Tenttipäivät. Tentti TI :30-17:30 1. uusinta MA :30-17:30 2. uusinta MA :30-17:30

Transkriptio

1 Tenttipäivät Tentti TI :30-17:30 1. uusinta MA :30-17:30 2. uusinta MA :30-17:30 Jos on joku iso päällekkäisyys (= tutkinnon pakollisen kurssin pakollinen läsnäolo, esimerkiksi labrakerta), nyt on aika sanoa Heikkisen Jari ehtii vielä katella uuden päivän. MUISTAKAA ILMOITTAUTUA TENTTEIHIN!

2 Palaute Palaute sähköisen palautejärjestelmän kautta: - käykää antamassa palautetta jo nyt! Valmiustaitojen ja labrakurssin jälkeen tai aikana palautetta voi käydä päivittämässä ja muuttamassa Palaute sulkeutuu kolme viikkoa viimeisen opetuskerran jälkeen (ts. kolme viikkoa toukokuun labrakurssin päättymisestä). Aion antaa jo palautetta eteenpäin luentoosuuden ja etenkin jälkimmäisen labrakurssin pitkästä välistä ei ole minusta tarkoituksenmukaista ja toivottavasti saadaan jatkossa jollain tapaa muutettua. 2

3 Kuinka kaikki liittyy yhteen? Kurssilla on käyty läpi iso kattaus biokemistin käyttämiä laboratorion perustaitoja. Käytännössä ne oppii varmastikin kunnolla vasta kun niitä pääsee käytännössä kokeilemaan laboratoriokurssilla. Tämän kurssin kontekstissa minusta on tärkeintä, että päähän jää ennenkaikkea käsitys siitä, mikä on eri menetelmien teoreettinen tausta. Miksi DNA voidaan erotella agaroosigeelillä? Miten geelisuodatus toimii? Agaroosigeelin tekemisen ja geelisuodatuksen käytännössä pääsee sitten opettelemaan kurssisalissa tärkeää olisi tietää ennen sinne astumista mitä menetelmässä oikein teoriassa tapahtuu ja miksi? 3

4 Kaikki alkaa tutkimuskysymyksestä Haluan tutkia Minun SuosikkiProteiinini toimintaa. Miten lähden etenemään? Jotta voisin tutkia proteiinia, minun pitää puhdistaa sitä kromatografiset menetelmät. Jotta pääsen puhdistamaan, minun pitää saada sitä jostain tuotto rekombinanttina bakteerissa (tai eristys kudoksesta). Jotta pystyn tuottamaan, tarvitsen proteiinia koodaavan plasmidin molekyylibiologia, restriktioentsyymien käyttö plasmidin tekemiseksi. Jotta voin tehdä plasmidin, tarvitsen MSP:ni tuottavan geenin geenin kopiointi PCR:llä. Jotta voin tehdä PCR:n, tarvitsen templaatin genomisen DNA:n tai cdna:n eristys organismista, jossa MSP on. 4

5 SDS- PAGE Genomisen DNA:n tai cdna:n eristys MSP:ia koodaavan geenin kopiointi PCR:llä MSP:ia tuottavan geenin kloonaus plasmidivektoriin (yhdistelmä- DNA:n luonti) Rekombinanttiproteiinin (MSP- 6xHIS) tuotto bakteerisoluissa, lysaatin valmistus Proteiinin puhdistus affiniteettikromatografialla (IMAC) Sentrifugointi Agaroosigeeli Agaroosigeeli Sentrifugointi Sentrifugointi Puskuriliuosten ja muiden liuosten valmistus Proteiinin puhdistus geelisuodatuksella Spektrofotometria Spektrofotometria Spektrofotometria Spektrofotometria Spektrofotometria Sentrifugointi Spektrofotometria SDS- PAGE Dokumentointi! 5

6 Puskurien valmistuksesta (Tehtävä 1) Puskuriliuokset voidaan jakaa kahteen ryhmään: Klassiset (perinteiset) puskurit: esim. fosfaatti-, karbonaatti-, sitraatti ja asetaattipuskurit. Valmistetaan sekoittamalla heikkoa happo- ja heikkoa emäsliuosta halutussa konsentraatiossa, kunnes ph on oikea. Synteettiset puskurit (Goodin puskurit): esim. TRIS, MES, HEPES, PIPES. Valmistetaan säätämällä liuotetun puskurin ph oikeaksi (HCl, NaOH).

7 2 Synteettiset puskuriliuokset Synteettiset puskurit yleensä suoraviivaisempia valmistaa: Lasketaan puskurin komponenttien (puskurimolekyyli, muut) loppukonsentraatioiden ja lopputilavuuden avulla punnittavat määrät tai mitattavat tilavuudet (jos käytetään esim. kantaliuoksia). Liuotetaan komponentit selvästi alle lopputilavuuteen (esim. 80% V), säädetään ph, täytetään lopputilavuuteen (tarkistetaan vielä ph). Esim: 1000 ml 100 mm Tris-Cl, ph 8,0, 150 mm NaCl, 5 % glyseroli (87 % kantaliuoksesta): liuotetaan 800 ml:aan H 2 O 12,1 g Tris, 8,77 g NaCl, 57,5 ml glyserolia; säädetään ph HCl:llä 8,0:aan; tasataan tilavuus 1000 ml:aan; tarkastetaan vielä kerran ph.

8 3 Klassiset puskuriliuokset Esimerkkinä fosfaattipuskuri: valmistetaan sekoittamalla heikkoa emästä (Na 2 HPO 4 ) ja heikkoa happoa (NaH 2 PO 4 ). Jos puskuriin lisätään muita komponentteja, ne kannattaa lisätä valmiiksi heikon hapon ja heikon emäksen liuoksiin! Oikean ph:n löytäminen helpottuu ei tarvetta saada liuosta juuri tiettyyn tilavuuteen. Jos liuottaa kaikki komponentit yhdessä, pitää olla todella tarkkana ph:n säädön ja tilavuuden kanssa: ph:n oltava haluttu juuri oikeassa tilavuudessa, muuten komponenttien konsentraatiot väärät! Joskus voidaan käyttää ph:n säätöön OIKEITA vahvaa happoa ja emästä (fosfaattipuskuri: fosforihappo H 3 PO 4 ja NaOH).

9 Vielä klassisista puskureista Vaikka olisi valmis ohje taulukosta juuri halutun puskurin valmistukseen tarkista ja hienosäädä aina ph-mittarilla. Laskentatavat ja reagenssit erilaisia. Hyvin yleistä on että labrassa valmistetaan esimerkiksi halutun ph:n fosfaattipuskuria (steriilinä) kantaliuoksena (1 10 M). Tästä kantaliuoksesta on nopea valmistaa käyttöön puskuria (muista aina ph:n tarkistus lopussa)! 4

10 Tehtävä 1 Valmistetaan 50 mm Na 2 HPO 4 tai NaH 2 PO 4, 150 mm NaCl liuokset. Riittävän määrän arviointiin voi käyttää taulukoita (NaH 2 PO 4 tarvitaan vähemmän). Sekoitetaan näitä magneettisekoittajan ja ph-mittarin avulla kunnes on saatu noin litra 50 mm fosfaattipuskuria jossa 150 mm NaCl. Sterilointi unohtui suurimmalta osalta! Steriili työtapa ei riitä, eikä ole edes tarpeen puskuria valmistettaessa. Sterilointiin todennäköisin tapa autoklavointi: siirretään puskuri autoklavoinnin kestävään pulloon (pyrex) ja autoklavoidaan. Jos puskurin joku komponentti ei kestä autoklavointia: suodatus 0,22 µm steriilin filtterin läpi. 5

11 Tehtävä 2 Restriktioentsyymien perusajatus lähes kaikille selvä. Tarkemmin molekyylibiologian kurssilla. Reaktion kokoamisesta: hyvin usein käytetään digestiossa enemmän kuin 1 U entsyymiä / 1 µg DNA:ta. Varmistaa digestion tapahtumisen kaikille plasmideille halutussa ajassa. Jotkin restriktioentsyymit huonoja leikkaamaan superkiertynyttä DNA:ta (= plasmideja) tarvitaan enemmän entsyymiä. 10 U / 1 µg DNA:ta 1 µg leikkaamiseen 10 U entsyymiä, koska entsyymin konsentraatio 20 U/µl 0,5 µl entsyymiä. 6

12 Tehtävä 3 (olennaisin osin) Kohta 1: antibiootti kasvatusliuoksessa varmistaa, että kaikki monistuvat bakteerit kantavat haluttua plasmidia, jossa on markerina ko. antibioottia vastaan resistenssin antava geeni. Kohta 4: alkaline lysis solution I ei vielä sisällä kuin glukoosia, Trisiä ja (ph 8,0) ja EDTA:ta. Solut eivät vielä hajoa! Vaiheessa tärkeintä hajottaa bakteeripelletti tasaisesti seuraavaan vaihetta varten. EDTA kelatoi metalliioneja, joita solujen hajotessa vapautuvat DNAasit vaativat toimiakseen. Kohta 5: alkaline lysis solution II sisältää NaOH:a ja SDS:a emäksiset olosuhteet, soluseinien hajotus, DNA:n ja proteiinien denaturointi. 7

13 Tehtävä 3 Kohta 6: Alkaline lysis solution III sisältää natriumasetaattia ja asetaattia, jotka neutraloivat liuoksen nopeasti. Pienikokoinen plasmidi-dna ehtii renaturoitua, mutta suurikokoinen kromosomaalinen DNA saostuu. 8

14 Välitehtävä 3 vastaukset

15 Tehtävä 1 Ihmisen lysiinihydroksylaasi 3 entsyymi (LH3) Suunnittele ja perustele, miten miten puhdistaisit tätä proteiinia ioninvaihtokromatografialla. Koska halutaan käyttää ioninvaihtokromatografiaa, pitää päättää käytetäänkö anionin vai kationinvaihtajaa stationäärifaasina. Tiedämme proteiinista että: Sen isoelektrinen piste (pi) on 5,69. Jos ioninvaihtokromatografian ph > pi, proteiini on varautunut negatiivisesti sitoutuu anioninvaihtajaan. Jos ioninvaihtokromatografian ph < pi, proteiini on varautunut positiivisesti sitoutuu kationinvaihtajaan. Se on aktiivinen ph 7,8:ssa. Yleensä proteiinin haluaa puhdistaa aktiivisessa (= stabiilissa) muodossan valitaan stationäärifaasiksi anioninvaihtaja ja ph:ksi 7,8. Kationinvaihto mahdollinen vaatii lisätyötä.

16 Ihmisen lysiinihydroksylaasi 3 entsyymi (LH3) Suunnittele ja perustele, miten miten puhdistaisit tätä proteiinia ioninvaihtokromatografialla. Kolme eri vaihetta joissa eri puskuriolosuhteet näytteen sidonta pylvääseen; pesu; eluointi. Mitä pitää harkita valittaessa puskuriliuosta proteiinin sitomiseen pylvääseen: Puskurimolekyyleillä positiivinen varaus eivät tartu anioninvaihtajaan proteiiniin sijasta. Esimerkiksi Tris ihan hyvä valinta. Ei liian korkea ionivahvuus esim mm NaCl riittää. Pesupuskurin kohdalla voidaan nostaa ionivahvuutta ( mm NaCl), mikä auttaa irrottamaan heikosti tarttuneet molekyylit pylväästä. Seurataan puhdistumista absorbanssin (A280) kautta. 3

17 Ihmisen lysiinihydroksylaasi 3 entsyymi (LH3) Suunnittele ja perustele, miten miten puhdistaisit tätä proteiinia ioninvaihtokromatografialla. Eluointipuskurissa suolan määrää lisätään selvästi (500+ mm). Cl - -ionit syrjäyttävät anioninvaihtajassa kiinni olevat proteiinit. Voidaan myös muuttaa eluointipuskurin ph:ta, tässä pitää kuitenkin muistaa mahdollinen vaikutus proteiinin stabiiliuteen. Eluointi voidaan tehdä yhtenä vaiheena, nostaa ionikonsentraatiota useampana vaiheena (esim. 200 mm 400 mm 600 mm), tai tasaisena gradienttina. 4

18 Miten selität, jos proteiini ei kuitenkaan sitoudu käyttämissäsi olosuhteissa valitsemaasi ioninvaihtajaan? Todennäköisin syy: isoelektrinen piste ei kerro koko totuutta laskostuneen proteiinin varautumisesta todellinen varaus on eri. pi on laskennallinen arvo, joka määritetään proteiinin aminohapposekvenssin perusteella. Laskostuneessa proteiinissa varautuneet aminohapot voivat esimerkiksi olla proteiinin sisäpinnalla, eivätkä ulkopinnalla jossa varaukset olisivat anioninvaihtajan saavutettavissa. Myös kannattaa tarkastella puskuriliuosten koostumusta. Onko liikaa suolaa, joka häiritsisi sitoutumista? 5

19 Adiponenctin concentration (ng/ml) Tehtävä 2 Adiponektiini on seerumin proteiini, joka esiintyy kolmena erilaisena oligomeerinä Näiden oligomeerien koot ovat 75 kda, 150 kda ja >300 kda Merkitse kuvaan, mikä eluutiopiikki kromatogrammissa vastaa mitäkin oligomeeria. >300 kda 150 kda 75 kda Melko yksiselitteinen tehtävä. Geelisuodatuksesssa suuremmat molekyylit kulkevat kromatografiapylvään läpi nopeammin kuin pienet, eli niiden eluutiotilavuus on pienempi. Erot perustuvat siihen, miten pienemmät molekyyli pääsevät kulkeutumaan matriksin muodostavien molekyylien sisällä (osittain tai kokonaan), mikä hidastaa niiden kulkeutumista elution volume (ml)

20 Tehtävä 3 Miksi tuottoon tarvitaan ekspressiovektori? Miksi puskurien sisällössä on merkintä Tris-Cl ja mitä se tarkoittaa? Voidaan löytää kaksi syytä: Ekspressiovektorin avulla saadaan aikaa rekombinanttiproteiini, jossa haluttuun proteiiniin yhdistyy histidiinihäntä (6xHis). Tämä mahdollistaa puhdistamisen. Laajemmin ajatellen: ekspressiovektorit on nimenomaisesti tehty proteiinin tuottoon normiplasmidissa se ei välttämättä onnistu. Puskurimolekyylinä on Tris, ja ph on säädetty HCl:n avulla (koska vesiympäristössä H + :ia riittää, ne eivät niinkään kiinnosta, siinä missä Cl-ioneilla voi olla merkitystä). 7

21 Millä eri tavoilla solujäämät voidaan erottaa liuonneesta proteiinista ennen affiniteettikromatografiaa? Rekombinanttiproteiini voidaan sitoa matriksiin pylvääseen ns. batch-puhdistuksena, jolloin lysaatti ja matriksi sekoitetaan ja niiden annetaan sekoittua esimerkiksi tunnin ajan. Mikä on tämän menetelmän etu suoran pakattuun pylvääseen lataamisen sijaan? Sentrifugointi on tyypillisin ja myös paras tapa. Voidaan harkita myös suodattamista, jos sentrifugoinnin jälkeenkin lysaatti on kovin likainen. Liian vähän siistityn näytteen ajaminen pylvääseen meinaa helposti todella hidasta ajoa ja huonolla tuurilla pylvään tukkeutumista. Näytteen proteiinit saavat batchpuhdistuksessa pidemmän ajan vuorovaikuttaa matriksin kanssa (kuin jos ne ajettaisiin pylvääseen painovoimalla tai pumpulla). Tämä voi olla tarpeen etenkin jos tuotetun proteiinin määrä on hyvin pieni. 8

22 Miksi pesuvaihe suoritetaan? Mitä siinä tapahtuu ja mikä on siinä vaikuttava aine? Pesuvaiheen puskuri on muuten samanlainen kuin lyysauksessa ja sitomisessa käytetty puskuri, paitsi että siinä on 25 mm imidatsolia. Pieni määrä imidatsolia auttaa irrottamaan pylväästä heikosti sitoutuneita molekyylejä, mutta ei vielä irrota histidiini-hännän kautta sitoutunutta rekombinanttiproteiinia. 9

23 Mainitse ainakin kaksi tapaa, joilla proteiini voidaan irrottaa (eluoida) affiniteettimatriksista. Kerro myös, miksi proteiini näillä tavoilla irtoaa. Korkea imidatsoli-konsentraatio (esim. 250 mm): imidatsoli syrjäyttää histidiinihännän affiniteettimatriksista. ph:n lasku alas (4,5 5,3): histidiiniaminohappojen sivuketjut protonoituvat, eivätkä enää kykene sitoutumaan Ni-NTAmatriksin nikkeliin. Mutta proteiini ei välttämättä pysy stabiilina käytetään denaturoivassa puhdistuksessa, jolloin pitää huolehtia proteiinin laskostamisesta uudelleen. Lisätään eluointipuskuriin kelatoivaa molekyyliä kuten EDTA, joka irrottaa nikkelit Ni-NTA matriksista. Jos halutaan käyttää matriksia uudelleen, se pitää regeneroida nikkelillä. 10

24 Vapaaehtoiset laskutehtävät

25 Koetta varten sinun täytyy valmistaa 500 ml seuraavaa puskuriliuosta: 50 mm MES, ph 6,0, 200 mm NaCl, 10 mm imidatsoli, 5% glyseroli. Käytössä on seuraavat reagenssit: MES (M = 195,2 g/mol) NaCl (M = 58,44 g/mol) imidatsoli (M = 68,077 g/mol) 87% glyseroli kantaliuos Kuinka valmistat liuoksen? Lasketaan kuinka paljon eri osakomponentteja tarvitaan 500 ml:aan puskuria, liuotetaan ne selvästi alle tarvittavaan tilavuuteen (esim. 400 ml), säädetään ph (NaOH ja HCl), täytetään 500 ml:aan ja tarkistetaan lopuksi vielä ph. n = m M, c = n ; m = nm = cvm V 50 mm MES: m = cvm = 0, 05 mol l = 4, 88 g 200 mm NaCl: m = cvm = 0, 2 mol l = 5, 844 g 5, 84 g 0, 5 l 195, 2 g mol 0, 5 l 58, 44 g mol 2

26 Koetta varten sinun täytyy valmistaa 500 ml seuraavaa puskuriliuosta: 50 mm MES, ph 6,0, 200 mm NaCl, 10 mm imidatsoli, 5% glyseroli. Käytössä on seuraavat reagenssit: MES (M = 195,2 g/mol) NaCl (M = 58,44 g/mol) imidatsoli (M = 68,077 g/mol) 87% glyseroli kantaliuos Kuinka valmistat liuoksen? 10 mm imidatsoli m = cvm = 0, 01 mol 0, 5 l 68, 077 g l mol = 0, g 0, 340 g 5 % glyseroli c kanta V kanta = c pusk V pusk c(pusk) V(pusk) V kanta = c(kanta) 5 % 500 ml = = 5 % 500 ml = 28, 734 ml 87 % 87 % 28, 7 ml Punnitaan dekkaan reagenssivaa alla 4,88 g MES, 5,84 g NaCl ja analyysivaa alla 0,340 g imidatsolia. Pipetoidaan dekkaan 28,7 ml glyserolin kantaliuosta. Liuotetaan magneettisekoittajalla H 2 O niin että tilavuus on noin 400 ml. Säädetään ph. Täytetään tilavuus 500 ml:aan ja tarkistetaan ph. 3

27 Proteiinin geelisuodatusta varten +4 C:ssa olet valmistamassa seuraavaa puskuriliuosta noin 1000 ml: 50 mm fosfaattipuskuri, ph 7.2, 150 mm NaCl, 500 mm urea, 0,1% SDS. Käytössäsi on seuraavat reagenssit: 1 M Na 2 HPO 4 kantaliuos 1 M NaH 2 PO 4 kantaliuos NaCl (M = 58,44 g/mol) urea (M = 60,06 g/mol) 10 % SDS kantaliuos Kuinka valmistat liuoksen? Valmistetaan heikko happo- ja heikko emäsliuos, joissa molemmissa 150 mm NaCl, 500 mm urea, 0,1 % SDS. Taulukosta nähdään, että Na 2 HPO 4 tarvitaan todennäköisesti enemmän, tehdään sitä 1000 ml ja NaH 2 PO ml. 50 mm Na 2 HPO 4, 1000 ml c kant V kant = c pusk V pusk c(pusk) V(pusk) = V kant = c(kant) = 0, 05 mol l 1000 ml 1 mol l = 50 ml 4

28 Proteiinin geelisuodatusta varten +4 C:ssa olet valmistamassa seuraavaa puskuriliuosta noin 1000 ml: 50 mm fosfaattipuskuri, ph 7.2, 150 mm NaCl, 500 mm urea, 0,1% SDS. Käytössäsi on seuraavat reagenssit: 1 M Na 2 HPO 4 kantaliuos 1 M NaH 2 PO 4 kantaliuos NaCl (M = 58,44 g/mol) urea (M = 60,06 g/mol) 10 % SDS kantaliuos Kuinka valmistat liuoksen? 50 mm NaH 2 PO 4, 500 ml: V kant = c(pusk) V pusk c(kant) mol 0, 05 = l 1 mol 500 ml = 25 ml l 150 mm NaCl, 1000 ml: m = cvm = 0, 150 mol l = 8, 766 g 8, 77 g 150 mm NaCl, 500 ml: 1 l 58, 44 g mol 0, 5 8, 766 g = 4, 383 4, 38 g 5

29 Proteiinin geelisuodatusta varten +4 C:ssa olet valmistamassa seuraavaa puskuriliuosta noin 1000 ml: 50 mm fosfaattipuskuri, ph 7.2, 150 mm NaCl, 500 mm urea, 0,1% SDS. Käytössäsi on seuraavat reagenssit: 1 M Na 2 HPO 4 kantaliuos 1 M NaH 2 PO 4 kantaliuos NaCl (M = 58,44 g/mol) urea (M = 60,06 g/mol) 10 % SDS kantaliuos Kuinka valmistat liuoksen? 500 mm urea, 1000 ml: m = cvm = 0, 5 mol l = 30, 03 g 30, 0 g Ja toiseen puskuriin 15,0 g. 0,1 % SDS, 1000 ml: V kanta = 0, 1 % 10 % Toiseen puskuriin 5 ml. 1 l 60, 06 g mol 1000 ml = 10 ml 6

30 7 Proteiinin geelisuodatusta varten +4 C:ssa olet valmistamassa seuraavaa puskuriliuosta noin 1000 ml: 50 mm fosfaattipuskuri, ph 7.2, 150 mm NaCl, 500 mm urea, 0,1% SDS. Käytössäsi on seuraavat reagenssit: 1 M Na 2 HPO 4 kantaliuos 1 M NaH 2 PO 4 kantaliuos NaCl (M = 58,44 g/mol) urea (M = 60,06 g/mol) 10 % SDS kantaliuos Kuinka valmistat liuoksen? Valmistetaan 1000 ml Na 2 HPO 4 ja 500 ml NaH 2 PO 4 näillä tiedoilla, esim. eka: Mitataan dekkaan 50 ml 1 M kantaliuosta, reagenssivaa alla 8,77 g NaCl, 30,0 ml ureaa, ja 10 ml 10 % SDS. Liuotetaan magneettisekoittajalla hieman alle 1000 ml kokonaistilavuuteen, tasataan mittapullossa tarkaksi. Tärkeä huomio ohjeesta: puskuria ollaan käyttämässä +4 C:ssa. Aina syytä säätää ph siinä lämpötilassa, jossa ollaan puskuria käyttämässä (etenkin Tris!). Jäähdytetään molemmat (happo ja emäs) +4 :een. Yhdistetään magneettisekoittajan ja ph-mittarin avulla happoa ja emästä kunnes on saatu noin litra puskuria jonka ph 7,2. (Suodatetaan 0,1 µm filtterin läpi koska ollaan menossa geelisuodatukselle, mutta se on oma tarinansa )

31 Olet tekemässä PCR-reaktiota plasmidi-dna:sta. Saamaasi plasmidi-dna:n sisältävään eppariin ei ole merkitty muuta tietoa plasmidista kuin sen nimi ja päiväys, joten teet siitä ensiksi 1:200 laimennoksen ja mittaat siitä spektrofotometrillä A 260 -arvon 0,127 ja A 280 -arvon 0,071. PCR-reaktion lopputilavuus on 50 µl ja sen komponentit ja niiden loppukonsentraatiot ovat seuraavanlaiset Kuinka kokoat PCR-reaktion? Ensin voidaan sanoa jotain plasmidista: A 260 A 280 = 0, 127 0, 071 1, 79 Ainakin DNA näyttäisi puhtaalta. Koska tiedetään, että jos A = 1, c dsdna = 50 µg ml 0, 127 c plasmidi = 1 = 0, µg ml 50 µg ml = 6, 35 µg ml Pitää muistaa ottaa laimennos (1:200) huomioon! 200 6, 35 µg µg mg = 1270 = 1, 27 ml ml ml = 1, 27 µg/µl 8

32 komponentti reaktiossa pipetoidaan dh 2 O? 5x reaktiopuskuri 1x 10 µl 10 mm dntps 200 µm 1 µl 10 mm f-aluke 0,5 µm 2,5 µl 10 mm r-aluke 0,5 µm 2,5 µl templaatti-dna 10 ng? DNApolymeraasientsyymi (2 U/µl) 1 U? 50 µl total V Reaktiopuskuri: dntpt: Alukkeet: V = 1x 5x 50 µl = 10 µl 200 µm V stock = 50 µl 10 mm 200 µm = 50 µl = 1 µl µm V stock = 0, 5 µm 50 µl = 2, 5 nl 10 mm Ei ole ihmisen pipetoitavissa tehdään alukkeista 1:1000 laimennos (10 µm) jota voidaan pipetoida 2,5 µl. Alukestokit yleensä µm. 9

33 komponentti reaktiossa pipetoidaan dh 2 O? 5x reaktiopuskuri 1x 10 µl 10 mm dntps 200 µm 1 µl 10 mm f-aluke 0,5 µm 2,5 µl 10 mm r-aluke 0,5 µm 2,5 µl templaatti-dna 10 ng 0,8 DNApolymeraasientsyymi (2 U/µl) 1 U? 50 µl total V Templaatti-DNA:ta (plasmidia) tarvitaan reaktioon 10 ng, konsentraatio oli 1,27 µg/µl eli 1270 ng/µl. V = 10 ng 1270 ng µl 7, 87 nl Ei pipetoitavissa, tehdään 1:100 laimennosta (epparissa 99 µl dh 2 O + 1 µl plasmidia), jonka konsentraatio on 12,7 ng/µl. V = 10 ng 12, 7 ng µl = 0, 7874 µl 0, 8 µl Tässä tehdään aika iso pyöristys mutta PCR:n kannalta ei ole niin tarkkaa onko putkessa aivan tarkalleen 10 ng DNA:ta. Jos olisi, voitaisiin tehdä 1:1000 laimennos plasmidista jota ~7,9 µl. 10

34 komponentti reaktiossa pipetoidaan dh 2 O 32,7 µl 5x reaktiopuskuri 1x 10 µl 10 mm dntps 200 µm 1 µl 10 mm f-aluke 0,5 µm 2,5 µl 10 mm r-aluke 0,5 µm 2,5 µl templaatti-dna 10 ng 0,8 DNApolymeraasientsyymi (2 U/µl) 1 U 0,5 50 µl total V DNA-polymeraasi: V = 1 U 2 U µl = 0, 5 µl Loppu PCR-laatuista vettä (ddh 2 O tai vastaava): 50 µl 10 µl 1 µl 2, 5 µl 2, 5 µl 0, 8 µl 0, 5 µl = 32, 7 µl Lopullinen reaktio kootaan jäillä taulukon mukaisessa järjestyksessä. Polymeraasi reaktioputkeen viimeisenä ennen PCRlaitteeseen laittamista. Sekoitetaan pipetoimalla, spinnataan reaktioseos putken pohjalle. 11