(B) ( 11) KUULUTUS JULKA I SU UTLAGGN I NG S SKR I FT C 45 ) PaterAti tay3sarletti Patent moddelat (51) Kv.lk.6 Int.c1.

Transkriptio

1 Ii 4, F10000B (B) ( 11) KUULUTUS JULKA I SU UTLAGGN I NG S SKR I FT C 45 ) PaterAti tay3sarletti Patent moddelat (51) Kv.lk.6 Int.c1.6 A 61K 39/21, 39/295, 39/42 SUOMI FINLAND (FI) (21) Patenttihakemus Patentansökning (22) Hakemispäivä Ansökningsdag (24) Alkupäivä Löpdag (41) Tullut julkiseksi Blivit offentlig Patentti - ja rekisterihallitus (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. Patent - och registerstyrelsen Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (71) Hakija Sökande (86) Kv. hakemus Int. ansökan PCT/US88/01955 (32) (33) (31) Etuoikeus Prioritet US P US P 1. The Immune Response Corporation, Inc., 6455 Nancy Ridge Drive, San Diego, CA 92121, USA, (US) (72) Keksijä Uppfinnare 1. Salk, Jonas, 2444 Ellentown Road, La Jolla, CA 92037, USA, (US) 2. Carlo, Dennis J., P.O. Box 1176, Rancho Santa Fe, CA 92067, USA. (US) (74) Asiamies Ombud: Oy Kolster Ab (54) Keksinnön nimitys Uppfinningens benämning Menetelmä HIV hiukkasimmunogeenin ja sen vasta aineen valmistamiseksi Förfarande för framställning av en HIV partikelimmunogen och dess antikropp (56) Viitejulkaisut Anförda publikationer FI A (C 12N 15/48), EP A (C 12N 15/00), WO A 87/02892 (A 61K 39/12), Science, vol. 232 ( ) Kennedy et al., p , FEBS Letters, vol. 218, nro 2 (1987), Sternberg et al., p , Journal of Virology, vol. 60, nro 2 (1986), Marx et al., p , The EMBO Journal, vol. 5, nro 11 (1986), Chanh et al., (57) Tiivistelmä Sammandrag Keksintö koskee immunogeeniä, joka koostuu ei-infektoivista retrovirushiukkasista, joista ulomman vaipan proteiinit puuttuvat. Immunogeeniä voidaan käyttää retrovirussairautta mukaan lukien HIV:tä sairastavan yksilön immunisoimiseksi ja täten infektion etenemisen estämiseksi. Immunogeeniä voidaan myös käyttää vasta-aineiden tuottamiseksi passiivista immunoterapiaa varten. Keksintö koskee myös retrovirusvastaisia vasta-aineita, niiden valmistusmenetelmää, anti-idiotyyppivastaaineita sekä menetelmää vasta-aineiden elimistön ulkopuolella tapahtuvaa poistamista varten HIV-tartunnan saaneelta yksilöitä. Uppfinningen avser en immunogen som innehåller icke-infektiösa retroviruspartiklar, vilka saknar de yttre skalproteinerna. Immunogenen kan användas för immunisering av en individ som infekterats av ett retrovirus, inklusive HIV, för förhindrande av att infektionen framskrider. Immunogenen kan även användas vid produce - randet av antikroppar för passiv fmmunoterapi. Uppfinningen avser även mot retrovirus riktade antikroppar, ett förfarande för framställning av desamma, anti-idiotypiska antikroppar och ett förfarande för avlägsning av antikroppar ytterom kroppen från med HIV infekterade individer.

2 1 Menetelmä HIV-hiukkasimmunogeenin ja sen vasta-aineen valmistamiseksi Keksinnön tausta 5 Tämä keksintö koskee menetelmää immunogeenin valmistamiseksi, joka käsittää ei-infektiivisiä HIV-hiukkasia, joista ulomman vaipan proteiinit gp 120 ja gp 160 puuttuvat, ja menetelmää vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka reagoivat yhden tai useamman HIV-proteiinin kanssa, 10 mutta eivät reagoi mainitun viruksen ulomman vaipan proteiinien kanssa. Immunogeenia ja vasta-ainetta voidaan käyttää HIV-sairauden ehkäisyyn ja hoitoon, erityisemmin rokotukseen ja immunoterapiaan ihmisen immuunipuutosvirusta vastaan 15 Hankittua immuunipuutosoireyhtymää, joka tunnetaan myös AIDS:ina, on kuvattu nykyajan rutoksi. Seitsemän vuoden aikana sen jälkeen, kun se oli ensimmäistä kertaa kuvattu v. 1981, se on vaatinut lähes uhria ja ollut syynä yli kuolemantapaukseen yksin Yhdysvalloissa. 20 Kuitenkin sairauden todellinen vaikutus on vielä kokematta. Virus voi pysyä piilevänä tartunnan saaneissa yksilöissä viiden tai useamman vuoden ajan, ennen kuin oireet ilmaantuvat. Monet amerikkalaiset voivat tietämättään saada tartunnan ja tartuttaa muita, jotka joutuvat heidän 25 ruumiinnesteidensä kanssa tekemisiin. Täten, ilman valvontaa, AIDS:in henkilökohtainen, sosiaalinen ja taloudellinen vaikutus tulee olemaan valtava. AIDS:in aiheuttava tekijä on ihmisen immuunipuutosvirus-niminen retrovirus (HIV). Retrovirukset tunnistetaan 30 sen seikan perusteella, että niiden geneettinen materiaali, joka on RNA:ta, koodittaa virusreplikaatioon tarvittavat tiedot. Isäntäsolun infektoituessa se toimii mallina DNA:n transkriptioille, jota katalysoi käänteistranskriptaasientsyymi. Näin tuotettu DNA tulee solun turvaan, jossa 35 se liittyy isännän DNA:han proviruksena. Oikein aktivoitu-

3 2. na retroviruksen DNA:ta transkriboidaan ja translatoidaan RNA:ta sisältävien virionien tuottamiseksi, jotka sitten vapautuvat solusta silmikoitumalla. Tietyt virukset, retrovirukset mukaan luettuina, 5 voivat pysyä piilevässä tilassa kuukausia tai vuosia ennen kuin ne aktivoituvat ja virioneja tuotetaan. Vaikkakin oireettomana, isännällä voi joka tapauksessa olla virus provirusmuodossa ja hän voi täten olla mandollisesti vaarassa sairastua ja tartuttaa muita. 10 Kun yksilö infektoituu HIV:llä, virus kiinnittyy ja tunkeutuu mieluiten tietyn linjan soluihin, T4-lymfosyytteihin, jotka tunnistetaan siitä, että niillä on CD4:ksi nimetty solunpinnan merkkimolekyyli. Näillä valkoisilla verisoluilla on olennainen osa immuunijärjestelmässä, ne 15 toimivat tärkeinä osina sekä humoraalisessa että soluvälitteisessä immuunivasteessa. Suuri osa HIV:n haitallisesta vaikutuksesta voidaan laskea T4-lymfosyyttien toiminnan huononemisen tai solujen tuhoutumisen syyksi. Ehjä HIV-virioni on karkeasti ottaen pyöreä ja noin nm läpimitaltaan. Virionilla on ulkokalvo, jota peittävät glykoproteiinin, gp 160/120:n muodostamat nupit tai piikit. Lisäksi siinä on kalvon läpi ulottuva proteiini, joka on nimetty gp 41:ksi. Vironin sisällä on kaksi rakenneproteiinia: ulompi kuori, joka koostuu fosfoproteiinista 25 p17 ja sisempi nukleoidi tai sisempi ydin, joka muodostuu fosfoproteiinista p24. Viruksen RNA on ytimen sisällä, kanden käänteistranskriptaasientsyymimolekyylin, p66/51, kanssa, jotka ovat tarpeen virus-dna:n syntetisoinnissa RNA-mallin mukaan. HIV:n kaavamainen malli on esitetty 30 kuviossa 1. Kuten kuviossa 2 on esitetty, HIV:n RNA-genomi koodittaa kolmea päärakennegeeniä: gag, pol ja env, joita reunustavat kummassakin päässä pitkät toistuvat terminaalisekvenssit (long terminal repeat sequences, LTR). Gag- 35 geeni koodittaa ryhmäspesifisiä ytimen proteiineja p55,

4 3 p39, p24, p17 ja p15. Pol-geenit koodittavat käänteiskopioijaentsyymiä p66/p51 ja proteaasia p31. Env-geenit koodittavat ulomman vaipan glykoproteiinia gp120 ja sen esimuotoa gp160 ja kalvon läpi ulottuvaa glykoproteiinia 5 gp41. Joillakin geeneistä on taipumusta olla hyvin vaihtelevia, erityisesti env-geeneillä. Lisäksi on viisi muuta geeniä, joita ei ole muilla retroviruksilla, jotka vaikuttavat joko transkription tai translaation säätelyyn tai koodittavat muita rakenneproteiineja. Koko HIV:n genomi on 10 nyt sekvensoitu. Ks. Ratner et al., Nature 313 (1985) 277, joka on liitetty tähän viitteeksi. HIV kiinnittyy isäntäsoluun vaipan glykoproteiinin vuorovaikutuksella solunpinnan reseptorin kanssa. Vaikuttaa siltä, että kun HIV joutuu kosketukseen T4-solun kans- 15 sa, gp120 joutuu vuorovaikutukseen CD4-reseptorin kanssa. Viruksen vaippa yhtyy solukalvoon ja viruksen sisempi ydin pääsee infektoituneeseen soluun, jossa käänteiskopioijaentsyymi katalysoi RNA:n transkription DNA-provirukseksi. Provirus voi pysyä solussa piilevässä muodossa muutamia 20 kuukausia tai vuosia, jona aikana tartunnan saanut yksilö on oireeton. Jos virus kuitenkin myöhemmin aktivoituu ja aiheuttaa viruksen replikaation ja immunosupression, yksilö on tällöin altis opportunistisille infektioille, syöpä mukan luettuna, jotka liittyvät AIDS:iin. Muilla ihmisen 25 retroviruksilla on ulomman vaipan proteiineja. Toistaiseksi ei tunneta AIDS-oireyhtymään tehokasta rokotetta tai hoitoa. Yritykset kehittää rokotteita ovat tähän asti epäonnistuneet. Tiettyjä vasta-aineita, jotka reagoivat HIV:n kanssa, varsinkin anti-gp160/120- ja vi- 30 rusta neutraloivia vasta-aineita esiintyy suuria määriä HIV-infektion sekä oireettoman että oireellisen vaiheen aikana, mikä viittaa siihen, että suojaavan vaikutuksen sijasta tällaiset vasta-aineet voivat itse asiassa edistää viruksen kiinnittymistä ja tunkeutumista isäntäsoluun.

5 4 Täten on olemassa tarve tehokkaille vaikuttaville aineille, joita käytetään retrovirusinfektioiden, erityisesti HIV:n aiheuttamien, ehkäisyyn ja hoitoon. Tämä keksintö tyydyttää nämä tarpeet ja tarjoaa myös asiaan kuulu- 5 via etuja. Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö antaa käyttöön menetelmän valmistaa ei-infektiivistä immunogeenia, joka sisältää HIV-hiukkasia, joissa ei ole ulomman vaipan proteiineja. Menetelmäl- 10 le on tunnusomaista, että mainittua virusta viljellään, eristetään ja saatetaan ei-infektiiviseksi ja poistetaan siitä ulomman vaipan proteiinit gp 120 ja gp 160 sinänsä tunnetulla tavalla. Immunogeeni on käyttökelpoinen HIVtartunnan saaneen yksilön immunisointiin, infektion etene- 15 miseltä suojaavien immunoprotektiivisten tekijöiden aikaansaamiseksi. Toisaalta immunogeeni on käyttökelpoinen sellaisen yksilön rokottamiseen myöhemmän infektion ehkäisemiseksi, joka ei aikaisemmin ole saanut HIV-tartuntaa. Immunogeeniä voidaan myös käyttää vasta-aineiden tuottami- 20 seen passiivista immunoterapiaa varten, yksin tai aktiivisen immunoterapian yhteydessä HIV-tartunnan saaneissa yksilöissä. Keksinnön mukaiselle menetelmälle vasta-aineiden määrittämiseksi on tunnusomaista, että immunisoidaan yksilö, joka on muu kuin ihminen, patenttivaatimuksessa 1 mai- 25 nitulla immunogeenillä ja kerätään muodostuneet vasta-aineet talteen. Lyhyt kuvaus piirroksista Kuvio 1 on kaaviokuva HIV:stä, joka esittää eri geenituotteiden järjestyksen. 30 Kuvio 2 on kaaviokuva HIV:n geeneistä ja niiden koodittamista geenituotteista. Kuvio 3 tarjoaa kaavamaisen esityksen tiettyjen vasta-aineiden ja antigeenien tasosta, joita esiintyy HIVinfektion edetessä AIDS:iksi seropositiivisilla yksilöillä 35 oireettoman tilan edetessä ARC:ksi ja AIDS:ksi.

6 5 Kuvio 4 esittää Western Blot -kuvaa immunogeenistä, joka on valmistettu, kuten esimerkissä I, joka osoittaa, että se on vapaa ulomman vaipan proteiineista testattaessa homologisella ja heterologisella seerumilla, jotka sisäl- 5 tävät korkeita tiittereitä vasta-aineita ulomman vaipan proteiineille. A: Kaupalliset HIV-Western Blot -liuskat, jotka on testattu heterologisella simpanssin seerumilla; B: Western Blot -liuska, jossa on immunogeeniä, testattu heterologisella simpanssin seerumilla; C: Kaupalliset HIV- 10 Western Blot -liuskat testattuna homologisella ihmisen seerumilla; D: Western Blot -liuskat, joissa on immunogeeniä testattuna homologisella ihmisen seerumilla. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Keksintö tarjoaa tehokkaan keinon HIV-infektion ja 15 sitä seuraavan HIV:n aiheuttaman AIDS:iin liittyvän oireyhtymän (AIDS Related Complex, ARC) ja AIDS:in ehkäisyyn ja tartunnan jälkeiseen hoitoon HIV-infektioiden etenemisen pysäyttämiseen. Yksilöillä, jotka ovat altistuneet HIV-virukselle, on seerumissaan tiettyjä HIV:lle spesifi- 20 siä vasta-aineita. Näitä yksilöitä nimitetään HIV:n suhteen "seropositiivisiksi", vastakohtana niille, jotka ovat "seronegatiivisia". HIV:lle spesifisten vasta-aineiden esiintyminen voidaan määrittää kaupallisesti saatavissa oleville määritysmenetelmillä. Näiden vasta-aineiden taso 25 antaa viitteitä AIDS-oireyhtymän etenemisestä. Kuten kuvio 3 kaavamaisesti esittää, korkeat pitoisuudet anti-gp160/120 (ulomman vaipan) -vasta-ainetta, joita esiintyy myös HIV-infektion oireettomassa vaiheessa, säilyvät myös oireellisessa vaiheessa. Anti-p24-vasta-ai- 30 neen määrä on korkea oireettomassa vaiheessa, mutta näyttää laskevan oireellisessa vaiheessa. Samoin HIV-seropositiiviset seerumit sisältävät vasta-aineen, joka estää käänteistranskriptaasin toiminnan (anti-rt-vasta-aine tai RTI). Yksilöillä, joilla RTI esiintyy suurina määrinä, 35 yritykset viruksen eristämiseksi ovat harvemmin positiivi-

7 6 sia kuin niillä, joilta se puuttuu. Sen vuoksi vaikuttaa siltä, että soluvälitteisten ja humoraalisten immunoprotektiivisen tekijöiden, kuten T4-solujen ja anti-gag-vasta-aineiden, mukaan luettuna anti-p24 ja anti-pol-vasta- 5 aineiden, mukaan luettuna RTI, väheneminen liittyy HIVinfektion etenemiseen AIDS:iksi. Immunoprotektiivisten tekijöiden tuotanto voidaan saada aikaan rokottamalla yksilöä tehokkaalla immunogeenillä. Aiemmin on tehty yrityksiä kehittää rokote, joka 10 perustuu tiettyihin viruksen proteiineihin, esimerkiksi vaipan proteiineihin. Tämä keksintö koskee menetelmää immunogeenin valmistamiseksi, joka sisältää HIV-geenituotteita, lukuun ottamatta vaipan proteiineja, jota voidaan käyttää kiihottamaan immunoprotektiivisten tekijöiden tuo- 15 tantoa, jotka ovat tehokkaita ei-infektoituneiden yksilöiden tartunnan ehkäisyyn tai hidastamaan tai ehkäisemään tartunnan saaneiden yksilöiden HIV-infektion etenemistä AIDS:iksi. Immunogeeni koostuu ehjistä virushiukkasista, joista ulompi vaippa on poistettu tai yhdestä tai useam- 20 urasta muista kuin gp120 tai gp160 HIV-geenituotteesta. A. Määritelmiä Tässä käytettynä nimitys "retrovirus" viittaa virukseen, jonka geneettinen materiaali on ribonukleiinihappona (RNA), joka transkriboidaan DNA:ksi, joka liitetään 25 isännän genomiin. Esimerkkeihin retroviruksista kuuluvat HTLV-I, HTLV-II STLV-I ja lentivirusheimo, mukaan luettuina HIV, visna-virus, hevosen tarttuva anemiavirus, kissan immuunipuutosvirus ja naudan immuunipuutosvirus. Näitä kuvataan Faucin artikkelissa, Science 239 (1988) 617 ja 30 siihen kuuluvissa viitteissä, joista jokainen on liitetty tähän viitteeksi. Tässä käytettynä nimitys "HIV" sisältää tyypit 1 ja 2 ja merkitsee samaa kuin HTLV-III ja LAV-1 ja LAV-2. HIV viittaa virussukuun ja sisältää kaikki muodot, alatyypit 35 ja muunnokset. On kehitetty useita HIV-viruksen pysyvästi

8 7 infektoimia solulinjoja ja sijoitettu ne ATCC-talletuslaitokseen, mukaan luettuina numeroilla CCL 214, TIB 161, CRL 1552 ja CRL 8543 saatavissa olevat, jotka kaikki on kuvattu US-patentissa nro ja Gallon artikkelissa, 5 Scientific American 256 (1987) 46, jotka on molemmat liitetty tähän viitteiksi. Tässä käytettynä nimitys "ulomman vaipan proteiini" viittaa siihen osaan retroviruksen kalvon glykoproteiinissa, joka pistää esiin kalvosta vastakohtana kalvon läpi 10 ulottuvalle proteiinille gp41. Ulomman vaipan proteiini tarkoittaa HIV:ssä samaa kuin gp120 ja sen esimuoto gp160. Tässä käytettynä nimitys "ulommasta vaipasta vapaa" viittaa retroviruksen osista koostuvaan valmisteeseen tai retroviruksen geenituotteisiin, joista puuttuvat ulomman 15 vaipan proteiinit. Tässä käytettynä nimitys "gp120" tai "gp160/120" viittaa glykoproteiineihin, joilla on joko ulomman vaipan proteiinin antigeeninen spesifisyys tai biologinen toiminta; gp160:n uskotaan olevan gp120:n esimuoto. 20 Tässä käytettynä nimitys "AIDS" viittaa hankittuun immunipuutosoireyhtymään, jonka Adler on kuvannut, Brit. Med. J. 294 (1987) Sitä luonnehtivat kasvaimet ja opportunististen infektioiden sarja. "ARC" viittaa AIDS:iin liittyvään oireyhtymään, jonka Adler, yllä, on 25 kuvannut. HIV-infektion oireellinen vaihe viittaa ARC:lle tai AIDS:ille tyypillisten oireiden alkamiseen "AIDS-oireyhtymä" sisältää sekä AIDS:in että ARC:n. Tässä käytettynä nimitys "geenituote" viittaa geenin koodittamaan polypeptidiin tai proteiiniin. Nimityksen 30 on tarkoitus sisältää proteiinin johdannaiset, kuten glykoproteiinit. On selvää, että voidaan tehdä rajoitettuja muutoksia geenituotteen aminohappojärjestykseen tuhoamatta geenituotteen biologista toimintaa tai immunogeenisyyttä ja että ehkä vain osaa alkuperäisestä sekvenssistä tarvi- 35 taan immunogeenisyyteen.

9 8 Tässä käytettynä nimitys HIV-tartunnan saanut tai ei-hiv-tartuntaa saanut viittaavat ihmisiin, joilla on HIV-virus tai provirus tai joilla ei vastaavasti niitä ole. Retrovirustartunnan saanut tai ei-retrovirustartuntaa 5 saanut viittaavat yksilöihin, joilla on retrovirus tai provirus tai joilla ei vastaavasti niitä ole. Nykyisin tartunnan määrittämiseen eniten käytetyt menetelmät ovat serologiset kokeet virusvasta-aineiden toteamiseksi. Nämä menetelmät voivat kuitenkin johtaa sekä vääriin negatiivi- 10 siin, kuten silloin, kun yksilö on saanut viruksen, muttei vielä ole pannut toimeen immuunivastetta, että vääriin positiivisiin, kuten siinä tapauksessa, että sikiö saattaa saada äidiltä vasta-aineet muttei virusta. Muita menetelmiä viruksen toteamiseksi on tullut tai saattaa tulla saa- 15 taville. Silloin kun serologiset testit antavat viitteitä tartunnasta, saattaa olla tarpeen pitää kaikkia seropositiivisia itse asiassa tartunnan saaneina. Edelleen tiettyjä niistä yksilöistä, jotka todetaan seronegatiivisiksi, voidaan itse asiassa pitää tartunnan saaneina, jos tietyt 20 muut viitteet tartunnasta, kuten kosketus tunnetun kantajan kanssa, ovat olemassa. Kun nimityksiä "seropositiivinen" ja "seronegatiivinen" voidaan käyttää tässä helpoiten saatavina tartunnan osoittajina, niiden on tarkoitus olla synonyymisiä "tartunnan saaneen" tai "ei-tartuntaa saa- 25 neen" kanssa, vastaavasti. HIV-spesifisten geenien ja geenituotteiden tunnistaminen perustuu HIV tyyppi 1:n terminologiaan, joka on esitetty kuviossa 1. On kuitenkin tarkoitus, että viite tiettyyn HIV tyyppi 1:n geeniin tai geenituotteeseen, joka 30 perustuu sen molekyylipainoon, sisältää myös HIV tyyppi 2:n ja muiden retrovirusten, joilla on homologinen geeni, vastaavan geenin tai geenituotteen. Muiden tyyppien ja lajien geenituotteilla voi olla hieman eri molekyylipainot. Esimerkiksi HIV tyyppi 1:n gp41 on vastaava kuin 35 tyyppi 2:n gp36 ja tyypin 1 gp120 vastaa tyypin 2

10 9 gp130:tä. Geenit tunnistetaan kursivoidusta alaosan merkinnästä, kuten gag, kun taas vastaava geenituote tunnistetaan yläosan merkinnästä, kuten GAG. Koko HIV:n geeni on sekvensoitu. Ks. Ratner et al., Nature 313 (1985) 277, 5 joka on liitetty tähän viitteeksi. HIV voidaan viljellä tartunnan saaneen yksilön perifeerisestä verinäytteestä. Esimerkiksi perifeerisen veren mononukleaarisia soluja, kuten esimerkiksi lymfosyyttejä, voidaan saada kerrostamalla heparinisoitua laskimo- 10 verta Ficoll-Hypaque-tiheysgradientin päälle ja sentrifugoimalla tämä. Mononukleaariset solut kerätään, aktivoidaan esimerkiksi fytohemagglutiinilla kandesta kolmeen päivään ja viljellään sopivassa ravintonesteessä, johon on mieluiten lisätty interleukiini 2:ta. Virus voidaan havai- 15 ta joko käänteistranskriptaasimäärityksellä, p24-antigeenin kiinnittymismäärityksellä, immunofluoresenssillä tai toteamalla virushiukkaset soluissa elektronimikroskopialla, jotka kaikki ovat alan ammattilaisten hyvin tuntemia menetelmiä. Kun virus on eristetty, se voidaan siirtää 20 muihin soluihin. On tärkeää käyttää ei-infektoivaa rokotetta, jotta vältettäisiin infektion siirtäminen isäntään. Monia menetelmiä patogeenin saattamiseksi ei-infektoiviksi tunnetaan hyvin. Ks. esimerkiksi Hanson, MEDICAL VIROLOGY II (1983) 25 (toim. de la Maza ja Peterson) Elsevier, N.Y. Virus voidaan inaktivoida tai tehdä replikaatioon kykenemättömäksi. Kuitenkin, edullisesti, sitä käsitellään B-propiolaktonin ja gammasäteilyn yhdistelmällä. Tässä käytettävien määrien B-propiolaktonia täytyy olla viruksen kanssa kosketuksissa 30 vähintään 2,5 tuntia. Jotta kaikki jäännös-b-propiolaktoni saataisiin poistetuksi, B-propiolaktonin täytyy pysyä liuoksessa vähintään viisi tuntia 37 C:ssa. Eristettyä virusta käsitellään seuraavaksi ulomman vaipan proteiinien poistamiseksi proteiinit voidaan edul- 35 lisesti poistaa viruksen toistuvalla jäädytys-sulatuskä-

11 1 0 sittelyllä yhdistettynä fysikaalisiin menetelmiin, jotka aiheuttavat virushiukkasten turpoamista ja kutistumista, vaikkakin muita fysikaalisia tai ei-fysikaalisia menetelmiä, kuten sonikoimista, voidaan myös käyttää yksin tai 5 yhdistelmänä. Vaihtoehtoisesti, riittävästi puhdistettuja retrovirusten, kuten HIV:n, geenituotteita, muita kuin ulomman vaipan proteiineja, voidaan käyttää immunogeeninä. Näihin geenituotteisiin kuuluvat gag-geenien koodittamat tuotteet 10 (p55, p39, p24, p17 ja p15), pol-geenien koodittamat tuotteet (p66/p51 ja p31-34) ja kalvon läpi ulottuva glykoproteiini gp41. Näitä geenituotteita voidaan käyttää yksin tai yhdistelmänä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää HIVgenomin viittä jäljelle jäävää geeniä. Geenituotteet voi- 15 daan eristää ja puhdistaa viruksesta tai niitä voidaan tuottaa kloonaamalla ja ilmentämällä haluttu geeni isäntäeliössä, kuten bakteeri-, sieni- tai nisäkässoluissa, alan hyvin tunnettujen menetelmien mukaan. Vaihtoehtoisesti antigeenit voidaan syntetisoida käyttäen hyvin tunnettuja 20 alan menetelmiä, kuten automatisoitua peptidisynteesiä. Geenituotteiden aminohappojärjestys on johdettu nukleotidijärjestyksestä. Osaa niistä yksilöistä, joilla on todettu retrovirusinfektioita, kuten HIV, voidaan hoitaa tehokkaasti ak- 25 tiivisella immunoterapialla käyttäen ei-infektiivistä immunogeeniä, joka on valmistettu retroviruksesta. Myös eläimiä, joilla on todettu retrovirusinfektio, voidaan hoitaa näillä menetelmillä. HIV:n ollessa kyseessä, seropositiivista yksilöä immunisoidaan ulommasta vaipasta va- 30 paalla immunogeenillä, mieluiten liitettynä adjuvanttiin. Vaihtoehtoisesti immunogeeni voidaan antaa veteen liuotetussa muodossa ilman adjuvanttia. Annos valitaan niin, että se olisi immunologisesti tehokas ja se on yleensä gg proteiinia, edullisesti noin 30 gg proteiinia.

12 11 Aktiivinen immunisaatio toteutetaan ja edullisesti toistetaan kerran vähintään 90 päivän väliajalla, vaikka lisäpistokset voivat olla tarkoituksenmukaisia johtuen immunokompetenssitason muutoksista ja perustua esimerkiksi 5 muiden HIV-geenituotteiden kuin ulomman vaipan proteiinien vasta-aineiden vähenemiseen. Tällainen immunisointi suoritetaan edullisesti aluksi lihaksensisäisellä pistoksella ja sen jälkeen ihonalaisesti, vaikkakin mitä tahansa ihonalaisten ja lihaksensisäisten pistosten yhdistelmää voi- 10 daan käyttää. Seropositiivisen yksilön immuunivaste tai immunokompetenssi määritetään mieluiten ennen immunisointia, jotta voitaisiin määrätä oikea ajoitus hoidolle. Määritysten menetelmänä yksilöiden seerumeista tutkitaan vasta- 15 aineet p24:lle (ELISAA käyttäen), RTI-vasta-aineet ja/tai T4-solujen taso alan hyvin tunnettujen menetelmien mukaan. Yksilöt, joilla esiintyy matalan immuunivastaan merkkejä, kuten matalat p24- tai RTI-vasta-aineiden määrät tai matalat määrät T4-soluja, ovat sopivia ehdokkaita passiivisel- 20 le immunoterapialle, edullisesti yhdistettynä aktiivisen immunoterapian kanssa, ennen sitä tai samanaikaisesti sen kanssa. Seronegatiivisia yksilöitä voidaan rokottaa tartuntaa ehkäisevien immunoprotektiivisten tekijöiden aikaan- 25 saamiseksi. Edullisesti rokote anntaan aluksi lihaksensisäisenä pistoksena, jota seuraa lisäpistos joko lihaksensisäisesti tai ihonsisäisesti annettuna. Fysiologisesti tehokas annos, edullisesti gg, edullisemmin noin 30 gg immunogeeniä annetaan annosta kohden. Edullisesti 30 rokote annetaan yhdessä adjuvantin kanssa, edullisimmin vesi-öljy-emulsiotyyppisen adjuvantin. Tunnetaan useita sopivia tällaisia adjuvantteja, joista Warren ja Chedid ovat kirjoittaneet katsauksen, CRC Critical Reviews in Immunology 8 (1988) 83, joka on liitetty tähän viitteeksi.

13 12 Koska vasta-aineet gp160/120:lle saattavat helpottaa viruksen tarttumista soluihin, nämä spesifiset vastaaineet voidaan lisäksi poistaa HIV-tartunnan saaneelta henkilöltä ennen immunoterapiaa. Immunoadsorptiopylväät, 5 jotka koostuvat ontoista selluloosakuiduista, muunnetaan niin, että niihin liittyy kovalenttisesti anti-gp160/120- vasta-aineiden kanssa reagoivia ligandeja. Näihin ligandeihin kuuluvat gp160/120-antigeenit, jotka on valmistettu puhdistetuista glykoproteiineista, jotka on saatu juuri 10 kerätyistä virushiukkasista HIV:a tuottavien T4-lymfosyyttien viljelmän ravintonesteestä. Vaihtoehtoisesti näitä ligandeja voidaan tuottaa yhdistelmä-dna-menetelmillä käyttäen transfektoituja soluja. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää anti-gp160/120-vasta-aineiden kanssa regoivia 15 anti-idiotyyppejä. Näitä anti-idiotyyppivasta-aineita voidaan valmistaa alan hyvin tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi Riott et al., Lancet, 9. toukokuuta, 1981, s ynnä seuraavat, jotka on liitetty tähän viitteeksi. Tällaisten pylväiden käyttöön liittyviä menetelmiä synty- 20 neiden vasta-aineiden elimistön ulkopuolelta tapahtuvaa poistamista varten ovat esimerkiksi Laruen et al. kuvaamat, Symp. on Plasma Exchange in Nephrology; Int'l. J. of Art Organs 8 (1984) 23, joka on liitetty tähän viitteeksi. B. Esimerkkejä 25 Seuraavat esimerkit on tarkoitettu valaisemaan mut- tei rajoittamaan keksintöä. Vaikka ne ovat tyypillisiä esimerkkejä niistä, joita saatettaisiin käyttää, muita alan ammattilaisten tuntemia menetelmiä voidaan vaihtoehtoisesti käyttää. 30 Esimerkki 1 tus Ulommasta vaipasta vapaiden virushiukkasten valmis- HIV:llä infektoituja soluja kasvatettiin ravintoneste A:ssa, joka koostuu RPMI-1640:stä, johon on lisätty % naudan sikiön seerumia, (FBS, fetal bovine serum), 25

14 13 mm HEPES:iä, 50 gg/ml gentamisiiniä ja 100 µg/ml streptomysiiniä. Viljelmät laajennettiin lisäämällä varastoviljelmän soluja pyöriviin viljelypulloihin ja tilavuus laajennet- 5 tiin noin 8 l:ksi esilämmitetyllä ravintoneste A:lla. Laimennussuhde oli noin 1:5. Toinen laimennus tehtiin samoin kuin edellä laimennussuhteella 1:3. Ravintoneste 5-7:n päivän ikäisistä HIV:n infektoimien solujen suspensioista suodatettiin 0,45 mikronin 10 suodattimen läpi (Prostack; Millipore Corporation, Bedford, MA). Tuore 1:40-varastoliuos B-propiolaktonista (Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO) valmistettiin juuri ennen käyttöä ja lisättiin ravintonesteeseen lopulliseksi pitoisuudeksi 1: Liuosta inkuboitiin viisi 15 tuntia 37 C:ssa ja ph pidettiin välillä 7,2-7,4. Viiden tunnin kuluttua poistettiin 20 ml liuoksesta infektiivisyystason ja jäljellä olevan B-propiolaktonin määrittämiseksi. Sen jälkeen liuos jäädytettiin -70 C:- seen. Jäätynyt liuos altistettiin sitten 4,5 mr "koboltin 20 gammasäteilytykselle (Radiation Sterilizers Inc., Tustin, CA). Supernatanttiliuos sulatettiin sen jälkeen ja kon- sentroitiin 40-kertaiseksi käyttäen Millipore Pellicon -järjestelmää molekyylipainorajan polysulfonisuo- 25 dattimilla, seuraten valmistajan antamia ohjeita. Konsentraatti pantiin T-21-roottoripulloihin (Beckman Instruments, Brea, CA), jotka oli aikaisemmin käsitelty 70- %:isella isopropyylialkoholilla (IPA) ja sentrifugoitiin rpm yhden tunnin ajan. Supernatantti poistettiin 30 putkista ja kiinteät jäännökset suspendoitiin natriumtris-edta:han (NTE) noin 24 ml:n lopulliseen NTE-tilavuuteen. 4 ml tätä suspensiota kerrostettiin 8 ml:n päälle 30-%:ista sakkaroosia polyallomeeriputkiin, jotka oli aiemmin käsitelty 70-%:isella IPA:lla ja sentrifugoitiin rpm yhden tunnin ajan. Liuos valutettiin 30-%:ises-

15 14 ta sakkaroosista ja kiinteä jäännös suspendoitiin huolellisesti NTE:hen. Valmistettiin gradientti ultrapuhtaisiin sentrifugiputkiin, jotka oli aiemmin käsitelty 70-%:isella IPA:- 5 lla, lisäämällä 3 ml 45-%:ista sakkaroosia putkeen ja kerrostamalla sen päälle 6 ml 30-%:ista sakkaroosia. 3 ml yllä olevaa suspensiota kerrostettiin päällimmäiseksi. Putkia sentrifugoitiin 0 minuuttia rpm. Liuos 35 %:n rajapinnalla olevien vyöhykkeiden 10 päältä pipetoitiin pois ja heitettiin menemään. Vyöhykkeet kaikista putkista yhdistettiin yhteen v-pohjaiseen putkeen ja laimennettiin 1:10 fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Liuos sentrifugoitiin polyallomeeriputkissa, jotka oli esikäsitelty 70-%:isella IPA:lla yhden 15 tunnin ajan rpm. Liuos heitettiin pois ja kiinteä jäännös suspendoitiin PBS:ään konsentraatioksi 1 ml 10 litraa aloitusmateriaalia kohti. Vaihtoehtoisesti, erityisesti silloin, kun immunogeeniä valmistetaan suurissa erissä, säteilytys voidaan 20 tehdä vyöhykkeiden yhdistämisen jälkeen. Sen jälkeen virus kerrostetaan %:n sakkaroosigradientin päälle. Virusvyöhykkeet yhdistettiin ja suspendoitiin PBS:ään. Virus sentrifugoitiin pohjaan rpm:llä yhden tunnin ajan ja suspendoitiin PBS:ään 1,0 mg/ml:n lopulliseksi konsent- 25 raatioksi. Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin et al. menetelmän mukaan (Anal. Biochem. 72 (1976) 248), joka on liitetty tähän viitteeksi proteiini laimennettiin PBS:ään lopulliseksi konsentraatioksi 1,0 mg/ml. 30 Esimerkin 1 menetelmän mukaan valmistetun immunogeenin sisältämä B-propiolaktonijäännöksen pitoisuus määritettiin käyttämällä kapillaari-kaasu-nestekromatografiaa (Carlo ERBA Series 4100) valmistajan ohjeiden mukaan. Valmistettiin B-propiolaktoni- ja voihappovakioliuokset, joi- 35 den konsentraatiot olivat ppm. Kanden Ml:n näyt-

16 15 teet ruiskutettiin kapillaarikromatografiin valmistajan ohjeiden mukaan. Erotusraja määritettiin 0,1 ppm:ksi. Immunogeenin sisältämä 8-propiolaktonin pitoisuus määritettiin vähemmäksi kuin 0,05 ppm:ksi. 5 B-propiolaktonipitoisuus määritettiin kapillaarikaasukromatografialla kandeksasta näytteestä yllä olevan protokollan mukaan valmistettua immunogeeniä käyttäen voihappoa sisäisenä vakiona. Kromatografian olosuhteet olivat seuraavat: pylväs: 30 m x 0,25 mm silikageeli - avoin put- 10 kimainen; kiinteä faasi: 100 5:n syaanipropyylisilikoni; injektorin lämpötila 140 C; lämpötilaohjelma 70 C/1 min, 20 C/min 130 C:seen; injektiotekniikka: keskeytyksetön. Yllä esitetyissä olosuhteissa B-propiolaktonin ja voihapon viivästymäajat olivat 7,52 minuuttia ja 6,70 minuuttia, 15 vastaavasti. 2 gl:n injektio 1 ppm:n pitoista B-propiolaktoniliuosta tuotti piikin, joka voitiin kvantitoida. 1 ppm:n liuoksen konsentroituminen yhteen kymmenesosaan tilavuudestaan liuottimen haihtumisen seurauksena 40 C:ssa alipaineessa ei aiheuttanut mainittavaa B-pro- 20 piolaktonin menetystä. Erotusraja konsentroitumisen jälkeen oli 0,1 ppm (0,1 gg/ml). Sen varmistamiseksi, että immunogeeni ei sisällä ulomman vaipan proteiineja, immunogeeni erotettiin ensin 11,0 %:n SDS-PAGE-geelissä U.K. Laemmlin menetelmän mu- 25 kaan, Nature 227 (1970) 680, joka on liitetty tähän viitteeksi. Eristetty materiaali siirrettiin sen jälkeen nitroselluloosapaperille Towbinin et al. menetelmän mukaan, Proc. Natl. Acad. Sci. 76 (1979) 4350, joka on liitetty tähän viitteeksi ja immunovärjättiin Tsangin et al. mene- 30 telmän mukaan, Meth. Enzymology 92 (1983) 377, joka on liitetty tähän viitteeksi. Kuten voidaan nähdä kuviosta 4, näin saaduissa Western Blot -kuvissa immunogeenissä ei ole gp120/160:tä vastaavaa vyöhykettä, kuten korkeita pitoisuuksia anti-gp160/120:tä sisältävällä seerumilla käsi- 35 tellyt kontrollit osoittavat.

17 16 Kuten kuvio 4 osoittaa, kaupalliset Western Blot -liuskat, joissa on HIV:n proteiineja (Bio-Rad, Richmond, CA) ("kaupalliset Western Blot -liuskat") seulottuna heterologisilla seerumeilla (simpanssin A86-C ja A-3), jotka 5 sisältävät vasta-aineita, joilla on korkea tiitteri ulomman vaipan proteiineille, gp160/120, olivat negatiivisia (ei-reaktiivisia) Western Blot -liuskoilla, jotka oli valmistettu esimerkin 1 menetelmän mukaan ulommasta vaipasta vapaasta immunogeenistä. Homologiset ihmisen seerumit ( ja 010), jotka sisältävät korkeita pitoisuuksia vasta-aineita ulomman vaipan proteiineille gp160/120 olivat reaktiivisia kaupallisten Western Blot -liuskojen kanssa, mutteivät reagoineet ulommasta vaipasta vapaasta immunogeenistä valmistettujen Western Blot -liuskojen kanssa. Sekä 15 homologiset että heterologiset seerumit reagoivat muiden HIV-geenituotteiden kanssa. Ulomman vaipan proteiinien puuttuminen immunogeenihiukkasista varmistettiin elektronimikroskopialla. Immunogeenivalmiste fiksoitiin 2,5 %:n glutaraldehydillä, jälki- 20 fiksoitiin 0s0 4 :11ä, dehydratoitiin nousevan etanolisarjan kautta ja valettiin EPON-812:een. Ohutleikkeitä valmistettiin LKB-mikrotomilla (LKB, Uppsala, Ruotsi) käyttäen timanttiveistä. Leikkeiden paksuus oli 60 nm. Leikkeet värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijysitraatilla ja tutkit- 25 tiin ja valokuvattiin Zeiss 109 -elektronimikroskoopilla- HIV-infektoituneet solut käsiteltiin samoin kuin kontrollit. Immunogeenistä nähtiin puuttuvan tummaksi värjäytyvän ulomman kuoren, joka esiintyi kontrollissa, joka kuvaa gp160/120:tä viruksen pinnalla. 30 Esimerkki 2 Seropositiivisten yksilöiden immunoterapia Yhdeksää HIV-seropositiivista yksilöä hoidettiin immunoterapialla. Valmistettiin esimerkin 1 menetelmän mukaan ei-infektiivisistä HIV-hiukkasista koostuva immuno- 35 geeni, josta ulomman vaipan proteiinit puuttuivat. Immuno-

18 17 geeni emuigoitiin suhteessa 1:1 epätäydelliseen Freundin adjuvanttiin (incomplete Freund's adjuvant, IFA) emulgointilaitteella (Spex 8000 Mixer Mill; Spec Industries, Inc., Edison, N.J.). 1,0 ml liuosta, joka sisälsi 100 gg pro- 5 teiinia, annosteltiin lihakseen. 100 gg sisältävä uusintapistos ilman adjuvanttia annettiin 90 päivää myöhemmin ihonalle. HIV-viruksen läsnäolo potilaan perifeerisen veren lymfosyyteissä määritettiin sekä ennen että jälkeen imu- 10 nisoinnin viljelemällä yhdessä PHA:lla ja interleukiini 2:11a (IL-2) Gallon et al. menetelmän mukaan stimuloituja juuri eristettyjä perifeerisen veren lymfosyyttejä, J. Clin. Microb. 25 (1987) 1291, joka on liitetty tähän viitteeksi. HIV-antigeenien osoittamiseen tarkoitettuja pak- 15 kauksia, kuten p24 on kaupallisesti saatavissa (esimerkiksi HIV p24 Assays; E.I. DuPont & DeNemours Co., Inc., Wilmington, DE). Jokainen potilas testattiin kolme kertaa ennen immunisointia ja viikoilla 2, 4, 6, 8, 12 ja 14 immunisaation jälkeen. 20 Taulukko I esittää potilaiden viruseristyksen tu- lokset. Potilailta 010 ja 003, joilta molemmilta HIV oli eristetty ennen immunisointia, ei löytynyt eristettävää virusta 12 viikon ajan immunisoinnin jälkeen. Potilaat 008 ja 009 todettiin viljelyllä vapaiksi viruksesta kandeksan 25 viikon ajan immunisoinnin jälkeen. Kaikilla neljällä näistä potilaista oli ollut ennen immunisointia korkeat pitoisuudet anti-p24:ää (>1:5 000) ja RTI:tä (>1:1 000). Jäljelle jäävillä viidellä potilaalla, joilla oli matalammat anti-p24- ja RTI-pitoisuudet ennen immunisointia, esiintyi 30 edelleen eristettävää virusta immunisoinnin jälkeen. Vaikka keksintöä on kuvattu viittaamalla tällä hetkellä parhaana pidettyyn tietojen koosteeseen, pitäisi olla selvää, että voidaan tehdä useita muunnoksia keksinnön hengestä poikkeamatta.

19 18 Taulukko I Seropositiivisten vireemisten ARC-potilaiden immunologiset ja virologiset profiilit 5 Potilas Sytologiset ImmunologisPt Virdlogiset T-4. Anti- RTI N.A. Ennen Jälkeen En- Jalp nen keen (vk) < < N.A. viittaa neutraloivaan vasta-aineeseen

20 19 Patenttivaatimukset 1. Menetelmä immunogeenin valmistamiseksi, joka käsittää ei-infektiivisiä HIV-hiukkasia, joista ulomman 5 vaipan proteiinit gp 120 ja gp 160 puuttuvat, t u n - nettu siitä, että mainittua virusta viljellään, eristetään ja saatetaan ei-infektiiviseksi ja poistetaan siitä ulomman vaipan proteiinit gp 120 ja gp 160 sinänsä tunnetulla tavalla Menetelmä vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka reagoivat yhden tai useamman HIV-proteiinin kanssa, mutta eivät reagoi mainitun viruksen ulomman vaipan proteiinien kanssa, tunnettu siitä, että immunisoidaan yksilö, joka on muu kuin ihminen, patenttivaatimuksessa 1 mai- 15 nitulla immunogeenillä ja kerätään muodostuneet vasta-aineet talteen. 20 Patentkrav 1. Förfarande för framställning av en immunogen, som innehäller icke-infektiva HIV-partiklar, som saknar ytterhöljets proteiner gp 120 och gp 160, känne- 25 t e c k n a t därav, att nämnda virus odlas, isoleras och görs icke-infektivt och därur tas bort ytterhöljesproteinerna gp 120 och gp 160 pä i och för sig känt sätt. 2. Förfarande för framställning av antikroppar, som reagerar med ett eller flere HIV-protein, men som inte 30 reagerar med ytterhöljesproteinerna av nämnda virus, k ä n n e t e c k n a t därav, att man immuniserar en individ, som inte är en mänska, med en immunogen enligt patentkrav 1 och tar tiilvara antikropparna som bildats.

21

22 FIG.2 HIV:N GENOMI MITTAKAAVA: KILOBASEJA ' LTR gag sor I tat 1 art ' LTR p31 PROTEAASI p66/p51 KÄÄNTEIS- TRANSKPRIPTAASI p34 p23 p20 p14 p27 ENDONUKLEAASI gp160 p17 p24 p15 YTIMEN PROTEIINIT gp120 VAIPAN PROTEIINIT gp41-43

23 ANTI-p24-VASTA-AINE.400,...-,. FIG. 3 ANTI-VAIPPA- ja NEUTRALOIVA VASTA-AINE / * -X- - X- - -X -- -X- - X- - * -X- - X.- - -( - - X- - -X - -»- - -X - -X / R.T. I. p24 ANTIGEENI / PI TO ISUU S u OIREETON Q Q 0 n " n A n HIV-SAIRAUDEN ETENEMINEN P

24 A86-C A-3 1 9p160 gp160 9P160 9p120 9p120 9p120 p66 p55 9P41 p39 P31 P66 P66 p55 9P41 P39 P24 p21 P31 P17 N p24 P21 P15 p17 P p160 gp120 O «9p160 9P120 p66 p55 9p41 P39 p31 p24 p21 p17 p15 p »160 9P120 p66 p55 gp41 p39 p31 P27 p24 p21 FIG. 4 p17 p15