GLUTEENIANALYTIIKKA KELIAKIAN KANNALTA. Viljateknologien Helmikollokvio Hartwall, Lahti Päivi Kanerva

Transkriptio

1 GLUTEENIANALYTIIKKA KELIAKIAN KANNALTA Viljateknologien Helmikollokvio Hartwall, Lahti Päivi Kanerva

2 Gluteenittomuus Gluteenittomia tuotteita koskevan standardin on asettanut Codex Alimentarius Commission Codex Alimentarius Commission on FAO:n ja WHO:n alainen, ja asettaa mm. elintarvikestandardeja sekä antaa toimintaohjeita Gluteenittomien tuotteiden standardi sisältää gluteenittomien tuotteiden määritelmän sallitut raja-arvot gluteenipitoisuudelle suosituksen gluteenipitoisuuden määrittämisessä käytettäväksi menetelmäksi

3 Gluteenittomien tuotteiden standardi Gluteenittomuus perustuu näytteen kokonaistyppipitoisuuteen Sallittu typen määrä 0,05 g typpeä /100 g näytettä (kuivapaino) Typenmääritysmenetelmillä (Kjeldahl, Dumas) saadaan näytteen kokonaisproteiini ONGELMA: Monet elintarvikkeet sisältävät suuren määrän proteiinia, joista vain osa keliaakikoille haitallisia.

4 CODEX:n asettamat uudet vaatimukset menetelmältä Menetelmän tulee kvantitatiivisesti mitata gluteenipitoisuus elintarvikkeista ja niiden valmistusaineista Menetelmän tulee perustua immunologiseen mittaukseen tai muuhun menetelmään, jolla on vastaava herkkyys ja tarkkuus Vasta-aineen tulee tunnistaa proteiinifraktiot, jotka ovat haitallisia keliaakikoille Vasta-aine ei saa reagoida muiden viljaproteiinien tai muiden elintarvikkeissa esiintyvien proteiinien kanssa Toteamisrajan tulee olla vähintään 10 mg gluteenia / kg, jolloin prolamiinin toteamisraja on 5 ppm Sallittu gluteenipitoisuus on 20 tai 100 ppm näytteestä riippuen

5 Immunologiset, vasta-aineisiin perustuvat menetelmät ELISA enzyme-linked immunosorbent assay menetelmä perustuu proteiinin tunnistukseen sen vastaaineen avulla gluteenianalytiikassa käytettyjä vasta-aineita ovat ω- gliadiinin vasta-aine ja R5-vasta-aine proteiini vasta-aine

6 SANDWICH ELISA Entsyymin Toinen läsnäollessa Vasta-aine, vasta-aine kromogeenin jonka sitoutuu avulla näyteproteiiniin. väri halutun muuttuu. proteiinin tunnistaminen tapahtuu Mitä enemmän Vasta-aineeseen sitoutunutta on sidottu proteiinia, entsyymikonjugaatti. sitä voimakkaampi väri.

7 ω-gliadiinin vasta-aineeseen perustuva gluteenipitoisuuden määritys ω-gliadiinit ovat vehnän keliaakikoille haitallisiin proteiineihin kuuluva alaryhmä EDUT ω-gliadiinit sietävät hyvin kuumennusta ne eivät denaturoidu elintarvikkeiden valmistuksessa kuten muut proteiinit myös ruis ja ohra sisältävät vastaavia proteiineja ONGELMAT ω-gliadiinien suhteellinen osuus vaihtelee eri lajikkeiden välillä vasta-aine ei tunnista hyvin ohran vastaavia proteiineja

8 Stand. gliadiini BIO durumvehnä EMM emmervehnä EIN einkorn-vehnä CWR kevätvehnä HRZ ruisvehnä REK syysvehnä SKO spelttivehnä Wieser&Seilmeier, PWG 1998

9 R5-vasta-aineeseen perustuva gluteenipitoisuuden määritys Vasta-aine tunnistaa viiden aminohapon peptidin, QQPFP, sekä sitä vastaavia peptidejä EDUT R5-vasta-aine tunnistaa prolamiineille tyypillisen toistuvan sekvenssin vasta-aine tunnistaa myös ohran ja rukiin proteiinit ONGELMAT R5-vasta-aine reagoi myös ei-haitallisten proteiinien kanssa (mm. soija, PWG 2006) vasta-aine reagoi voimakkaammin ohran proteiinien kanssa kuin muiden viljojen

10 Standardin vaikutus R5-ELISA-analyysiin Gliadiinistandardi Hordeiinistandardi Tunnettujen ohrakontaminaatiopitoisuuksien määritys antoi huomattavasti todellista suurempia gluteenipitoisuuksia Ohrastandardin avulla saatiin virhe korjattua

11 Kompetetiivinen R5-ELISA proteiinihydrolysaateille kehitetty tuotteille, joissa proteiinit pilkkoutuneet kompetetiivinen määritys perustuu kilpailuun alustalle sidottujen proteiinien ja näytteen sisältämien proteiinien välillä eli vasta-aine sitoutuu joko näyteproteiineihin tai alustalle Kompetetiivisessa menetelmässä tarvitaan tunnistukseen vain yksi sitoutumiskohta Menetelmä on herkempi, mutta ei yhtä spesifinen kuin sandwich KOMPETETIIVINEN SANDWICH

12 RIDASCREEN Gliadin competitive r-biopharm Standardina QQPFP-peptidi Näytteistä saadaan peptidipitoisuus, jota ei voida muuntaa gluteenipitoisuudeksi Proteiinin hydrolysoitumisaste vaikuttaa tuloksiin mitä suurempi peptidi, sitä voimakkaammin se sitoo vasta-aineita kokonainen gliadiiniproteiini sitoo vasta-aineita 250 kertaa tehokkaammin kuin peptidi QQPFP ohran ja rukiin kokonaisille proteiineille vastaavaa kerrointa ei tiedetä Ei tiedetä tarkalleen, mihin peptideihin vasta-aine sitoutuu

13 Kiitos

14 Näytteessä ei yhtään prolamiinia Näytteessä paljon prolamiinia - + Lisätty Pohjaan kiinnitetty gliadiinistandardi Sitoutumaton kromogeeni värjäytyy materiaali entsyymin huuhdellaan läsnäollessa pois Kuoppaan lisätään vasta-aine ja näyte