1 % KUULUTUSJULKAISU UTLÄGGNINGSSKRIFT t_ s 1-1 (45) Patent meddei2t. (51) Kv.lit3fint.cl 3 C 12 N 7/02, A 61 K 39/205

Transkriptio

1 [B] 1 % KUULUTUSJULKAISU UTLÄGGNINGSSKRIFT t_ s 1-1 (45) Patent meddei2t (51) Kv.lit3fint.cl 3 C 12 N 7/02, A 61 K 39/205 SUOMI-FINLAND (F1) Patentti- ja rekisterlhallitus Patent- och registerstyrelsen (21) Patenttlhakemua PatentansäknIng (22) HakemIspalvil AnealtnInpdag (23) Alku pilvi G IltIghetsdag (41) Tullut Julkiseksi 811vIt offerellg (44) Nthtivikalpenon Ja kuullulkalsun pvm. ~Oksa utlagd och utl.skriften publicerad (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus--begllyd prlorltet Iso -Britannia -Storbritannien(GB) 3258/77 (71) Gist-Brocades N.V., 1, Wateringseweg, Delft, Alankomaat-Nederländerna(NL) (72) Gosse Bijlenga, St. Didier au Mont d'0r, Ranska-Frankrike(FR) (7 14) Berggren Oy Ab (5 14) Menetelmä uuden raivotautiviruskannan eristämiseksi - Förfarande för isolering av en ny rabiesvirusstam Tämän keksinnön kohteena on menetelmä uuden raivotautiviruskannan eristämiseksi. Erikoisesti tämä keksintö koskee uuden viruskannan, jota seuraavassa nimitetään viruskannaksi 675, eristämistä valitsemalla spesifinen plakki in vitro tapahtuvan sytopaattisen vaikutuksen suhteen, mitä seuraa kolme kloonausta. On tunnettua yrittää suojata lämminverisiä eläimiä raivotautitartuntoja vastaan parenteraalisen rokotuksen avulla Lesim. rokotteilla LEP (Low Egg Passage) Flury tai HEP (High Egg Passage) Flury, joita saadaan seuraavassa selostetulla tavalla/. Tammikuun 29. p:nä 1939 Flury-niminen tyttö kuoli Georgian valtiossa USA:ssa, kuolinsyyn ollessa diagnoosin mukaan raivotauti, jonka tartunnan tyttö oli saanut raivotautisesta koirasta. Raivotautivirus eristettiin tytön aivoista, kyynelrauhasesta ja sylkirauhasesta ja siirrostettiin intracelebraalisesti valkoisiin hiiriin, kuten on selostettu kirjoituksessa: Leach C.N. & Johnson H.N., Amer. J. Trop. Med. 1940, 20: 335.

2 Hiiristä saatua aivokudosta siirrostettiin intracelebraalisesti yhden päivän vanhoihin kananpoikiin, ja sen jälkeen suoritettiin 136 intracelebraalista siirrostusta kananpoikiin kirjoituksen Koprowski H. & Cox H.R., J. Immunol. 1948, 60: 533 mukaan. Edelleen kanden intracelebraalisesti kananpoikiin suoritetun siirrostu ksen jälkeen raivotautivirus siirrettiin kananpoika-alkioihin keltuaispussiin tehdyn siirrostuksen avulla. 60 keltuaispussisiirrostuksen jälkeen virus osoittautui olevan tautia synnyttämätön useitten nisäkkäitten suhteen, ja virusta on saatavissa tällä siirtoistutustasolla raivotauti-rokotteena koiria varten nimellä LEP Flury-rokote. Kun edelleen suoritettiin siirtoistutuksia kananpoika-alkioihin (aina siirrostukseen saakka), virus osoitti menettäneen paljon enemmän patogeenissuuttaan, niin että kaksi viikkoa vanhat laboratoriohiiret eivät kuolleet viruksen intracelebraalisen siirrostuksen jälkeen, vaikka imeväiset hiiret kuolivat. Tätä rokotetta on saatavissa nimellä HEP Flury-rokote. Vaikka nämä LEP- ja HEP-rokotteet ovat olleet tehokkaita raivotautitartunnan ehkäisyssä käytettäessä niitä rokotteina ennen altistusta, muunlaisten raivotautirokotteiden tarvetta on olemassa, kuten on osoitettu viimeaikaisilla uusilla kontrollitoimenpiteillä kansallisella ja kansainvälisellä tasolla. Esimerkiksi sylvaattisen raivotaudin hallinta kehittyneissä maissa, joissa tämä tauti on esiintynyt jo pitkän aikaa tai joihin se on äskettäin saapunut, on eräs vaikeista ja ekologisesti monimutkaisista ongelmista, joita varten mitään tehokasta ja taloudellista menetelmää ei ole käytettävissä. Myös infektion jälkeinen ihmisten rokotus on aiheuttanut useita ongelmia raivotaudin saastuttamissa maissa kautta maailman. Näistä syistä raivotaudin tutkimus on suunnattu ongelmiin, jotka koskevat infektion jälkeistä ja sitä edeltävää rokotusta sekä immunointia ei-parenteraalista tietä, sopivimmin suun kautta. Tutkimuksen ja kokeitten tuloksena on kehitetty uusi viruskanta, jota voidaan rokotteena antaa erilaisilla tavoilla, ts. jota voidaan antaa parenteraalisesti tai ei-parenteraalisesti, ja jonka on todettu aikaansaavan täyden suojan annettuna joko ennen raivotautitartun- taa tai sen jälkeen. Mandollisuus antaa ainetta suun kautta ("oraalinen rokotus") villi-

3 eläimille, jotka ovat tärkeimpiä raivotautitartunnan levittäjiä ja/ tai tämän taudin lähteitä, on katsottava tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun viruskannan sovelletun muodon tunnusomaiseksi piirteeksi. Uusi viruslaji eristettiin seuraavasti: Rokotteen HEP Fiury-virusta kasvatettiin primaarisissa ja sekundaarisissa kananpoika-alkion fibroblasteissa (SPF), ja se myös todettiin raivotautivirukseksi näiden tartutettujen fibroblastien spesifisen immuunifluoresenssin avulla, hiirensuojauskokeella käyttäen vatsaontelonsisäistä rokotusta ja sen jälkeen standardisoidun raivotautia aiheuttavan viruksen (CVS) istutusta, sekä in vitro suoritetuilla seroneutralointikokeilla käyttäen tunnettua positiivista seerumia (kansainvälistä raivotaudin vertausseerumia). On selvää, että rokotteen HEP Flury-viruksen kasvattamiseksi voidaan käyttää myös muita raivotaudille herkkiä solulinjoja ja diploidisolukantoja SPF kananpoika-alkion fibroblastien sijasta. Käyttämällä piakin määritysmenetelmää kananpoika-alkion fibroblasteissa (SPF) kirjoituksen Yoshina, K. et al., Arch. ges. Virusforsch., 1966, 18: 370 mukaan, sekä plakkisolususpensiomenetelmää kirjoituksen Bijlenga, G. & Joubert, L., Bull. Soc. Sci. V6t. et M6d. Compar6e, Lyon, 1974, 76: 429 mukaan, oli mandollista eristää plakki, joka selvästi erosi alkuperäisestä viruskannasta tartutettuihin soluihin kohdistuvan sytopaattisen vaikutuksen suhteen. Tämä plakki kloonattiin kolme kertaa homogeenisen ja puhtaan viruskannan aikaansaamiseksi. Alkuaan eristetylle plakille annettiin numero 675 ja puhdistuksen jälkeen saadulle kannalle merkintä: raivotautirokotekanta n:o 675. Näyte tästä kannasta talletettiin Prahan hygienian ja kulkutautiopin laitoksen kokoelmaan "Czechoslovak National Collection of Type Cultures", jossa se rekisteröitiin numerolla CNCTC AO 4/77. Laji eroaa alkuperäisestä HEP Flury-viruksesta seuraavien ominaisuuksien suhteen: a) Erittäin selvä sytoraattinen vaikutus soluviljeln'iin koeputkessa, joka eroaa voimakkuudeltaan alkuperäisen HEP Flury-viruksen aiheuttamasta sytopaattisesta vaikutuksesta bl Lyhentynyt primaarinen lisääntymissykli, joka vaihtelee välillä

4 tuntia (HEP kannalle tuntia), aiheuttaen plakkien nopeamman ilmaantumisen, ns. häiriövaikutuksen puuttuminen, johtuen viruskannan puhtaudesta (kloonaus), siten ei viruskanta 675 sisällä ns. DI partikkeleita (defective interfering particles). c) Plakkien alueella ei esiinny eläviä soluja, kun taas HEPviruksen aiheuttamissa plakeissa on aina joitakin eläviä soluja. Tämän vuoksi viruskannan 675 plakit ovat hyvin kirkkaat (läpinäkyvät) ja HEP-viruksen plakit sameat. Morfologisesti viruskannan 675 plakit ovat isompia ja yleensä keskenään enemmän yhtenäisen muotoiset kuin HEP-viruksen plakit. d) Parempi kiinnityskyky solujen pintaan koeputkessa, mikä ominaisuus on olennainen riittävää suun kautta tapahtuvaa rokotusta varten. In vitro tutkimuksissa on havaittu, että viruskannan 675 suhteen ei voitu huomata eroja soluihin kiinnittymisessä käytettäessä DEAE-dekstraania. HEP-viruksen kohdalla taas huomattiin selvästi, että useammat solut infektoituivat viruksella käytettäessä DEAE-dekstraania. Tämä ilmiö voidaan selittää sillä, että viruskanta 675 on puhtaampi, mutta sen pinnassa saattaa myös olla pieniä eroja HEP-virukseen verrattuna. e) Interferonin nopeampi muodostuminen (noin 60 minuuttia) elimistössä rokotuksen jälkeen johtuen yllämainituista ominaisuuksista. Tämä ominaisuus on tärkeä infektion jälkeistä rokotusta varten. f) Soluviljelmissä saadaan suurempia pitoisuuksia. g) Kloonauksella saadaan homogeenisia viruskantoja,jonka seurauksena on pienempi vaara, että viruslaji mandollisesti palautuu alkuperäiseen patogenisuuteensa, mikä palautuminen käytännöllisesti katsoen ei tapandu. Tutkittaessa viruskantaa 675 nuorilla (4 viikkoa) hiirillä todettiin, ettei viruksen patogenisuus kasvanut kymmenen perättäisen intracelebraalisen siirrostuksen jälkeen, kun taas HEPviruksen kohdalla oli huomattavissa patogenisuuden kasvua jo yhden siirrostuksen jälkeen (ks. H.F. Clark, Science, 199 (1978), s ja H. Koprowski, Bull. W.H.O., 10 (1954), s. 709). Tämä viruskannan 675 "stabiliteetti" on hyvin tärkeä ominaisuus kun sitä käytetään lisättynä syötteihin luonnonvaraisten eläinten immunisoimiseksi. Tällöin ei saisi esiintyä rokotteen patogeenisuuden kasvua.

5 h) Tällä raivotautiviruskannalla on vähiten tauteja synnyttäviä ominaisuuksia toistaiseksi saatavissa olevista kannoista. Tutkimuksissa (Staatliches Veterinär unter Suchungsamt, Frankfurt am Main) on todettu, että HEP-rokote on patogeeninen hiirille. Kärpän ja ruskean rotan aivoissa voitiin todeta HEP-viruksen replikaatiota. Uusi viruskanta 675 ei osoittanut patogeenisuutta yllä mainittujen eläinlajien kohdalla eikä myöskään lukuisten muiden tutkittujen eläinlajien kohdalla. On huomattava, että edellä kohdissa a-h esitetyt ominaisuudet osoittavat selvää eroavaisuutta alkuperäisestä HEP Flury-viruksesta. Yllä mainittujen ominaisuuksien, erikoisesti ominaisuuden (g) ansiosta vakinaisen laadun omaavien rokote-erien valmistus helpottuu, ts. parannetun koostumuksen omaavia rokotteita voidaan valmistaa keksinnön mukaan eristetyst!iviruskannasta n:o 675. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä eristetystä viruksesta valmistetut rokotteet aiheuttavat hyvin nopean interferonin muodostuksen sekä lisäksi muita tuntemattomia ehkäiseviä ominaisuuksia, esim. solujen välittämän immuniteetin. Niinpä yksi rokotus edellä mainitulla rokotteella patogeenisellä raivotautiviruksella suoritetun infektoinnin jälkeen voi aikaansaada täyden suojan.interferonin erittäin nopean muodostumisen ja solujen välittämän immuniteetin johdosta keksinnön mukaisten rokotteiden käyttö äskettäin infektoitujen eläimien suojaukseen raivotautiepidemian aikana on nyt toteutettavissa. Erikoisesti mandollisuudet ihmisten rokottamiseen infektoitumisen jälkeen ovat huomattavasti parantuneet, koska rokotteet ovat osoittautuneet olevan erittäin tehokkaita eläimissä tartunnan jälkeen, ja koska ne voivat jopa parantaa eläimiä niiden ollessa hyvin pitkälle kehittyneessä infektoidussa tilassa. Aktiivisen virusrokotteen ei-parenteraalinen, esim. suun kautta tapahtuva anto helpottaa sen käyttöä organisoidussa rokotuskampanjassa.

6 Patenttivaatimus Menetelmä uuden raivotautiviruskannan eristämiseksi ja puhdistamiseksi kasvattamalla HEP Flury-virusta primäärisissä ja sekundäärisissä kananpoika-alkion fibroblasteissa (SPF), tai raivotaudille herkissä solulinjoissa tai diploidisolukannoissa, t u n n n e t t u siitä, että eristetään sellainen plakki, joka eroaa selvästi alkuperäisestä viruskannasta tartutettuihin soluihin kohdistuvan voimakkaan sytopaattisen vaikutuksen perusteella, ja sen jälkeen suoritetaan kolme saadun plakin kloonipuhdistusta homogeenisen ja puhtaan viruskannan aikaansaamiseksi, jolle uudelle viruskannalle on annettu tunnusnumero 675 ja joka on talletettu Prahan hygienian ja kulkutautiopin laitoksen kokoelmaan "Czechoslovak National Collection of Type Cultures" numerolla CNCTC AO 4/77. Patentkrav Förfarande för isolering och rening av en ny rabies virusstam genom odling av HEP Flury-virus i primära och sekundära fibroblaster (SPF) av kyckling-embryon eller i cellinjer eller diploidcellstammar känsliga för rabies, k ä n n e t e c k n a t av isolering av en sådan plak, som avviker tydligt frän den ursprungliga virusstarmen i dess kraftiga cytopatiska effekt på infekterade celler, och därefter utföres tre klonreningar av den erhållna plaken för att erhålla en homogen och ren virusstam, vilken nya virusstam givits numret 675 och är deponerad i institutet för hygien och epidemiologi i Prag i kollektionen "Czechoslovak National Collection of Type Cultures" med numret CNCTC AO 4/77. Viitejulkaisuja-Anförda publikationer