Proteiinipuhdistus. Johdanto.

Koko: px

Aloita esitys sivulta:

Download "Proteiinipuhdistus. Johdanto. www.edu.fi/biogeeni"

Kaija Salminen
8 vuotta sitten
Katselukertoja:

1 Proteiinipuhdistus Johdanto Proteiinien jälkikäsittely on monimuotoinen, usein myös vaikeahko ja kalliskin laji. Haastetta hommassa riittääkin jos esimerkiksi E.Colin tuottamista tuhansista proteiineista pitäisi yksi ainoa saada eristettyä talteen tehokkaasti hyvällä saantoprosentilla. Lopullisten proteiinituotteiden laatuvaatimukset vaihtelevat, esimerkiksi diagnostiikkateollisuudessa puhdistustavoite on usein %, rokotteissa 99 % ja lääkkeissä 99,99 %. Tekniikoita ja vaihtoehtoja on monia ja materiaalia löytyy runsaasti esim. kromatografiamateriaalien valmistajilta (esim. Sigma-Aldrich, GE, Bio-Rad, Giagen). Kromatografialaitteistossa on yleensä pumppu, pylväs, detektori, piirturi ja fraktionkerääjä. Laboratoriossa aika ja raha rajoittavat usein toimintaa. Simulaatiolla voi testata näppärästi erilaisten vaihtoehtojen toimivuutta puhdistuksissa vaikka kotisohvalla. Eräs hyväksi todettu ja palkittu englanninkielinen proteiinipuhdistussimulaatio löytyy hakusanalla protlab. Tekniikat ja proteiinipuhdistus tulevat varmasti tutuiksi kun ratkaiset ohjelman tehtävät. Kuva 1 Proteiininpuhdistuksen päävaiheet ja tavoitteet. 1

Lopullisten proteiinituotteiden laatuvaatimukset vaihtelevat, esimerkiksi diagnostiikkateollisuudessa puhdistustavoite on usein 90-95 %, rokotteissa 99 % ja lääkkeissä 99,99 %.

2 Laboratoriotyö: Proteiinipuhdistus. Lämpökäsittely ja ioninvaihtokromatografia Tässä työssä perehdytään lämpökäsittelyyn ja ioninvaihtokromatografiaan ja lähtömateriaalina käytetään fermentointityössä tuotettuja E.coli-soluja. Jos käytettävissä ei ole ko. soluja niin muokkaa ohjeita käsiteltävälle materiaalille sopivaksi. Muista geneettisesti muokattujen organismien oikeat hävitystavat! Muista: 1. Ei etanolia ja suolaa samaan aikaan matriisiin. Suolakiteet pilaavat kalliin matriisin. Matriisia voi käyttää erittäin monta kertaa kun sitä kohdellaan oikein. 2. Tee letkuliitokset huolella ja vältä kaikin keinoin ilman pääseminen pylvääseen ja letkuihin. Ilma muuttaa kromatografiapylväsmatriisin rakennetta ja työn onnistumisprosentti on tämän jälkeen vaatimaton. Solujen hajottaminen Lämpökäsittely Näytteen lataus pylvääseen + pesu Eluointi Tulosten mittaus ja laskenta 1. Punnitse 10 g E.colissa tuotettua solumassaa 50 ml Falcon-putkeen. Tuote on nyt solunsisäinen egfp-proteiini. egfp:n ja samankaltaisen punaisen dsred proteiinin tietoja on taulukossa Lisää Falcon-putkeen puskuria A (20 mm Tris, ph 8) niin, että lopputilavuus on 40 ml. Homogenoi näyte voimakkaasti ravistelemalla. 3. Tee ultraäänilaitteeseen ohjelma, jossa on 10 sekunnin hajotus + 10 sekunnin lepoaika ja kokonaishajotusaika on 3 min. Kiristä ultraäänilaitteen kärki kiinni työkalulla ja viritä laite ko. kärjelle sopivaksi. Löysästi kiinnitetty kärki voi hajottaa laitteen ja virheellisillä asetuksilla ajo voi myös vaurioittaa laitetta. 4. Hajota solut ultraäänikäsittelyllä (sonikoimalla). Muista jäähdyttää näytettä hajotuksen aikana esim. jäähauteella, koska sonikoinnissa muodostuu paljon lämpöä. 5. Sentrifugoi g, 10 min. Muista tasapainottaa ajo. Siirrä supernatantti (= yläliuos = tuote) uuteen 50 ml Falcon-putkeen ja kirjaa tuotetilavuus muistiin (kuva 2). Pipetoi putkesta 0,5 ml näyte (näyte 1) ja varastoi se pakkaseen riittävillä merkinnöillä varustettuna. 6. Lämpökäsittele tuoteliuos (+70 C, 30 min, sekoita useaan kertaan lämmityksen aikana). 7. Sentrifugointi g, 10 min. Muista tasapainottaa ajo. Siirrä supernatantti uuteen 50 ml Falconputkeen ja kirjaa tuotetilavuus muistiin (kuva 2). Pipetoi putkesta 0,5 ml näyte (näyte 2) ja varastoi se pakkaseen riittävillä merkinnöillä varustettuna. 8. Tutustu kromatografialaitteistoon ja sen mahdolliseen ohjelmistoon huolella. Laitteiston toimivuus kannattaa kokeilla ennen varsinaista ajoa, koska monissa ajoissa käytetään suolaa ja kuivuneena tämä tukki tehokkaasti suodattimet, letkut ja detektorit, jos loppuhuuhtelut ovat olleet riittämättömät. Testauksen voi tehdä vaikka asentamalla kaikki ajossa tarvittavat osat, letkut, liittimet ja liuokset laitteistoon ilman kromatografiamatriksia. Aja työn aloituspuskuria ja varmista, että neste pääsee virtaamaan laitteessa eikä ilmaa tule mistään liuokseen. Tarvittaessa vaihda suodattimia, letkuja tai tiivistä liitoksia. 9. Tee tarvittava ohjelma laitteeseen tai aja käsiajolla. Usein ensimmäisissä ajoissa on helpompaa ajaa käsisäädöillä ainakin eluutiovaiheeseen asti (=kohdeproteiinin kerääminen). Kun tuote ajetaan 2

Jos käytettävissä ei ole ko. soluja niin muokkaa ohjeita käsiteltävälle materiaalille sopivaksi. Muista geneettisesti muokattujen organismien oikeat hävitystavat! Muista: 1.

3 pylväästä ulos lineaarisella gradientilla, niin tuohon tarvitaan useimmiten ohjelma. Toki tuotteen voi eluoida myös steppinä. 10. Valmista erotuspylväs (halkaisija noin 1 cm), anionimatriisista noin 10 cm (lisätietoja hakusanoilla: Q Sepharose fast flow, GE Healthcare) ja kiinnitä se laitteistoon. 11. Poista matriisin ja letkujen säilytyksessä käytetty 20-prosenttinen etanoliliuos ajamalla laitteiston läpi puskuria A (virtausnopeusmaksimi 3 ml/min) niin kauan että absorbanssi- ja sähkönjohtokykylukemat tasaantuvat. 12. Aja näyte pylvääseen (max. 2 ml/min). Vihreän kohdeproteiinin tulisi jäädä pylvääseen kiinni. Ongelmatapauksissa pysäytä ajo ja yritä selvittää ongelman aiheuttaja (puskurit, matriisi). 13. Aja tämän jälkeen puskuria A niin kauan, että absorbanssi- ja sähkönjohtokykylukemat tasaantuvat eli kunnes kaikki sitoutumaton materiaali on tullut ulos pylväästä. 14. Eluoi tuote pylväästä nousevalla suolagradientilla B puskurin (20 mm Tris, ph M NaCl) avulla esim. 20 minuutissa. Muista käynnistää fraktionkerääjä eluoinnin alussa. Aja lopuksi eluutioohjelman loppuasetuksilla pylväs tyhjäksi (absorbanssi palaa lähes perusviivalle). 15. Poista suolat järjestelmästä puskurin A avulla. Aja puskuria niin kauan, että absorbanssi- ja sähkönjohtokykylukemat tasaantuvat. 16. Aja järjestelmään 20 % etanoli säilytysliuokseksi. Irrota pylväs, siirrä matriisi säilytysastiaan ja siirrä matriisi kylmäsäilytykseen. 17. Analysoi valituista fraktioista proteiini- ja fluoresenssisignaalit. Yhdistä fraktiot lopuksi tulosten perusteella. Tee tuloksista puhdistustaulukko. Kuva 2 Ensimmäisessä kuvassa on denaturoituja proteiineja lämpökäsittelyn ja sentrifugoinnin jälkeen. Viereisessä kuvassa on saman vaiheen supernatantti. Kolmannessa kuvassa supernatantti on ajettu ioninvaihtopylvääseen ja viimeinen kuva on eluointivaiheesta. Taulukko 1 egfp ja dsred proteiinien ominaisuuksia. Proteiini Viritysaallonpituus (nm) Mittausalue (nm) Koko (kda) egfp noin 27 DsRed noin 27 3

Poista matriisin ja letkujen säilytyksessä käytetty 20-prosenttinen etanoliliuos ajamalla laitteiston läpi puskuria A (virtausnopeusmaksimi 3 ml/min) niin kauan että absorbanssi- ja

4 Tulosten käsittely Täytä seuraavalla sivulla oleva puhdistustaulukko mittaustulosten perusteella ja tee lopullisista tuloksista kuvaaja. Spesifinen fluoresenssiaktiivisuus lasketaan kokonaisaktiivisuus jaettuna kokonaisproteiinimäärällä. Saantoprosentti lasketaan kyseessä olevan kohdan kokonaisaktiivisuus jaettuna alkuperäisellä kokonaisaktiivisuudella. Rikastuskerroin lasketaan samalla tavalla kuin saantoprosentti, mutta spesifisellä fluoresenssiaktiivisuudella. Alla olevassa kuvassa 3 on erään puhdistustyön tuloskuvaaja. Kuva 3 Entsyymipuhdistuskuvaaja. 4

Saantoprosentti lasketaan kyseessä olevan kohdan kokonaisaktiivisuus jaettuna alkuperäisellä kokonaisaktiivisuudella.

5 Täytä oheista puhdistustaulukko töiden edetessä soveltuvin osin. Tee lopuksi tiedoista kuvaaja. Päivämäärä Proteiini Lähtömateriaali Solumassa (g) Entsyymiaktiivisuusmääritysmenetelmä Proteiinimääritys Solujen hajotus, sonikointiaika, aktiivinen hajotusaika (min), syklit s + lepo s Vaihe V (ml) Proteiinipitoisuus (mg/ml) Proteiinia yht. (mg) Fluoresenssi (RFU/100 µl) Kokonaisfluoresenssi (RFU) Spesifinen fluoresenssiaktiivisuus (RFU/mg) Saantoprosentti (%) Rikastuskerroin 5

hajotus, sonikointiaika, aktiivinen hajotusaika (min), syklit s + lepo s Vaihe V (ml) Proteiinipitoisuus (mg/ml)

Samankaltaiset tiedostot

α-amylaasi α-amylaasin eristäminen syljestä ja spesifisen aktiivisuuden määritys. Johdanto Tärkkelys Oligosakkaridit Maltoosi + glukoosi

α-amylaasi α-amylaasin eristäminen syljestä ja spesifisen aktiivisuuden määritys. Johdanto Tärkkelys Oligosakkaridit Maltoosi + glukoosi n eristäminen syljestä ja spesifisen aktiivisuuden määritys. Johdanto Työssä eristetään ja puhdistetaan merkittävä ja laajalti käytetty teollisuusentsyymi syljestä. pilkkoo tärkkelystä ensin oligosakkarideiksi