasikanseerumi on poistettu, että poistetaan soluista tai tok- 10 sopiasmoista peräisin olevat toksoplasmojen ja seinämän jätteet steriloivasti suodattamalla, että suodatuksen jälkeen saadussa liukoisessa antigeenissä mandollisesti läsnä olevat virushiukkaset deaktivoidaan, edullisesti formaliinilla, ja että liukoinen antigeeni konsentroidaan deaktivoinnin jälkeen. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suoritetaan vähintään kaksisataakertainen konsentrointi. 3. Jommankumman patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n nettu siitä, että käytetään ihmisen diploidisoluista peräisin ole- -20 vaa solulinjaa, ja varsinkin solulinjaa MRC Jommankumman patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n - nettu siitä, että käytetään eläinten heteroploidisista soluista 25 peräisin olevaa solulinjaa, ja varsinkin solulinjaa VERO. 5. Jommankumman patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n - nettu siitä, että käytetään primäärisolujen viljelmää Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeeni suspendoidaan glyseroliin. 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluviljelyt suoritetaan ymppäyksen jälkeen 6 päivän aikana C:ssa. 8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu

10 9 1 siitä, että suodatukseen sisältyy steriloiva suodatusvaihe, minkä jäl- keen seuraa ultrasuodatusdialyysi ja sitten uudelleen steriloiva suodatus Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että deaktivointi suoritetaan formaliinilla. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että deaktivointi formaliinilla suoritetaan noin kandenkymmenenneljän 10 tunnin aikana formaliinilla suhteessa 1:1000 huoneenlämmössä

11 10 1 Patentkrav 1. Förfarande för framställning av en toxoplasmisk antigen för detektering av toxoplasmisk immunitet, varvid man inokulernr Toxoplasma gondii i 5 en cellkultur i ett lämpligt medium, och att man tager tilivara kultur- mediet som är befriat från celler och toxoplasmer och som innehåller toxoplasmiska exo-antigener, kännetecknat därav, att man utför odlingen i närvaro av toxoplasmer i ett kulturmedium som är befriat från djurserum, såsom särskilt kalvserum, att man eliminerar läingarna 10 av toxoplasmerna och väggarna som härrör sig från cellerna eller toxoplasmerna genom steriliserande filtrering, att viruspartiklarna som eventuellt är närvarande i den lösliga antigenen efter filtreringen, deaktiveras, fördelaktigt med formalin, och att den lösliga antigenen koncentreras efter deaktiveringen. 2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att man utför en minst tvåhundrafaldig koncentration. 3. Förfarande enligt någotdera av patentkraven 1 eller 2, känne- 20 t e c k n a t därav, att man använder en cellinje som härrör sig från diploidceller från människan, och särskilt cellinjen MRC Förfarande enligt någotdera av patentkraven 1 eller 2, kännetecknat därav, att man använder en cellinje av heteroploida djur- 25 celler, och särskilt cellinjen VERO. 5. Förfarande enligt någotdera av patentkraven 1 eller 2, kännetecknat därav, att man använder en kultur av primärceller Förfarande enligt något av patentkraven 1-5, k ä n n e t e c k n a t därav, att man suspenderar antigenen i glycerol. 7. Förfarande enligt något av patentkraven 1-6, kännetecknat 35 därav, att man utför cellkulturen efter inokulering under 6 dagar vid 37 C. 8. Förfarande enligt något av patentkraven 1-7, kännetecknat

12 11 1 därav, att filtreringen omfattar ett steriliserande filtreringssteg efterföljt av en ultrafiltreringsdialys och sedan en ny steriliserande filtrering Förfarande enligt något av patentkraven 1-8, k ä n n e t e c k n a t därav, att man utför deaktiveringen med formalin. 10. Förfarande enligt patentkravet 9, k ä n n e t e c k n a t därav, att man utför deaktiveringen med formalin under ca tjugofyra timmar med 10 formalin vid ett förhållande på 1:1000 vid rumstemperatur. Viitejulkaisuja-Anförda publikationer CA, vol. 62 (1965), 4369 d-g. CA, vol. 64 (1966), a