KROMATOGRAFIAN PERUSTEET

Transkriptio

1 KROMATOGRAFIAN PERUSTEET Outi Itkonen Sairaalakemisti, dos. HUSLAB O. Itkonen 1

2 KROMATOGRAFIA χρῶμα chroma väri" γράφειν graphein kirjoittaa alan uranuurtajat Archer John Porter Martin ja Richard Laurence Millington Synge luvulla kasviuutteiden erottaminen paperikromatografialla wikipedia.org 2

3 PERIAATE molekyylien erottaminen toisistaan partition perusteella, eli miten ne jakautuvat kahden eri faasin välillä jakautuminen on tasapainotila, dynaaminen prosessi waters.com 3

4 TERMISTÖÄ kromatografi laitteisto, jolla kromatografia tehdään kromatogrammi erotusprosessin graafinen esitys agilent.com knauer.net 4

5 TERMISTÖÄ kiinteä (stationääri) faasi liikkumaton faasi, joka on yleensä kiinnitetty johonkin toiseen materiaaliin, esim. levylle, putken sisäseinämään tai partikkeleihin liikkuva (mobiili) faasi neste tai kaasu, joka sisältää myös näytteen ja liikkuu haluttuun suuntaan eichrom.com galleryhip.com 5

6 TERMISTÖÄ Resoluutio kahden vierekkäisen piikin erottuminen Pohjaluku (N) kuvaa kolonnin (kromatografiasysteemin) erotuskykyä Shimadzu.com 6

7 TERMISTÖÄ Retentio - eluutio adsorptio desorptio -prosessi 1. tasapainotus 2. adsorptio 3. resorptio mukailtu:satu Mikkola

8 TASO- JA KOLONNIKROMATOGRAFIA O. Itkonen 8

9 TASOKROMATOGRAFIA Ohutlevykromatografia (TLC) lasi-, alumiini- tai muovilevy päällystetty kiinteällä faasilla kiinteänä faasina silika (SiO 2 ), aluminioksidi tai selluloosa Paperikromatografia kiinteänä faasina paperi Liikkuva faasi nestemäinen spectrumlabs.com 9

10 OHUTLEVYKROMATOGRAFIA Seoksen komponenttien erotus ja tunnistus Reaktion seuranta Puhdistusprosessin fraktioiden analyysi Puhdistetun yhdisteen puhtauden analyysi expertsmind.com 10

11 OHUTLEVYKROMATOGRAFIA Kiinteä faasi, esim. silika on erittäin polaarista dipoli-dipoli- ja H-sidoksia polaariset yhdisteet liikkuvat hitaasti Liikkuva faasi pooliton poolittomat yhdisteet liikkuvat nopeammin instructables.com 11

12 OHUTLEVYKROMATOGRAFIA Täplät visualisoidaan värjäämällä jodilla tai spesifillä värireagenssilla UV-valolla Retentiofaktori (R f ) = täplän kulkema matka / liuosrintaman kulkema matka lähtöpisteestä Syntyvän/vastasyntyneen lapsen keuhkojen kypsyys lapsivesinäytteestä/imulimasta 2- dimensionaalisella TLC:llä lipidlibrary.aocs.org 12

13 KOLONNIKROMATOGRAFIA Kiinteä faasi kolonnissa, jonka läpi liikkuva faasi kulkee Kaasukromatografia (GC) Nestekromatografia (LC) 13

14 KAASUKROMATOGRAFIA (GC) Myös kaasu-nestekromatografia (GLC) Yhdisteen puhtauden tutkiminen Seoksen komponenttien tunnistaminen sfu.ca 14

15 KAASUKROMATOGRAFIA Inertti kantajakaasu kuten He, N 2, H 2 paine, virtausnopeus Näyte termisesti stabiili haihtuva tai johdoksenmuodostus silylointi, alkylointi, asylointi sigmaaldrich.com 15

16 GC-KOLONNEISTA pakatut kolonnit terästä tai lasia 1,5-10 m pituus, 2-4 mm i.d. kapillaarikolonnit m pituus, 0,1-0,5 mm i.d. usein piioksidista valmistettuja ja polyimidillä päällystettyjä kiinteänä faasina viskooseja polymeerejä (polysiloksaaneja, polyfenolieettereitä jne.) dimetyylipolysiloksaani, trifluoropropyylimetyylipolysiloksaani, jne lukuisia muita kiinteitä faaseja labtraining.com thermofisher.com 16

17 KAASUKROMATOGRAFIA Detektori massaspektrometri (MS) liekki-ionisaatiodetektori (FID) termisen johtavuuden detektori (TCD) ECD, NPD, FPD, muu GCxGC Kliinisissä laboratorioissa alkoholi- ja glykolimyrkytyksen diagnostiikka virtsan orgaanisten happojen analytiikka lääke- ja huumausaineiden (varmistus)analytiikka sterolien analytiikka shimadzu.com 17

18 KAASUKROMATOGRAFIA Esim. virtsan orgaaniset hapot aineenvaihduntasairauksien diagnostiikassa Kamijo et al., Ped.Research 1997:42:

19 NESTEKROMATOGRAFIA LC, HPLC, UPLC/UHPLC/RR-HPLC kiinteä faasi (adsorbentti) kolonnissa, liikkuvana faasina (eluenttina) neste isokraattinen tai gradienttiajo intechopen.com 19

20 NESTEKROMATOGRAFIA yhdisteiden puhdistaminen, erottaminen, tunnistaminen ja pitoisuusmittaus 20

21 NESTEKROMATOGRAFIAN JAOTTELU nano-, kapillaari-, microbore/micro-, semimicro/narrowbore/microbore-, preparatiivinen LC HPLC: 5-25 cm, i.d. 2-4 mm, 3-5 µm ensimmäiset laitteistot 1970-luvulla max paine 400 bar UHPLC: i.d mm, sub-2-µm paine 1000 bar ens. laitteisto 2004 inertsil.eu analytical-sales.com preparativehplscsystem.com 21

22 KOLONNIN PARTIKKELIT partikkelit tavallisimmin silikaa tai polymeeriä kiinteäytimiset vs. huokoiset partikkelit monoliittikolonnit kiinteä faasi yksi yhtenäinen huokoinen kappale i28.tinypic.com 22

23 NP JA HILIC -KROMATOGRAFIA Normaalifaasi-LC (NP-LC) silika, dioli-, amino (NH 2 ) ja syano (CN) -faasit liikkuva faasi pooliton tai keskipoolinen HILIC-LC eli hydrofiilinen interaktiokromatografia epharmacist.com sepscience.com 23

24 RP-KROMATOGRAFIA Käänteisfaasi-LC (RP-LC) silikaan tai polymeeriin sidottuja poolittomia faaseja (C18, C8, C4), myös CN ja NH 2 liikkuva faasi on poolisempi kuin kiinteä faasi mn-net.com sepscience.com 24

25 MUITA KROMATOGRAFIOITA ioninvaihtokromatografia ionisidos affiniteettikromatografia reversiibeli (spesifinen) sidos geelisuodatus (size exclusion chromatography) molekyylin kolmiulotteinen koko ivtnetwork.com 25

26 RASKAUSTESTI masalamommas.com Madeleine Prince Ball,

27 YHTEENVETO interchopen.com 27

28 - YHDISTEIDEN PARTITIO KAHDEN ERI FAASIN VÄLILLÄ - KOMPONENTTIEN TUNNISTUS JA PITOISUUSMITTAUS SEOKSESTA - TÄRKEÄ TEKNIIKKA KLIINISESSÄ LABORATORIOSSA! 2/12/2015 O. Itkonen 28