PCR:n laadunvarmistus. Saija Hallanvuo Elintarvike- ja rehumikrobiologian tutkimusyksikkö/ Elintarvikemikrobiologiajaosto

Transkriptio

1 PCR:n laadunvarmistus Saija Hallanvuo Elintarvike- ja rehumikrobiologian tutkimusyksikkö/ Elintarvikemikrobiologiajaosto Ajankohtaista laboratoriorintamalla

2 Laadunvarmistus Validointi Henkilökunnan perehdytys Käytännön sovellusten luotettavuus Osallistuminen ulkoisiin vertailukokeisiin Tekniset järjestelyt Kontaminaatioiden esto Tulosten tekninen luotettavuus 2

3 Reaaliaikainen PCR elintarvikkeista - vaiheet Näytteen rikastus Eristys Ajon valmistelu Ajo Tulosten tarkastelu

4 Perehdytys kontaminaatioiden esto Kontaminaatioherkkyys Esim. 1 hius tai 100 emäsparia hajonnutta DNA:ta riittää Pölyhiukkaset, aerosolit

5 Perehdytys kontaminaatioiden esto Kontaminaatioriskin sisäistäminen Kontaminaatiot ihmisten huolimattomuusvirheitä Ensimmäinen merkki ongelmista: negatiivinen kontrolli positiivinen Kun kontaminaatio tapahtunut, lähteen etsiminen usein turhaa Hävitetään kaikki liuokset, kertakäyttötavarat, dekontaminoidaan välineet Näytteen suojelu Kohdebakteerin DNA:n ristikontaminaatiolta Humaani-DNA:lta DNAasi entsyymiltä (pilkkoo DNA:ta), jota mm. iholla ja pinnoilla

6 Perehdytys muuta huomioitavaa ml maailmasta µl maailmaan Tarvittaessa pienien määrien pipetoinnin opettelu, 10 x pipetointi vaa an kanssa Mm. eristysvaihe ja ajon valmistelu käydään läpi kädestä pitäen Pienet heitot työskentelytottumuksissa > ongelmien kasaantuminen Kalibroidut pipetit ja sopiva kalibrointiväli tärkeä Pätevyysajo Laitetekniikkaan perehdyttäminen Ajon käynnistys Kuka saa tulkita tuloksia?

7 Tuloksen tulkinnasta Miksi käyrän muoto on tärkeää? Ct arvo voi syntyä ilman todellista monistumista Tämän käyrän Ct arvo: 6,99

8 Tekniset järjestelyt kontaminaatioiden esto Tilojen jako VAIHE Bakteerien rikastaminen ja käsittely DNA:n eristys PCR-reaktiokomponenttien kokoaminen, mastermix PCR-reaktiokomponenttien kokoaminen, näytteen lisäys PCR-ajo (ei tuotteiden jatkokäsittelyä) Optimaalinen järjestely Omassa tilassaan (huone) Oma DNA:n eristyshuone tai laboratoriotilan bakteerivapaa alue jossa työskentely ja tavarat omassa vetokaapissaan Oma suljettu laboratoriotila (puhdastila) pipetointihuone Näytteenlisäykseen oma suojakaappi UV-puhdistuksella omassa laboratoriotilassaan (tai riittävästi erotettuna muusta toiminnasta) Pölytön laboratoriotila, laitehuone, erillään muista käsittelyvaiheista

9 Tekniset järjestelyt kontaminaatioiden esto Näytteen suojelu käytännössä Työskentely systemaattisesti pre > post Hanskojen (ja muiden suojavälineiden) ehdoton käyttö Erilliset suojatakit mastermixille Kulun rajoittaminen (vähintään) ajon valmistelutilassa Jokaisella työvaiheella ja työalueella omat välineet ja reagenssit, joita ei saa käyttää muualla Kalibroidut pipetit, omat putket ja telineet Suodatinkärkien käyttö pipeteissä

10 Tekniset järjestelyt kontaminaatioiden esto Näytteen suojelu käytännössä Muuta, erityisesti ajon valmistelutilassa huomioitavaa: DNA-templaatin laimentaminen ja muu käsittely erillään varsinaisesta reaktiokomponenttien lataamisesta ajoon Dekontaminointi (liuokset, UV) joka käytön jälkeen Sovitut toimenpiteet kun templaattia kaatuu

11 Tekniset järjestelyt kontaminaatioiden esto PCR ajon jälkeiset vaiheet: PCR reaktiotuotteet suurin uhka koko prosessille Riski pienenee jos levy suoraan roskikseen > roskis suoraan pois laboratoriosta Siivousjärjestys, järjestelyt ja niistä sopiminen Carry over -kontaminaation esto dutp nukleotideillä ja UNG entsyymillä Oletuksena että reaktiotuotteet pääsevät kontaminoimaan Ei pelasta eristysvaiheessa tapahtuvilta ristikontaminaatioilta

12 Tekniset järjestelyt kontaminaatioiden esto Kontaminaatioiden (carry-over) ranking lista : 1) Valmiit PCR tuotteet suurin riski 2) Eristysvaiheessa positiivinen näyte kontaminoi negatiivisia (kontrolli-dna:n määrän minimointi, järjestys) 3) Ajon valmistelussa positiivinen näyte kontaminoi negatiivisia (pipetointijärjestys!)

13 Tekniset järjestelyt kontaminaatioiden esto Liuoksista ja reagensseista Tarvittaessa omien reagenssierien, putkien, ym tarvikkeiden käyttö, (etenkin jos laboratoriossa paljon PCR:ää tekeviä ja tilapäisiä henkilöitä) Liuokset ja reagenssit säilytetään sopivan pienissä tilavuuksissa (putkien sentrifugointi ennen käyttöä voi olla hyväksi) Mahd. kontaminaation aiheuttamat menetykset pienenevät Sulatuskertojen määrä vähenee

14 Tekniset järjestelyt kontaminaatioiden esto Liuoksista ja reagensseista Kaikki reagenssit herkkiä pakastus-sulatussykleille Reagenssien jako valmiina laimennoksina käyttöannoksiin Evira/MIBI: kaksi annosta = yksi levy. Laimennoksen saa pakastaa kerran uudestaan, toisen sulatuksen jälkeen loppu reagenssi hävitetään Kantaliuosten sulatuksesta selkeät merkinnät, tunnistin ei kestä yli viittä sulatuskertaa Puskurit säilytetään käyttöönoton jälkeen jääkaapissa.

15 Muu laadunvarmistus dokumentointi Esimerkkejä: Mastermixtaulukko Opastaa pipetoijaa määrissä Dokumentoi erät ja välilaimennokset Pipetointikaavio

16 Muu laadunvarmistus Laitteiden ja pipettien kalibrointi, toiminnan seuraaminen Kalibroidaanko itse?, huoltosopimus? Uuden kitti/reagenssierän käyttöönotto Tarvittaessa tutkitaan vanhan kanssa rinnakkain Tutkimuksen uusinnan mahdollisuus varmistettu ja validoitu DNA:n säilyminen rikastusliemessä Solujen säilyminen elinkykyisinä näytteissä

17 Kontrollointi Standardin ISO 22174:2005 vaatimus kontrolleista: Pakollinen Negatiivinen prosessikontrolli a) Positiivinen prosessikontrolli a) Negatiivinen eristyskontrolli b) Sisäinen/ ulkoinen monistuskontrolli c) Positiivinen PCR kontrolli d) Negatiivinen PCR kontrolli d) Näytteen käsittely DNA:n eristys Monistus Detektio a) Käyttö laboratorion laadunvarmistusohjelman mukaisesti b) Tämä voidaan jättää pois, jos mukana on negat. prosessikontrolli c) Tämä kontrolli pitää olla mukana jokaisessa reaktiossa d) Tarvitaan jokaiselle ajossa mukana olevalle näyte-erälle (jokaisessa ajossa)

18 Kontrollointi sisäinen kontrolli Sisäinen monistuskontrolli (IAC) Kohde-DNA:sta riippumaton, erillinen monistusreaktio, joka tapahtuu samassa kaivossa/putkessa varsinaisen näytereaktion rinnalla Tulisi olla aina mukana (Hoorfar et al. 2003, J Clin Microbiol 41:5835) Sisäisen monistuskontrollin käytöllä pystytään havaitsemaan Näytemateriaalista lähtöisin olevat PCR-estävät tekijät Pipetointivirheiden seuraukset Reagenssien laatuvirheet PCR laitteen toimivuusongelmat

19 Kontrollointi sisäinen kontrolli Negatiivinen tulos ilman IAC:ta voi tarkoittaa kumpaa tahansa: Kohde-DNA:ta (bakteeria) ei ole läsnä näytteessä PCR on estynyt ja läsnäoleva kohde-dna ei pysty monistumaan = väärä negatiivinen

20 Kontrollointi Näytteen tulos kontrolloinnin näkökulmasta: Testattava näyte Negatiivinen prosessikontrolli / Negatiivinen eristyskontrolli Positiivinen prosessikontrolli / Positiivinen PCR kontrolli Negatiivinen PCR kontrolli Sisäinen/ulkoinen monistuskontrolli Tuloksen tulkinta /- positiivinen negatiivinen

21 Ajankohtaisia asioita PCR:ään liittyen: PCR menetelmien standardointi Periaatteiden standardointi valmis (9/2011) CEN/ISO patogeenimenetelmiä valmistellaan elitarvikemikrobiologiassa PCR:n laadunvarmistus. Asiaan paneuduttu useassa valmiissa ISO standardissa NMKL:ssä aloitettu työ PCR:n laadunvarmistuksen tiimoilta

22 PCR yleisstandardit (elintarvikkeet): Yleiset vaatimukset ja käsitteet Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens -- General requirements and definitions (ISO 22174:2005) Ajolaitteiden toimivuus Performance testing for thermal cyclers (ISO/TS 20836:2005) Näytteen käsittely Requirements for sample preparation for qualitative detection (ISO 20837:2006) Monistus ja detektio Requirements for amplification and detection for qualitative methods (ISO 20838:2006) Molekyylidetektiomenetelmien toimivuusvaatimukset Performance characteristics of molecular detection methods (ISO 22118:2011) Reaaliaikainen PCR -Yleiset vaatimukset ja käsitteet Microbiology of food and animal feeding stuffs Real-time polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens -- General requirements and definitions (ISO 22119:2011)

23 Kiitos mielenkiinnosta! /SH