Ekologiset ympäristöongelmat. 10. Geeniteknologia. BI5 II Geeniteknologia 4. Geenitekniikan perusmenetelmiä

Transkriptio

1 Ekologiset ympäristöongelmat 10. Geeniteknologia

2 Dna:n ja rna:n käsittely Eristäminen Puhdistaminen Lähetti-rna:t voidaan muuntaa niiden emäsjärjestystä vastaavaksi ns. komplementaariseksi dna:ksi (c-dna)

3 Dna:n muokkaaminen Katkaisuentsyymit Bakteerien luontainen puolustuskeino Pilkkovat dna:n halutusta kohdasta Liittäjäentsyymit Liittää katkaistut juosteet yhteen Yhdistää myös eri alkuperää olevaa dna:ta

4 Dna:n ja rna:n tutkimusmenetelmiä PCR = dnan monistaminen Alukkeet, nukleotideja, dna-polymeraasia Hyödynnetään mm. dna:n emäsjärjestyksen selvittämisessä eli sekvensoinnissa ja yksilöiden tunnistuksessa

5 Dna:n ja rna:n tutkimusmenetelmiä Elektroforeesi Käytetään erimittaisten dna- ja rna-palasten havaitsemiseen Geenin dna:n erojen tutkiminen Sekvensoinnin väline Dna:n hybridisaatio Dna:n juosteiden irrottaminen toisistaan kuumentamalla Koetin: Merkitään leimaamalla fluoresoivalla väriaineella tai radioaktiivisella merkillä Koetin ja tutkittava kohde pariutuvat keskenään

6

7

8

9

10 Dna:n ja rna:n tutkimusmenetelmiä Sekvensointi Dna:n emäsjärjestyksen selvittäminen PCR, mukana värileimattuja nukleotideja, jotka päättävät reaktion Dna-pätkät erotellaan pituusjärjestykseen elektroforeesissa

11

12 Geenien toiminnan tutkiminen Dna-siru lasista tai muovista valmistettu pieni levy, johon on kiinnitetty DNA-palasia Voidaan tutkia ympäristötekijöiden, ravintoaineiden tai lääkehoitojen vaikutusta geenien toimintaan Voidaan havaita yksilöiden välisiä eroja dna:n emäsjärjestyksessä

13 DNA-siru: käytännön sovellutukset Mitkä geenit ilmenevät tietyissä soluissa tai kudoksessa? Diagnostiikka: Hyvänlaatuinen vs pahanlaatuinen syöpä Terve vs sairas Lääkkeiden tai hoitojen vaikutus Ei hoidettu vs hoidettu Lääkevaste vs ei vastetta Perustutkimus Kehitysbiologia esim. alkion kehitys, kudoksen tai solujen erilaistuminen

14 Mikrosirut Yleistä Mitä mikrosirut ovat? Alusta (muovi, pii, kvartsi, lasi tms), johon kiinnitetty tutkittavaksi ja tunnistettavaksi jopa satoja tuhansia tai miljoonia DNA-paloja (tai esim. proteiineja, soluja, kudosta, vasta-aineita, sirna:ta).

15 cdna sirut Sirujen design ja valmistus cdna klooni kirjasto Kloonien monistus ja puhdistus Koettimien spottaus alustaan Valmis cdna siru -koettimet >200 nt Custom Agilent

16 CLID NAME N15 N6dd* N7(2) N13 N10 N9 S 36 N 100 N2(A) N11 N3 N5cc N1aa N4bb N12 IMAGE: STXBP6 syn IMAGE:49227 STXBP6 syn IMAGE: STXBP6 syntaxin binding protein 6 (am IMAGE:51783 FLJ22283 h IMAGE: PCOLCE2 p IMAGE: Homo sapie IMAGE: A2LP ataxin IMAGE: Homo sapie IMAGE: ESTs Hs IMAGE: KIAA0471 K IMAGE: LOC IMAGE: ESTs Hs IMAGE: ESTs, Weak IMAGE: PNUTL1 pea IMAGE: Homo sapie IMAGE: NLK nemo-like kinase IMAGE: CRELD1 cys IMAGE: DECR2 2, IMAGE: Homo sapie IMAGE: LOC IMAGE: NME3 non IMAGE: EGR1 early IMAGE: DCT **dop IMAGE: TBC1D4 TB IMAGE:68818 PP3856 sim IMAGE: ITPR3 inosi IMAGE: NSD1 nucle IMAGE: RABL4 RAB IMAGE: AI IMAGE:34966 ESTs Hs IMAGE:51015 Homo sapie IMAGE:33028 LOC IMAGE: LPXN leupa IMAGE: AI IMAGE: **ESTs H *mitoch. cont. IMAG *mitoch. co *mitoch. cont. IMAG *mitoch. co *mitoch. cont. IMAG *mitoch. co IMAGE: ESTs Hs *mitoch. cont. IMAG *mitoch. cont *mitoch. cont. IMAG *mitoch. co *mitoch. cont. IMAG *mitoch. co IMAGE: EST Hs IMAGE: ERK8 extra IMAGE: FLJ12428 h IMAGE: NPY1R neu IMAGE: GFRA1 GDN IMAGE: Homo sapie IMAGE: TRPS1 trich IMAGE: TRPS1 trich IMAGE: FLJ22269 h IMAGE: IF **I factor (complement) Hs IMAGE: HT021 HT IMAGE: ESTs, Weak IMAGE: TMEPAI tra IMAGE: TMEPAI tra IMAGE: TMEPAI tra IMAGE: FLJ21144 h IMAGE: LOC IMAGE:35807 R IMAGE: KCNS3 pota IMAGE: PPARGC1 p IMAGE: ESTs, Weakly similar to PRO0478 prote IMAGE: C14orf58 chromosome IMAGE: REC8 Rec8p IMAGE: DDX17 DEA IMAGE: ACINUS ap IMAGE: KIAA1273 K IMAGE: TRN2 karyo IMAGE: FLJ14525 h IMAGE: WDR22 WD IMAGE: WDR22 WD WDR22 WD IMAGE: HIST1H2AM IMAGE: HIST1H2AC IMAGE: HIST2H2AA IMAGE: LOC IMAGE: SEPT3 sept IMAGE: ESTs, Weak IMAGE: Homo sapie IMAGE: Homo sapie IMAGE: ESTs Hs IMAGE: SMARCA2 S IMAGE: MLL3 myelo IMAGE: CYP19 cyto IMAGE: ESTs Hs IMAGE: ESTs, Weak IMAGE: FLJ20591 e IMAGE:32146 ESTs Hs IMAGE:24918 PIP5K1B ph IMAGE: GLUL gluta IMAGE: RANBP2L cdna sirut Geeniekspressio analyysi Experimental procedure Patient A Patient B Gene 1: B > A Gene 2: B < A Gene 3: B = A Gene 4: absent Bioinformatics Cy5 Cy3

17

18 Geeninsiirto GMO = muuntogeeninen eliö Siirtogeeninen eliö: siirretty uuden ominaisuuden aiheuttava geeni Poistogeeninen eliö: eliöön siirretty geenirakenne, joka estää eliön oman geenin toiminnan

19 BI5 III Biotekniikan sovelluksia 6.Geeninsiirrolla tuotetaan uudenlaisia eliöitä

20 BI5 III Biotekniikan sovelluksia 6.Geeninsiirrolla tuotetaan uudenlaisia eliöitä

21 BI5 III Biotekniikan sovelluksia 6.Geeninsiirrolla tuotetaan uudenlaisia eliöitä

22 Eläinkokeet Eläinkokeiden tekemiseen vaaditaan aina lupa, jonka myöntää valtakunnallinen eläinkoelautakunta (ELLA) 3R-periaate: Korvaaminen (Replacement): Jos eläinkokeelle on olemassa luotettava vaihtoehto, sitä on käytettävä eläinkokeen sijasta. Vähentäminen (Reduction): Eläinkokeissa tulee käyttää niin vähän eläimiä kuin mahdollista. Parantaminen (Refinement): Eläimille aiheutuva kärsimys ja muut haitat on pidettävä mahdollisimman pienenä. Eläinkokeissa käytetään usein mallieliöitä, joiden toiminta tunnetaan muita eliöitä tarkemmin. Mallieliöitä käyttämällä voidaan tehdä johtopäätöksiä myös eliölle läheistä sukua olevista lajeista. (esim. hiiri ihminen) BI5 III Biotekniikan sovelluksia 6.Geeninsiirrolla tuotetaan uudenlaisia eliöitä

23 Geenin kloonaus = geenin eristäminen, liittäminen vektoriin ja lisääminen kasvatussolussa Vektori on dna:n tai geenin siirtotyökalu esim. bakteerin tai hiivan plasmidi BI5 III Biotekniikan sovelluksia 6.Geeninsiirrolla tuotetaan uudenlaisia eliöitä

24 Dna- ja geenikirjastot Dna-kirjasto = dna-jaksojen kokoelma Genominen kirjasto: sisältää dna-jaksot, jotka on liitetty vektoreihin. Vektorit on siirretty isäntäsoluihin. C-dna eli geenikirjasto: lähetti-rna:t, jotka muutettu c-dna:ksi ja tallennettu vektoreihin.

25 Geeninsiirtomenetelmiä Transformaatio Plasmidien siirto bakteerisoluun Bakteerit ottavat itse sisäänsä vapaan dna:n liuoksesta Geeninsiirto kasvisoluun Agrobakteerin Ti-plasmidin avulla Geenipyssy Yksisirkkaiset kasvit Sähköimpulssit Kemiallinen käsittely

26 Geeninsiirtomenetelmiä Geenin siirto eläinsoluun Mikroinjektio Siirtogeenin tai vektorissa (usein virusvektori) olevan dna:n ruiskutus munasoluun Siirto alkion kantasolujen viljelmään

27 Käytännön sovelluksia

28 Siirtogeeniset valkuaisainetehtaat Valkuaisaineiden tuotto muuntogeenisissä eläimissä ja kasveissa Kasveilla valkuaisaineentuotanto kaikissa solukoissa Eläimillä juuri tietyssä kudoksessa

29 Siirtogeeniset valkuaisainetehtaat

30 Kloonaus Klooni on saman perimän omaavien eliöiden tai solujen joukko luonnollinen tapa: identtiset kaksoset tai perunan mukulat osittain keinotekoinen tapa: alkioiden halkaisu tai solukkoviljely keinotekoinen tapa: tumansiirto, haploidiajalostus tehdään arvokkaiden yksilöiden lisäämiseksi ja yhtenäisen tuotannon saavuttamiseksi

31 Terapeuttinen kloonaus = alkiosta otetaan soluja kasvatetaan kantasoluja kudoksia Reproduktiivinen kloonaus = tumansiirto, sijaiskohtu