II F I B

Transkriptio

1 II F I 000B (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats (51) Kv.lk.6 - Int.k1.6 SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen C 07K 14/315, C 12P 21/00 C 12N 15/31, A 61K 39/09 (21) Patentfihakemus - Patentansökning (22) Hakemispäivå - Ansökningsdag (24) Alkupåivå - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/AU89/00539 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet AU 1989 PJ (73) Haltija - Innehavare 1. De Staat der Nederlanden Vertegenwoordigd Door de Minister van Welzijn Volksgezondheid en Cultuur, P.O. Box 5406, 2280 HK Rijswijk, Netherlands, (NL) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Paton, James Cleland, 49 Foster Street, Parkside, S.A. 5063, Australia, (AU) 2. Bansman, David John, 66 Alexandra Avenue, Rose Park, S.A. 5067, Australia, (AU) 3. Boulnois, Graham John, 26 Prospect Road, Beauchamp, Leicestershire LE1 9HN, United Kingdom, (GB) 4. Andrew, Peter William, Chapel Lane, Leister, Leicestershire LE1 9HN, United Kingdom, (GB) 5. Mitchell, Timothy John, 25 Mawbys Lane, Appleby Magna, Burton-on-Trent, Staffordshire DE12 7AA, United Kingdom, (GB) 6. Walker, John Arthur, Traymore Apts., No. 11, 51 S. Mclean, Memphis, TN 38104, USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab, Jaakonkatu 3 A, Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benåmning Menetelmä muutetun pneumolysiinin valmistamiseksi Förfarande för framstållning av muterat pneumolycin (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer Infection and Immunity, vol. 55, 1987, p (57) Tiivistelmå - Sammandrag Pneumolysiinin mutantit, jotka ovat ei-toksisia johtuen konstruoiduista aminonapposubstituutiois- ta. Nämä mutantit tuovat esille immuunivasteen eläimessä, joka on reaktiivinen villintyyppiseen pneumolysiiniin. Keksintö käsittää myös ihmisille tarkoitetut rokotteet, jotka perustuvat näihin mutantteihin, mukaan lukien rokotteet, jotka käsittävät konjugaatit, joissa on pneumokokkikotelopolysakkarideja. Mutanter av pneumolysin, som är icke-toxiska på grund av konstruerade aminosyrasubstitutioner. Dessa mutanter lockar fram immunrespons hos ett djur, som är reaktivt för pneumolysin av vilda typer. Uppfinningen avser också vaksiner för människor baserade pä dessa mutanter inklusive konjugater som innehåller kapsulära polysakkarider.

2 Menetelmä muutetun pneumolysiinin valmistamiseksi Tämä keksintö kohdistuu pneumolysiinitoksiinin mutanttien valmistamiseen. 5 Streptococcus pneumoniae (pneumokokki) on merkittävä patogeeni, joka aiheuttaa tartuntatauteja, kuten keuhkokuumetta, aivokalvontulehdusta ja bakteeriverisyyttä. Jopa alueilla, joilla on vapaasti saatavissa tehokasta antibioottihoitoa, voi pneumokokkiperäisen keuhkokuumeen aiheuttama kuolleisuus olla niinkin korkea kuin 19 % sairaalapoti- 10 laista ja kuolleisuus nousee %:iin potilaista, joilla on bakteeriverisyyttä. Näistä korkeista kuolleisuusluvuista on raportoitu USA:ssa, keuhkokuumeen, jonka yleisin syy on S. pneumoniae, ollessa viidenneksi suurin kuolemansyy. Keuhkokuume on ainoa tartuntatauti USA:n kymmenen ensimmäisen kuolemansyyn joukossa. USA:ssa pneumokokin aiheuttama kuolleisuusprosentti on alueella %. Kehitysmaissa kuolee yli 15 kolme miljoonaa alle viisi vuotiasta lasta joka vuosi keuhkokuumeeseen S. pneumoniaen ollessa yleisin aiheuttaja. S. pneumoniae aiheuttaa myös vähemmän vaarallisia mutta yleisiä infektioita, kuten välikorvantulehdus ja sivuontelotulehdus, jotka vaikuttavat merkittävästi kehitysmaiden terveydenhoitokustannuksiin. Välikorvantulehdus on erityisen merkityksellinen pienissä lapsissa ja sivuontelotulehdus iskee sekä lapsiin että ai- 20 kuisiin luvun lopulla sai lisenssin rokote, joka oli tarkoitettu vakavien infektioiden, erityisesti bakteeriperäisen keuhkokuumeen, estämiseen ja tiettyjen ryhmien suojaamiseen, kuten henkilöt, joilta on poistettu perna, ja pienet lapset, jotka ovat erityisen alttiita yht- : 25 äkkiselle pneumokin aiheuttamalle sairaudelle. Rokote koostuu puhdistetuista kotelopolysakkarideista, jotka ovat vallitsevia pneumokokkipinta-antigeenejä. Kuitenkin jokaisella S. pneumoniaen serotyypillä (joita on 83) on rakenteellisesti erilainen kotelopolysakkaridi ja immunointi yhdellä serotyypillä ei suojaa suurta osaa muita vastaan. Australiassa lisensoitu rokote sisältää polysakkarideja, jotka on puhdistettu 23 yleisimmästä se- 30 rotyypistä, mikä selittää noin 90 % tämän maan pneumokokki-infektioista. Suojaus rokotteessa olevia serotyyppejä vastaan ei ole kuitenkaan täydellinen ja on raportoitu, että suuren riskin omaavissa henkilöissä on esiintynyt useita vakavia, jopa fataalisia infektioita. Rokotteen teho on heikoin pienissä lapsissa ja lukuisat tutkimukset mukaan lukien Adelaidessa suoritetut ovat osoittaneet, että olemassa olevasta formuloinnista on vähän 35 tai ei minkäänlaista kliinistä hyötyä tässä ryhmässä. Tämä rokotteen ilmeinen puute näyttää liittyvän tiettyjen pneumokokkipolysakkaridien heikkoon immunogeenisuuteen alle 5 vuotiaissa lapsissa. Olemme osoittaneet, että vasta-ainevaste on erityisen heikko viiteen serotyyppiin, jotka useimmiten aiheuttavat lasten sairastumisen (tyypit 6, 14, 18,

3 2 19 ja 23). Vasta-ainevaste näihin pneumokokkipolysakkarideihin saavuttaa aikuisten tason vain lapsissa, jotka ovat yli 8 vuotiaita rokotuksen aikana. Tämä huomioon ottaen näyttää tarvittavan rokotetta, joka sisältää muita antigeenejä kuin 5 kotelopolysakkaridit, pienten lasten suojaamiseksi pneumokokki-infektiolta. Yksi tällainen antigeeni voi olla pneumolysiini, joka on kaikkien tuhoisien S. pneumonia -eristeiden tuottama proteiinitoksiini. Hiirten inununoinnin tällä proteiinilla on havaittu antavan suojatason pneumokokki-infektiolle. 10 Vaikeutena on kuitenkin se, että pneumolysiini on ihmiselle toksista. Siten rokotteeseen sisällytetyn pneumolysiinin tulee olla oleellisesti ei-toksista. Pneumolysiinin ei-toksiseksi tekeminen useimmilla nykyisin käytetyillä menetelmillä muuttaa proteiinin peruskonfiguraatiota siten, että se eroaa immunogeenisesti luontaisesta tai villintyyppisestä pneumolysiinistä. Muutetulla, immunogeenisesti luontaisesta pneumolysiinistä eroavalla 15 proteiinilla esiintuodulla immuunivasteella on laskenut suojauskyky tai ei ollenkaan suojauskykyä. Täten vaikeutena on tuottaa muutettu pneumolysiini, joka ei ole toksista ja joka on samalla riittävän immunogeenisesti samanlaista kuin toksinen muoto suojaavan immuunivasteen esiintuomiseksi. 20 Muutettua pneumolysiiniä, jolla on edellä mainitut ominaispiirteet, voidaan käyttää lukuisissa rokotustavoissa. Siten muutettua pneumolysiiniä voidaan käyttää yksinään immunoimaan tai vaihtoehtoisesti muutettu pneumolysiini voidaan konjugoida pneumokokkipolysakkaridiin tai se voidaan sisällyttää vaihtoehtoisesti rokotteeseen, jolloin pneumokokkipolysakkaridit voidaan konjugoida toiseen proteiiniin ja muutettua pneu- 25 molysiiniä on läsnä pelkästään konjugoimattomassa muodossa. Vaihtoehtoisesti sekä pneumokokkipolysakkaridia että pneumolysiiniä voidaan kumpaakin käyttää konjugoimattomassa muodossa. Keksintö käsittää menetelmän muutetun pneumolysiinin valmistamiseksi, joka pneumo- 30 lysiini ei ole oleellisesti toksista ja kykenee tuomaan esille immuunivasteen eläimessä, joka on reaktiivinen villintyyppiseen pneumolysiiniin. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa. 35 Muutetulla pneumolysiinillä on edullisesti vähentynyt komplementin sitomistoiminta verrattuna villintyyppiseen pneumolysiiniin. Vähentynyt komplementin sitomistoiminta aiheuttaa vähemmän tulehdusta kohdassa, johon rokote annetaan.

4 3 Muutetulla pneumolysiinillä on edullisesti vähentynyt Fc-sitomistoiminta verrattuna villintyyppiseen pneumolysiiniin. Vähentynyt Fc-sitomistoiminta aiheuttaa vähemmän tulehdusta kohdassa, johon rokote annetaan. 5 Edullisesti pneumolysiini on muutettu yhdellä tai useammalla aminohapposubstituutiolla suhteessa villintyyppiseen pneumolysiiniin. Pneumolysiini voidaan muuttaa siten, että mikä tahansa yhdestä tai useammasta villintyyppisen pneumolysiinin tähdepaikoista 367, 384, 385, 428, 433 tai 435 korvataan, 10 poistetaan tai suojataan. 15 Hakemuksessa kuvataan myös rokotetta, joka sisältää muutettua pneumolysiiniä, joka ei ole toksista ja kykenee tuomaan esille immuunivasteen eläimessä, joka on reaktiivinen villintyyppiseen pneumolysiiniin. Rokote käsittää edullisesti kotelopolysakkaridimateriaalin konjugoituna muutettuun pneumolysiiniin. Kotelomateriaali voi olla johdettu yhdestä tai useammasta Streptococcus pneumoniae 20 -serotyypistä 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F ja 33F. Tässä suoritusmuodossa voidaan suuntautua erityisesti serotyyppeihin, jotka liittyvät yleisesti lasten sairauksiin ja joihin lapsilla on yleisesti heikko immuunivaste (so. tans- 25 kalaiset serotyypit 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F ja 23F). Muita nykyiseen 23-arvoiseen Merck Sharpin ja Dohmen rokotteeseen (Pneumovaz 23) sisältyviä yleisiä serotyyppejä voidaan myös käyttää konjugaattien syntetoimiseen (so. tyypit 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F ja 33F) tai mitä tahansa muuta serotyyppiä. Minkä tahansa pneumokokkipolysakkaridin konjugointi proteiinikantajaan takaa hyvän 30 T-solusta riippuvan immunogeenisuuden lapsissa siten, että tuotetaan anti-polysakkaridivasta-aineen suojaavia tasoja. Muutetun pneumolysiinin yhdistäminen kotelomateriaaliin takaa erikoissuojatason, erityisesti S. pneumoniaen serotyyppejä vastaan, jonka polysakkarideja ei ole sisällytetty 35 olemassa oleviin rokoteformulointeihin.

5 4 Rokote annetaan edullisesti injektoimalla ihonalaisesti sopivan apuaineen, kuten alumiinihydroksidigeelin, kanssa tai ilman apuainetta. Toisessa muodossaan keksintö käsittää rekombinanttildoonin, joka sisältää replikonin ja 5 DNA-selcvenssin, joka koodaa muutettua pneumolysiiniä sanotun muutetun pneumolysiinin ollessa ei-toksista ja kykenevä tuomaan esille immuunivasteen eläimessä, joka on realctiivinen villintyyppiseen pneumolysiiniin. Keksintö kohdistuu menetelmään muutetun pneumolysiinin tuottamiseksi, joka käsittää 10 vaiheina sanotun muutetun pneumolysiinin puhdistamisen ilmennysjärjestelmästä, joka sisältää rekombinanttildoonin, jossa on muutettua pneumolysiiniä koodaava DNA, sanotun pneumolysiinin ollessa oleellisesti ei-toksista ja kykenevä tuomaan esille immuunivasteen eläimessä, joka on reaktiivinen villintyyppiseen pneumolysiiniin. 15 llmentämisjärjestelmä on edullisesti isäntäsolun, joka sisältää rekombinanttikloonin, jossa on muutettua pneumolysiiniä koodaava DNA, viljelmä. Hakemus käsittää menetelmän rokotteen valmistamiseksi, joka sisältää vaiheen, jossa muutettu pneumolysiiniä koodaava rekombinanttiklooni vahvistetaan, sanotun kloonatun 20 materiaalin tanslaatio ja transkriptio indusoidaan ja muutettu pneumolysiini puhdistetaan, ja vaiheen, jossa muutettu pneumolysiini konjugoidaan kotelopolysakkaridiin muutetun pneumolysiinin toksisen aktiivisuuden ollessa oleellisesti vähentynyt verrattuna villintyyppiseen pneumolysiiniin. 25 Keksinnön erityisten suoritusmuotojen paremmaksi ymmärtämiseksi keksintöä kuvataan nyt viittaamalla kuvioihin, joissa kuvio 1 on sellaisen geenin DNA-sekvenssi, joka koodaa villintyyppistä pneumolysiiniä, 30 kuvio 2 on sellaisen muutetun geenin DNA-sekvenssi, joka koodaa villintyyppistä pneumolysiiniä ja jota käytetään pneumolysiinigeenin Idoonaamiseen ilmentämisvektoriin, kuvio 3 on villintyyppisen pneumolysiinin aminohapposekvenssi, joka on johdettu sellaisen geenin DNA-sekvenssistä, joka koodaa villintyyppistä pneumoly- 35 siinä, ja kuvio 4 esittää pneumolysiinin aminohapposekvenssiä, jossa on arninohapposubstituutioita, jotka on viety siihen paikkakohdistetulla mutageneesillä.

6 5 Rekombinantfi-DNA-tekniikoita on käytetty ei-toksisten pneumolysiinijohdannaisten valmistamiseen, jotka johdannaiset sopivat ihmisille annettaviksi. Tämän saavuttamiseksi pneumolysiiniä koodaava S. pneumonia -geeni kloonattiin Escherichia coliin ja sen täydellinen DNA-sekvenssi määritettiin. DNA-sekvenssi on esitetty kuviossa 1 ja 5 johdettu aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 3. Pneumolysiinigeenin kolme aluetta alistettiin oligonuldeotidisuunnattuun mutageneesiin. Ensimmäinen alue koodaa aminohappoja proteänisekvenssissä ja on esitetty alleviivauksella kuviossa 3. Tämä 11 aminohapon sekvenssi on absoluuttisesti homogee- 10 ninen muiden liittyvien tioliaktivoitujen toksiinien samanlaisten alueiden kanssa, joiden ajatellaan olevan vastuussa hemolyyttisestä toiminnasta ja siten toksiinin toksisesta aktiivisuudesta. Kaksi muuta aluetta koodaavat aminohappoja ja aminohappoja ja ne on myös esitetty alleviivattuna kuviossa 3. Nämä toksiinin kaksi aluetta ovat aminohapposekvensseiltään oleellisesti homologisia ihmisen C-reaktiivisen prote- 15 iinin (CRP) kanssa ja siten interferenssiltäään niiden ajatellaan olevan vastuussa pneumolysiinin kyvystä sitoutua immunoglobuliinien Fc-alueeseen ja aktivoida komplementfi. Pneumolysiinigeeniin konstuoitiin viisitoista erillistä mutaatiota, jotka aiheuttavat erillisiä aminohapposubstituutioita, kuten kuviossa 4 on esitetty. Muutetun pneumolysiinin rakenteen ylläpitämiseksi tehtiin säilyttäviä substituutioita siten, että aminohapot 20 substituoitiin luonteeltaan samanlaisilla aminohapoilla. Mitä tulee hemolyyttiseen toimintaan osallistuviin alueisiin, Cys438 > Gly, Cys438 > Ser, Trp Phe, Glu434 > Asp, ja Trp 435 > Phe vähensivät jokainen hemolyyttistä toimintaa 97 %, 90 %, 99 %, 75 % ja 90 % vastaavasti. Muut mutaatiot tällä alueella 25 (Cys428 --> Ala, Glu434 > Gln ja Trp436 > Phe) eivät vaikuttaneet hemolyyttiseen toimintaan. Toksänin erillisen alueen mutatoiminen, jonka ajatellaan olevan vastuussa sitoutumisesta kohdesolukalvoihin, vaikuttaa myös proteänin hemolyyttiseen toimintaan. Tämä substituutio, His 367 > Arg, estää täydellisesti hemolyyttisen toiminnan. On aivan ennakoimaton havainto, että His367 > Arg inhiboi enemmän tätä ominaisuutta kuin sub- 30 stituutiot, jotka on tehty 11 aminohapon alueella, jonka ajatellaan olevan vastuussa hemolyyttisestä toiminnasta. CRP:n kaltaisilla domeeneilla olevat mutaatiot testattiin kyvyltään aktivoida komplementtia. Tpr379 > Phe:n, Tyr384 + Phe:n, Asp385 > Asn,:n ja Trp397 -> Phe:n osalta 35 komplementtiaktivointi laski 20 %, 70 %, 100 % ja 15 % vastaavasti. Muut kuviossa 4 esitetyt mutaatiot CRP:n kaltaisilla domeeneilla eivät vähennä komplementin aktivointia. Edellä mainitut mutaatiot, jotka vaikuttavat joko hemolyyttiseen toimintaan tai

7 6 komplementin aktivointiin, eivät huononna proteiinien immunogeenisuutta verrattuna luontaiseen tai villintyyppiseen pneumolysiiniin. Vaikkakin His367 --> Arg on edullinen mutaatio hemolyyttisen toiminnan vähentämisek- 5 si, kanden tai useamman hemolyyttistä toimintaa vähentävän mutantin kombinaatiolla voidaan saavuttaa korkea hemolyyttisen toiminnan tason lasku. Samoin Asp385 > Asp on edullinen mutaatio vähentyneen komplementtialctivoinnin saavuttamiseksi, joskin kanden tai useamman muun vähemmän toimintaa vähentävän mutantin yhdistelmää voidaan myös käyttää. 10 Edullisesti rokotteessa käytettävä pneumolysiinijohdannainen sisältää tiettyjen edellä mainittujen mutaatioiden yhdistelmän siten, että proteiini ei kykene aktivoimaan komplementtia sen lisäksi että sen hemolyyttinen toiminta on nolla. Esimerkkejä tällaisista yhdistehnistä ovat: 15 1)His367 --> Arg + Asp3 85 > Asn, 2) His367 > Arg + Asp Asn + joko Cys428 > Gly tai Trp Phe 3) Asp385 > Asn + Cys428 > Gly + Trp433 Phe 20 Nämä ovat joitakin edullisia yhdistelmiä, vaikkakin on ymmärrettävä, että muita mutaatioiden kombinaatioita voidaan käyttää rokotteessa käytettäväksi tarkoitetun muutetun pneumolysiinin tekemiseksi. Lisäksi muutettu pneumolysiini voi käsittää minkä tahansa yksittäisen mutaation, jossa on riittävästi vähentynyt toiminta. 25 Muutettua pneumolysiiniä koodaavasta DNA:sta peräisin olevan muutetun pneumolysiinin korkea ilmentymistaso voidaan saavuttaa käyttämällä mitä tahansa lukuisista konventionaalisista tekniikoista mukaan lukien ilmentäminen prokaryootti-isännässä, johon DNA on kloonattu sopivasti missä tahansa monista nykyisin saatavissa olevista ilmentämisvektoreista tai kloonattu sopivasti isäntäkromosomissa, tai in vitro -ilmentämisjär- 30 jestelmässä, kuten sellaisessa, joka voi käsittää puhdistettuja komponentteja, joita tarvitaan muutetun pneumolysiinin ilmentämiseen. Mutatoidun pneumolysiinigeenin korkean ilmentymistason saavuttamiseksi se kloonattiin vektoriin pkk233-2 Escherichia colissa tai muussa sen kaltaisessa prokaryootissa 35 ilmentämistä varten. Tämä vektori sisälsi ampisilliini- ja tetrasykliiniresistantit geenit, trc-promoottorin (jota voidaan säätää IPTG:llä [isopropyyli-[3-d-tiogalaktopyranosidi] ja lac Z -ribosomia sitovalla kohdalla, joka on ATG-aloituskodonin vieressä, joka sisäl-

8 7 tää Ncol-restriktiokohdan. Välittömästi poispäin aloituskohdasta on Pstl:n ja HindIII:n restriktiokohdat, joita seuraa voimakas T 1T2-translcriptioterminaattori. Ennen pkk233-2:een liittämistä konstruoitiin Ncol-restrikliokohta pneumolysiiniä koodaavan sekvenssin 5'-päähän (aloituskodonissa) oligonukleotidisuurmatulla mutageneesillä, kuten kuvi- 5 ossa 2 on esitetty. Tämä mandollistaa pkk233-2:n Ncol-paikkaan kloonattavan muutetun pneumolysiinigeenin proksimaalipään ja pneumolysliniterrninaatiokodoniin suunnilleen 80 emästä olevaan 1-Tinan-paikkaa käytettiin muutetun geenin distaalipään silmilcoimiseksi pkk233-2:ssa olevaan yhteensopivaan kohtaan. Mutanttipneumolysiinikloonijohdannainen voidaan kuitenkin kloonata mihin tahansa lukuisista korkeista il- 10 mentämisvektorijärjestelmistä. Mutanttipneumolysiini valmistetaan seuraavasti: E. coli -solut, joissa on edellä mainittu rekombinanttiplasmidi, viljellään ensin 9 litran viljelmissä Luria Bertani- (tai missä tahansa muussa sopivassa) väliaineessa, jota on täydennetty sopivalla antibiootilla, C:ssa ilmastaen. Kun viljelmä saavuttaa kasvun myöhäisen logaritmisen faasin, IPGT:tä lisätään 20 gm:n loppupitoisuuteen (muutetun pneumolysiinigeenin ilmentymisen indusoimiseksi) ja inkubointia jatketaan toiset 2-3 tuntia. Solut kerätään sitten sentrifugoimalla tai ultrasuodatuksella ja lysoidaan käsittelemällä 20 EDTA:lla ja lysotsyyrnilla, mitä seuraa sonikointi, tai hajottamalla ranskalaisessa painesolussa. Solujäte poistetaan sentrifugoimalla ja sitten uute dialysoidaan laajasti vasten 10 mm natrimnfosfaattia (ph 7,0). Sitten materiaali panostetaan DEAE-selluloosapylvääseen ja eluoidaan lineaarisella gm natriumfosfaattigradientilla (ph 7,0). Fraktiot, jotka sisältävät pneumolysiinijohdannaisen huipputasoja, kerätään, konsent- 25 roidaan ultrasuodatuksella ja panostetaan Sephacryl S-200 -pylvääseen. Tämä pylväs kehitetään 50 mm natriumfosfaatissa (ph 7,0) ja jälleen kerätään fraktiot, joissa on korkeat pneumolysiinijohdannaistasot, ne konsentroidaan ultrasuodatuksella ja varastoidaan 50 % glyserolissa -15 C:ssa. Lopputuote on yli 95 % puhdasta määritettynä SDS-polyalcryyliamidigeelielektroforeesilla. Hydrofobinen vuorovaikutuskromatografia fenyyli- 30 Sepharosella on vaihtoehtoinen puhdistus, jota voidaan myös käyttää. On kuitenkin ymmärrettävä, että se on vain yksi muutetun pneumolysiinin puhdistusmenetelmistä ja muita vaihtoehtoisia menetelmiä (mukaan lukien korkean paineen nestekromatografia) voidaan käyttää. 35 Puhdistettu muutettu pneumolysiini voidaan antaa rokotteina sopivina määrinä joko yksinään tai yhdistettynä muihin antigeeneihin. Eräässä muodossa pneumolysiini voidaan

9 8 konjugoida polysakkaridiin, joka on johdettu yhdestä tai useammasta erilaisesta edellä kuvatusta pneumokokkilajista. Mutanttipneumolysiini voidaan konjugoida erilaisiin polysakkaridiserotyyppeihin useilla 5 menetelmillä. Ensin valmistetaan aktivoitu polysakkaridi käsittelemällä puhdas polysakkaridi (saatavissa kaupallisesti) syaanibromidilla ja adipiinihappodihydratsidilla (ADH). ADH-polysakkaridi yhdistetään sitten mutanttipneumolysiiniin 1-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi-HC1:n läsnäollessa. Konjugoitu materiaali erotetaan reagoivista aineista kromatografoimalla Sepharose CL-4B:n läpi. 10 Polysakkaridi-mutanttipneumolysiinikonjugaatit voidaan valmistaa vaihtoehtoisesti käyttämällä bifunktionaalisia reagoivia aineita, kuten N-suldcinimidyyli-6(4'-atsido-2'- nitrofenyyliamino)heksanoaatti (SANPAH). Fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen liuotetun puhtaan polysakkaridin annetaan reagoida SANPAH:n kanssa voimakkaan 15 valkoisen valon lähteen läsnäollessa. Sitten reagoimaton SANPAH erotetaan aktivoituneesta polysakkaridista kromatografialla Sephadex G-50:llä. Sitten aktivoitunut polysaldcaridi konjugoidaan mutanttipneumolysiiniin 0,2 M boraattipuskurissa (ph 8,5). Sitten mikä tahansa ylimääräisistä reaktiivisista ryhmistä suojataan lysiinillä ja polysakkaridi-proteiinikonjugaatti erotetaan muista reagoivista aineista kromatografoimalla 20 Sepharose CL-4B:llä. Konjugaatit voidaan valmistaa myös pelkistysaminoinnilla syaaniboorihydridillä. Toinen proteiini, kuten inaktivoitu tetanustoksiini, voidaan konjugoida vaihtoehtoisesti haluttuihin polysakkarideihin ja muutettu pneumolysiini voidaan lisätä rokotteeseen 25 konjugoimattomassa muodossa. Edellä on kuvattu keksinnön paras suorittamismenetelmä, eikä sitä tule ymmärtää keksintöä rajoittavaksi.

10 9 Patenttivaatimukset 1. Eristetty DNA-sekvenssi, joka koodaa muutettua pneumolysiiniä, joka on oleellisesti ei-toksista ja kykenee nostattamaan immuunivasteen eläimessä, joka on reaktiivi- 5 nen villityyppiselle pneumolysiinille, tunnettu siitä, että sen koodaaman muutetun pneumolysiinin aminohapposekvenssi on esitetty kuvassa 3, jota sekvenssiä on muutettu vähintään yhdellä aminohapposubstituutiolla, deleetiolla tai salpaamisella alueella, joka koodaa aminohappoja , tai Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa muutettua pneumolysii-niä, jonka komplementin sitomisaktiivisuus on vähentynyt verrattuna villityyppiseen pneumolysiiniin 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että 15 se koodaa muutettua pneumolysiiniä, jonka Fc-sitomisaktiivisuus on vähentynyt verrattuna villityyppiseen pneumolysiiniin. 4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että sen koodaama muutettu pneumolysiini on konjugoitu kotelopolysakkaridimateriaa- 20 liin, joka on johdettu mistä tahansa yhdestä tai useammasta Streptococcus-serotyypistä. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että kotelomateriaali on johdettu yhdestä tai useammasta Streptococcus pneumoniae -serotyypistä 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 25 17F, 20, 22F ja 33F. 6. Eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa muutettua pneumolysiiniä, jolla on seuraava aminohapposekvenssi: 30 Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe He Leu Ala Met 1 11 Asn Tyr Asp Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gln Gly Glu 21 Ser He Glu Asn Arg Phe He Lys Glu Gly Asn Gln Leu Pro Asp Glu Phe Val Val He Glu Arg Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp He Ser Val Thr Ala Thr 61

11 10 Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Val Val 71 Asp Glu Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg Ala Pro Met Thr Tyr Ser lie Asp Leu Pro 101 Gly Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe Leu Gln Val Glu Asp 111 Pro Ser Asn Ser Ser Val Arg Gly Ala Val Asn Asp Leu Leu Ala Lys Trp His Gln Asp Tyr Gly Gln Val Asn Asn jossa R 1 on His tai Arg, R2 on Trp tai Phe, R3 on Tyr tai Phe, R4 on Asp tai Asn, R5 on 15 Trp tai Phe, R6 on Cys, Gly tai Ser, R7 on Trp tai Phe, R8 on Glu tai Asp, R9 on Trp tai Phe ja jossa vähintään yksi tähteistä R1, R6, R7, R8 tai R9 on muu kuin villityyppinen. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että R 1 R2 Trp, R3 on Tyr, R4 on Asn, R5 on Trp, R6 on Cys, R7 on Trp, R8 on Glu ja R9 on Arg, 20 on Trp Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että sen koodaama muutettu pneumolysiini on konjugoitu kotelopolysakkaridimateriaaliin, joka on johdettu mistä tahansa yhdestä tai useammasta Streptococcus-serotyypistä. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että kotelomateriaali on johdettu yhdestä tai useammasta Streptococcus pneumoniae -serotyypistä 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F ja 33F. 10. Rekombinanttiplasmidi, tunnettu siitä, että se sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukaisen muutettua pneumolysiiniä koodaavan DNA-sekvenssin. 11. Hybridi-isäntäsolu, tunnettu siitä, että sisältää patenttivaatimuksen 10 mukaisen 35 rekombinanttiplasmidin, joka sisältää indusoitavan ilmentämisen ohjauksen, joka toimii sanotun muutettua pneumolysiiniä koodaavan DNA-sekvenssin ilmentämiseksi isäntäsolussa.

12 Menetelmä muutetun pneumolysiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisen, muutettua pneumolysiiniä koodaavan DNA-sekvenssin, joka on läsnä patenttivaatimuksen 10 mukaisessa rekombinanttiplasmidissa, transkription ja tanslaation, ja muutetun pneumolysiinin puhdistamisen ilmen- 5 tämissysteemistä. 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä muutetun pneumolysiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheen, jossa muutettu pneumolysiini puhdistetaan isäntäsoluviljelmästä, joka sisältää rekombinanttikloonin, jossa on muutettua pneu- 10 molysiiniä koodaava, jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen DNA-sekvenssi. 14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheen, jossa konjugoidaan muutettu pneumolysiini kotelopolysakkaridin kanssa. 15 Patentkrav 1. Isolerad DNA-sekvens som kodar muterat pneumolycin, som är väsentligen icke toxiskt och förmår höja inununrespons hos ett djur som är reaktivt mot pneumolycin av vild typ, kännetecknad av att aminosyrasekvensen för det muterade pneu- 20 molycin den kodat illustreras i figur 3, varvid sekvensen ändrats med minst en aminosyrasubstitution, deletion eller blockad inom ett område som kodar aminosyror , eller Isolerad DNA-sekvens enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den kodar 25 muterat pneumolycin, i vilket komplementets bindaktivitet minskat i jämförelse med pneumolycin av vild typ. 3. Isolerad DNA-sekvens enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknad av att den kodar muterat pneumolycin vars Fc-bindaktivitet minskat i förhållande till pneumo- 30 lycin av vild typ Isolerad DNA-sekvens enligt något av patentkraven 1-3, kännetecknad av att det muterade pneumolycin den kodar är konjugerat till ett kapselartat polysackaridmaterial, som härletts från någon, en eller flera, Streptococcus-serotyper. 5. Isolerad DNA-sekvens enligt patentkrav 4, kännetecknad av att det kapselartade materialet härletts fi -å'n en eller flera Streptococcus pneumoniae-serotyper 6A,

13 12 6B, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F och 33F. 6. Isolerad DNA-sekvens, kännetecknad av att den kodar muterat pneumolycin 5 med följande aminosyrasekvens: Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala Met 1 11 Asn Tyr Asp Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gln Gly Glu Ser Ile Glu Asn Arg Phe Ile Lys Glu Gly Asn Gin Leu 31 Pro Asp Glu Phe Val Va1 Ile Glu Arg Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp Ile Ser Val Thr Ala Thr 61 Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Val Val 71 Asp Glu Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg Ala Pro Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro 101 Gly Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe Leu Gin Vai Glu Asp Pro Ser Asn Ser Ser Val Arg Gly Ala Val Asn Asp Leu 121 Leu Ala Lys Trp His Gin Asp Tyr Gly Gin Vai Asn Asn i vilken R 1 är His eller Arg, R2 är Trp eller Phe, R3 är Tyr eller Phe, R4 är Asp eller Asn, R5 är Trp eller Phe, R6 är Cys, Gly eller Ser, R7 är Trp eller Phe, R8 är Glu eller Asp, R9 är Trp eller Phe och i vilken minst en av källorna R 1, R6, R7, R8 eller R9 är något annat än av vild typ Isolerad DNA-sekvens enligt patentkrav 6, kännetecknad av att R 1 är Arg, R2 är Trp, R3 är Tyr, R4 är Asn, R5 är Trp, R6 är Cys, R 7 är Trp, R 8 är Glu och R9 är Trp. 8. Isolerad DNA-sekvens enligt patentkrav 6 eller 7, kännetecknad av att det 40 muterade pneumolycin den kodar är konjugerat till ett kapselartat polysackaridmaterial som härletts från någon, en eller flera, Streptococcus-serotyper.

14 Isolerad DNA-sekvens enligt patentkrav 8, kännetecknad av att det kapselartade materialet härletts från en eller flera Streptococcus pneumoniae-serotyper 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, I7F, 20, 22F och 33F. 10. Rekombinantplasmid, kännetecknad av att den innehåller en DNA-sekvens som kodar muterat pneumolycin enligt något av patentkraven Hybridvärdcell, kännetecknad av att den innehåller en rekombinantplasmid 10 enligt patentkrav 10, som innehåller styrning av expressionen som skall induceras, varvid styrningen verkar för expression i värdcellen av nämnda DNA-sekvens som kodar muterat pneumolycin. 12. Förfarande för framställning av muterat pneumolycin, kännetecknat av att det 15 innefattar transkription och translation av en DNA-sekvens som kodar muterat pneumolycin enligt något av patentkraven 1-7, samt rening av det muterade pneumolycinet från expressionssystemet. 13. Förfarande enligt patentkrav 12 för framställning av muterat pneumolycin, 20 kännetecknat av att det innefattar ett steg i vilket det muterade pneumolycinet renas från värdcellsodlingen som innehåller en rekombinantklon med en DNA-sekvens som kodar muterat pneumolycin enligt något av patentkraven Förfarande enligt patentkrav 12 eller 13, kännetecknat av att det innefattar ett 25 steg för att konjugera det muterade pneumolycinet med kapselartad polysackarid.

15 118 AGATGGCAAA TAAAGCAGTA AATGACTTTA TACTAGCTAT GAATTACGAT ^^^^^GAAAC TCTTGACCCA TCAGGGAGAA AGTATTGAAA ATCGTTTCAT CAAAGAGGGT AATCAGCTAC CCGATGAGTT 7G77GTTATC GAAAGAAAGA.-,,,-,--, AGCGGAGC7T GTCGA ^.-^^L,J.k.,^1^ ^u^t_k-^.^c GACAGTCGCC TCTATCCTGG AGCACTTCTC GTAGTGGATG AZACCTTG7T ----,-- r.--.,----. GTATTGATTT GCCTGG7TTG GCAAGTAGCG ATAGC77TC7 CCAAGTGGAA GAe- CCCAGCA ATTCAAGTG: 7CGCGGAGCG GTA7-;CGATT 7G77GGC7._ pm.ma..eme Na " k.7^. ^ %4W: *N ".N.1 ^ ^1" AGCT P. PF1 / C,.---.,--. I....5 ON. pew " ~1 OM OM ms.". %.049.,%: '...^^^^~9k.j^ 41. ^. ^^,.., Cf":"=": CAGGAGATG: c 7GGAAACCAC 1"...;"=.: r...nom P. offl. / WAATACAGAA GTGAAGGCGG 7TATTTTAGG GGGCGACCCA ~..' "."," -----c- GATTC:=_AGAA.,,A W=Tr:ACAA77: TAGTTGCGAC C7-7C.,== ;C AtzTACAT ATC-7Tr:AGAC T;-;r:GTTACA GCTTACAGAA A'- GGAGATTT ACTGCTGGAT CTAC-ACAT CAAGGTAAG:.: AAGTCTTGAC 7CCTAAGGCT 7G.SGACAGAA ATWJGCAGC:A TTTGACGGCT CACTTTACCA CTAGTATTCC TTTA.AAAW.C. AATGTTCGTA ATCTC7CTG: W-_AAATTAGA GAC:TGTACCG GGC1TGCC7G GGAATGGTGG CGT4.CGG:T7 ATGAAAAC C2ATTTGCCA CTAGTGCGTA AGCGGACGAT TTCTATTTGZ; GC:7-_ACAACTC 7CTATCCTCA GGTAGAGGAT AAGGTAGAAA ATGAC KUVIO 1 Pneumolysiinigeenin DNA-sekvenssi ATG-aloituskodoni on alleviivattu

16 - 2/8 CCATGGCAAATAAAGCAGTA AATGACTTTA TACTAGCTAT GAATTACGAT AAAAAGAAAC 7CTTGACCCA TCAGGGAGAA AGTATTGAAA ArCGT7TCAT CAAAGAGGGT AATCAGCTAC CCGATGAGT7 TGTTG7TATC GAAAGAAAGA AGCGGAGCTT GTCGACAAAT ACAAGTGATA TTTCTGTAAC AGCTACCAAC GACAGTCGCC TCTATCCTGG AGCACT7C7C GTAGTGGATG AGACCTTGTT AGAGAATAAT CZCACTCTTC 77GCGGTTGA TCGTGCTCCG ATGACTTATA GTATTGATTT GCCTGGTTTG GCAAGTAGCG ATAGCTT7CT CCAAGTGGAA GACCCCAGCA TCGCGGAGCG G7GGCATCAA GATTATGGTC AGG7CAATAA 7GTCCCAGC7 Ar:AATGCAGT ATG^^^^^...T TCTGACTTTG A:...AGACAGG GAATTCTCTT GATATTGATT TTAACTCTGT CCATTCAGGT GAAAAGCA G A -..-., "C=C."" C^ - ' - 'CC -- Tr- C' C - ' G' C" 'C"...,. r.,. ATTTCGAGTG TTGCT7A757: GCGCAAGTC 7A7C7G7 u. k.1% On&. " ".",. 11,. 7 V.? "en AT?:.AAGGAG TCAAGGTAGC TCCTCAGACA GAGTGGAAGC ASA7777GGA C7-k7ACAGAA GTG;.;r:GCGG TTA"TiTAGG GGGCGACCCA AG -TC=GGTG CCCGAGTTGT AACAGGCAAG GTGGATATGG. TAGAGGACTT GA:TCAAGAA GGCAGTCGCT TTACAGCAGA TCATCCAGGC TiGCCGAT7T CGTGACAATG TAGTTGCGAC CTTTCAAAAC AGTACAZ;ACT CATAGTGGTG CCTATGTTGC CCAATATTAT ATTACTTGGG ATGAATTATC ATGGGCAGGA TTTGACGGCT CACTTTACCA AATGTTCGTA ATCTCTCTG7 WAAATTAGA GAGTGTACCG GGCTTGCC7G GGAATGGTGG CGTACGGTT7 ATGAAAAAAC CSATTTGCCA AGCGGACGAT TTCTATTTGG GGAACAACTC TCTATCCTCA GGTAGAGGAT AAGGTAGAAA ATGAC KUVIO 2 Modifioidun pneumolysiinigeenin DNA-sekvenssi. Ncol-restriktiokohta (alleviivattu) on viety aloituskodoniin

17 3/8 Met Ala Asn Lys Ala Vai Asn Asp Phe lie Leu Ala Met Asn Tyr Asp Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gln Gly GIu 21 Ser Ile GIu Asn Arg Phe lie Lys Glu Gly Asn Gln Leu 31 Pro Asp Glu Phe Val Val lie Glu Arg Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp Ile Ser Val Thr Ala Thr 61 Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Vai Val 71 Asp Glu Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Vai Asp Arg Ala Pro Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro 101 Gly Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe Leu Gln Vai GIu Asp 111 Pro Ser Asn Ser Ser Val Arg Gly Ala Vai Asn Asp Leu 121 Leu Ala Lys Trp His Gin Asp Tyr Giy Gln Vai Asn Asn Val Pro Ala Arg Met Gin Tyr Giu Lys lie Thr Ala His 151 Ser Met GIu Gln Leu Lys Val Lys Phe Gly Ser Asp Phe 161 Glu Lys Thr Giy Asn Ser Leu Asp lie Asp Phe Asn Ser Vai His Ser Gly Glu Lys Gin lie Gin lie Val Asn Phe 191 Lys Gln lie Tyr Tyr Thr Vai Ser Val Asp Ala Val Lys 201 Asn Pro Giy Asp Vai Phe Gin Asp Thr Vai Thr Val Glu

18 4/8 Asp Leu Lys Gin Arg Gly Ile Ser Ala Glu Arg Prg5 Leu 231 Val Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr 241 Leu Lys Leu GIu Thr Thr Ser Lys Ser Asp GIu Val Glu 251 Ala Ala Phe Glu Ala Leu lie Lys Giy Vai Lys Val Ala Pro Gin Thr Glu Trp Lys Gln lie Leu ASD Asn Thr Glu 281 Vai Lys Ala Val lie Leu Gly GIy Asp Pro Ser Ser Giy 291 Ala Arg Vai Val Thr Gly Lys Vai Asp Met Vai GIu Asp Leu Ile Gin Glu Gly Ser Arg Phe Thr Ala Asp His Pro 321 Gly Leu Pro lie Ser Tyr Thr Thr Ser Phe Leu Arg Asp 331 Asn Val Vai Ala Thr Phe Gin Asn Ser Thr Asp Tyr Val Glu Thr Lys Vai Thr Ala Tyr Arg Asn GIy Asp Leu Leu 361 Leu Asp His.$er Gly Ala Tyr Vai Ala Gln Tyr Tyr lie 371 Thr Trp ASD Glu Leu Ser Tyr Asp His Gln Giy Lys Glu 381 Vai Leu Thr Pro Lys Ala Trp Asp Arg Asn Gly Gin Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser lie Pro Leu Lys Gly 411 Asn Val Arg Asn Leu Ser Val Lys Ile Arg 421 Cys Thr Glv Leu Ala Trp GIu Trp Trp Arg Thr Val Tyr Glu Lys Thr Asp Leu Pro Leu Val Arg Lys Arg Thr lie Ser lie 451

19 5/8 Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Gin Val Glu Asp Lys Val 461 Glu Asn Asp 471 KUVIO 3

20 6/8 Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala Met 1 11 Asn Tyr Asp Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gin Gly Giu 21 Ser lie Glu Asn Arg Phe Ile Lys Giu G!y Asn Gin Leu 31 Pro Asp Giu Phe Val Val Ile Giu Arg Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp lie Ser Val Thr Ala Thr 61 Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Val Vai 71 Asp Glu Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg Ala Pro Met Thr Tyr Ser lle Asp Leu Pro 101 Giy Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe Leu Gin Vai Glu Asp 111 Pro Ser Asn Ser Ser Vai 121 Arg Giy Ala Va! A.sn Asp Leu Leu Ala Lys Trp His Gin Asp Tyr 131 Giy Gin Val Asn Asn 141 Vai Pro Ala Arg Met Gln Tyr Giu 151 Lys Ile Thr Ala His Ser Met Glu Gin Leu Lys Vai Lys 161 Fhe Giy Ser Asp Phe Giu Lys Thr G!y Asn Ser Leu Asp lie Asp Fhe Asn Ser Val His Ser Gly Glu Lys Gln lie Gin lie Va! Asn Phe 191 Lys Gln Ile Tyr Tyr Thr Vai Ser Vai Asp Ala Vai Lys 201 Asn Pro Gly Asp Val Phe Gin Asp Thr Val Thr Vai Giu Asp Leu Lys Gin Arg Giy Ile Ser Ala Glu Arg Pro Leu 231

21 7/8 Vai Tyr lie Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr 241 Leu Lys Leu Glu Thr Thr Ser Lys Ser Asp Glu Vai Glu 251 Trp Ala Ala Phe Glu Ala Leu Ile Lys Gly Vai Lys Val Ala Phe Pro Gln Thr Glu Trp Lys Gin Ile Leu Asp Asn Thr Glu 281 Vai Lys Ala Val lie Leu Gly Gly Asp Pro Ser Ser Gly 291 Ala Arg Val Val Thr Gly Lys Val Asp Met Val Giu Asp Leu lie Gin Glu Gly Ser Arg Phe Thr Ala Asp His Pro 321 Gly Leu Pro Ile Ser Tyr Thr Thr Ser Phe Leu Arg Asp 331 Asn Vai Vai Ala Thr Phe Gln Asn Ser Thr Asp Tyr Val Glu Thr Lys Val Thr Ala Tyr Arg Asn Giy Asp Leu Leu 361 Arg Leu Asp His Ser Gly Ala Tyr Vai Ala Gln Tyr Tyr lie 371 Phe Phe Asn 1 I I Thr Trp Asp Glu Leu Ser Tyr Asp His Gin Gly Lys Glu 381 Phe Val Leu Thr Pro Lys Ala Trp Asp Arg Asn Gly Gin Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser lie Pro Leu Lys Gly 411

22 8/8 Ala,t Gly --Ser Asn Val Arg Asn Leu Ser Val Lys Ile 421 Arg Glu Cys Thr Asp Phe Gln Phe Phe I I I I Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Tyr Glu Lys Thr Asp Leu Pro Leu Val Arg Lys Arg Thr Ile 451 Ser Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Gin Val Glu Asp Lys Val 461 Glu Asn Asp 471 KUVIO 4