TEE-SE-ITSE-ELEKTROFOREESI

Transkriptio

1 TEE-SE-ITSE-ELEKTROFOREESI Justus Mutanen (Opinkirjon työn pohjalta) BioPop-resurssikeskus, Helsingin yliopiston LUMA-keskus Työn tavoite Työn tavoitteena on tutustua elektroforeesin periaatteeseen ja ymmärtää sen sovellusmahdollisuudet biologisessa tutkimuksessa. Työssä rakennetaan elektroforeesilaitteisto itse, valetaan agaroosigeeli ja testataan näytteiden ajautumista agaroosigeelissä. Työ on suunniteltu siten, että se voidaan toteuttaa tavallisessa koulussa ilman erityisiä laboratoriotiloja tai tarvikkeita. Tee-se-itse-elektroforeesi sopii hyvin biologiaa, kemiaa ja fysiikkaa eheyttävään kokonaisuuteen. Työ on suunniteltu lukioikäisille opiskelijoille ja sitä voidaan soveltaa esimerkiksi lukion biologian viidennellä tai lukion kemian neljännellä tai viidennellä kurssilla. Työ on suunniteltu Opinkirjon tiedekerhojen materiaalin pohjalta: edekerhoon/genetiikkaa Taustaa DNA eli deoksiribonukleiinihappo toimii kaikkien eliöiden perimäaineksena. Se koostuu kahdesta juosteesta, jotka pariutuvat toisiensa kanssa vetysidoksin. DNA-juoste koostuu kolmesta toistuvasta osasta: emäs-, sokeri- ja fosfaattiosasta. Juosteen runkona on fosfaatista ja deoksiriboosista (sokeri) koostuva ketju. Emäksiä on neljä erilaista (A, C, G ja T) ja ne kiinnittyvät sokeriosaan. DNA:n fosfaattiosa neutraalissa ph:ssa negatiivisesti varautunut ja se antaa DNA-molekyylille negatiivisen varauksen. DNA:n kemialliseen rakenteeseen on merkitty yksi nukleotidi, joka koostuu sokeri-, fosfaattija emäsosasta. Fosfaattiosa on negatiivisesti varautunut. DNA:n kokoa, laatua ja määrää tutkitaan yleisimmin elektroforeesin avulla.

2 Työn periaate Elektroforeesissa sähköisesti varautuneita aineita erotellaan sähkökentän avulla. Sähköisesti varautuneet aineet kulkeutuvat sähkökentässä kohti vastakkaismerkkistä varausta. Esimerkiksi negatiivisesti varautunut DNA-molekyyli kulkeutuu kohti laitteiston positiivista elektrodia. Elektroforeesilaitteisto muistuttaa rakenteeltaan elektrolyysikennoa. Laitteistoon kuuluu virtalähde, elektrodit, ajoastia sekä tutkittavat näytteet. Yleensä näytteitä ajetaan geelimäisessä väliaineessa, jotta ne erottautuisivat paremmin. Tässä työssä hyödynnetään agaroosigeeliä, joten kyseessä on agaroosigeelielektroforeesi (AGE). Geelielektroforeesissa näytteiden ajautumisnopeuteen vaikuttavat sekä aineen molekyylien koko että sähkövaraus. Isommat molekyylit ajautuvat hitaammin kuin pienemmät, sillä geeli vastustaa enemmän suurempien molekyylien kulkua. Tämän vuoksi geelielektroforeesissa suuret DNA-pätkät ajautuvat hitaimmin ja pienimmät nopeimmin. Näin erikokoisia DNApätkiä voidaan erotella toisistaan. Tässä työssä DNA:n sijaan käytetään erilasia (elintarvike)värejä, jotka ovat joko varauksettomia tai negatiivisesti varautuneita. Värien avulla elektroforeesin toimintaa voidaan tarkkailla helpommin. Tehtävänä on selvittää, montaa eri väriainetta elintarvikevärit sisältävät ja onko väriaineilla sähköistä varausta. Elektroforeesilaitteisto rakennetaan käyttäen tavallisesta kaupasta saatavia välineitä. Lisäksi työssä valmistetaan agaroosigeeli, pipetoidaan näytteet geelin sisään ja seurataan niiden kulkeutumista geelielektroforeesin aikana. Kaupallinen agaroosigeelielektroforeesilaitteisto.

3 Työturvallisuus Työssä on käytettävä suojatakkia koko työn ajan. Agaroosigeelin valmistamisen aikana on suositeltavaa käyttää myös suojalaseja ja käsineitä. Työssä käytettävät kemikaalit ovat ns. keittiökemikaaleja, eikä niistä ole oikein käsiteltynä vaaraa. Suurimmat vaarat liittyvät elektroforeesilaitteen käyttämiseen: o Älä koskaan oikosulje virtapiiriä elektroforeesissa! o Tarkkaile elektroforeesin aikana paristojen lämpötilaa. Mikäli ne kuumenevat liikaa, lopeta ajo, anna paristojen jäähtyä ja vähennä paristojen määrää. o Varo koskettamasta elektroforeesilaitteistoa ajon aikana. Älä myöskään koske molempia elektrodeja yhtä aikaa, jotta välttyisit sähköiskulta. 45 V jännitteestä saa jo melkoisen tärskyn! Lisäksi agaroosigeelin (tai agargeelin) valmistuksen aikana on huomattava seuraavat asiat: o Käytä suojakäsineitä tai patakinnasta, kun käsittelet kuumaa geeliä. o Työskentele varovaisesti kuumennetun agaroosigeelin kanssa, sillä se polttaa hyvin helposti! o Älä kuumenna geeliä liikaa mikrossa, jotta se ei kiehu astiasta pois. Älä anna geelin kiehua mikrossa, vaan sekoita sitä välillä. o Ole varovainen ottaessasi kuumaa agaroosigeeliä mikroaaltouunista. Liikutettaessa kuuma geeli saattaa kuohahtaa yllättävästi, vaikka ei näytä kiehuvalta. Pipetin käytöstä: o Käytä pipetissä AINA kärkeä!!! o Älä koskaan käännä pipettiä vaakatasoon tai ylösalaisin, jos sen kärjettä on nestettä!!! o Poista kärki aina heti käytön jälkeen. Arvioitu aika o 1 h, kun rakennetaan pelkkä laitteisto. o 2 h, kun elektroforeesilaitteiston osat valmistetaan pienryhmissä ja ajetaan geeli o 3 h, kun kaikki valmistavat itse osat elektroforeesilaitteistoon ja jokainen ajaa oman geelinsä Ennen työtä pohdittavaksi tai selvitettäväksi o Mihin elektroforeesia käytetään biotekniikassa? o Mitä agaroosi (tai agar) on ja mistä sitä saadaan? o Miksi DNA-pätkiä halutaan erotella koon mukaan?

4 Tarvikkeet o Muovisia pakasterasioita ja niiden kansia o Alumiinifoliota o Hauenleuoilla varustettuja johtimia (voit myös valmistaa itse johtimesta ja hauenleuoista) o Piirtoheitinkalvoa o Sakset o Teippiä o Ilmastointiteippiä o 9 V paristoja (3 5 / laitteisto) o Vettä (vesijohtovesi riittää) o Ruokasuolaa (natriumkloridia) o Ruokasoodaa (natriumvetykarbonaattia) o Lasi- tai muovipullo o Mittalasi (1 l) o Ruoka- ja teelusikka o Erlenmeyer (250 ml), keittopullo tai muu mikron kestävä lasiastia (väh. 250 ml) o Mikroaaltouuni o Vaaka o Agaroosia tai agarhiutaleita o Tutkittavia näytteitä (esim. elintarvikevärejä) o Pipetti ja pipetinkärkiä Työn suoritus VAIHE 1: Laitteiston rakentaminen ja reagenssien valmistaminen Vaihe 1 voidaan tehdä neljässä pienryhmässä, jolloin ryhmät tekevät seuraavat asiat: o o o o Kelkat Ajoastiat ja kammat Geelin valmistaminen Puskuriliuoksen valmistaminen HUOM! Jos vaihe 1 tehdään pienryhmissä: Huomaa, että geeliä valmistettaessa tarvitaan puskuriliuosta ja kelkat. Ne kannattaa säästää edelliseltä kerralta tai valmistaa etukäteen. Valmistetut kelkat ja puskuriliuokset voi säästää seuraavalle kerralle.

5 b. Kammat Tarvikkeet: o Pakasterasioiden kansia o Sakset Miten tehdään: o Leikkaa pakasterasioiden kansista koholla olevat reunat pois. Leikkaa kansi keskeltä kahteen osaan. o Taita saamasi osat kahtia. o Aseta taitettu sivu alaspäin ja leikkaa kannesta kampa, jossa on useita piikkejä. Piikit eivät saa yltää ajokelkan pohjaan saakka (ks. kuva). Käytä apunasi vanhoja kelkkoja tehdessäsi kampaa. Kampa kelkassa ja sen ulkopuolella

6 c. Ajoastia Tarvikkeet: o Pakasterasioita o Alumiinifoliota o Hauenleuoilla varustettuja johtimia Miten tehdään: o Taittele alumiinifolio nelinkerroin ja vuoraa sillä pakasterasian päädyt. o Kiinnitä johtimet hauenleuoilla folioon, mutta älä yhdistä niitä virtalähteeseen vielä tässä vaiheessa. Ajoastia

7 d. Puskuriliuos Tarvikkeet: o Vettä (vesijohtovesi käy) o Ruokasuolaa (natriumkloridia) o Ruokasoodaa (natriumvetykarbonaattia eli natriumbikarbonaattia) o Lasi- tai muovipullo o Ruoka- ja teelusikka o Mittalasi Miten tehdään: o Lisää pulloon 1/16 teelusikallinen ruokasuolaa (0,05 g) o Lisää pulloon kukkurainen ruokalusikallinen leivontasoodaa (2,0 g) o Lisää pulloon 1,0 l vettä o Sekoita kääntämällä pulloa ylösalaisin, mutta älä ravista. Anna ruokasuolan ja ruokasoodan liueta kokonaan. o Valmiin liuokset ph:n tulisi olla noin 8,5, minkä voi halutessaan testata ph-mittarilla tai ph-paperilla. Puskuriliuoksen valmistamisessa tarvittavat tarvikkeet.

8 VAIHE 2: Geelielektroforeesi Seuraavassa vaiheessa tehdään itse geelielektroforeesiajo. Tätä varten sinun tulee rakentaa virtalähde 9 V paristoista. Kytke 3 5 paristoa sarjaan (kokonaisjännite V). Älä kytke enempää paristoja sarjaan, sillä muuten ne voivat ylikuumentua! Tarvikkeet: o 9 V paristoja (tai tasavirtalähde) o Ajoastia (kohta 1 c) o Geeli (kohta 1 e) o Tutkittavat näytteet (Voit lisätä näytteisiin glyserolia pipetoinnin helpottamiseksi) o Pipetti ja pipetinkärkiä Miten tehdään: o Leikkaa kelkka irti geelistä ja aseta geeli ajoastiaan. o Irrota kampa varovasti geelistä. o Pipetoi tutkittavia näytteitä (esim. elintarvikevärejä tai DNA:ta) geelin kuoppiin pipetillä. Jos käytät automaattipipettiä, käytä pipetissä AINA kärkeä. Älä käännä pipettiä koskaan kyljelleen tai ylösalaisin, jos kärjessä on nestettä! Sopiva määrä on esim. 10 µl. o Kaada puskuria ajoastiaan varovasti niin, että geeli juuri ja juuri peittyy puskuriliuokseen. o Kytke ajoastia virtalähteeseen. Kytke näytteiden puoleinen pää miinusnapaan ja näytteistä katsottuna kauempi pää plusnapaan. o Jos sähkökenttä muodostuu, puskurissa alkaa muodostua kuplia. o Jos paristot kuumentuvat niin kuumiksi, että niitä ei voi koskettaa, lopeta ajo. Anna paristojen jäähtyä ja käytä pienempää jännitettä. o (9 V paristoja käyttäen) 45 V jännitteellä näytteet ovat erottuneet riittävästi noin puolessa tunnissa. Geelin ajaminen 27 V jännitteellä ja ajon lopputulos puolen tunnin jälkeen.

9 Pohdittavaa työn jälkeen o Miksi eri molekyylit kulkevat geelielektroforeesissa eri nopeudella? o Miten RNA käyttäytyisi samanlaisessa geelielektroforeesissa? o Miksi puskuri alkaa kuplia, kun se kytketään virtalähteeseen? Mitä elektrodeilla muodostuu? o Mitä alumiinifoliolle tapahtuu ajon aikana ja minkä vuoksi? o Miksi kaikki väriaineet eivät kulkeudu geelillä? o Miksi paristot kuumenevat ajon aikana? o Tutki kaupallista geelielektroforeesilaitteistoa. Löydätkö siitä samat osat kuin valmistamastasi laitteistosta?