Biokemian labrameiningit I harjoitustyöosuus. Arne Raasakka, Työ suoritettu: arne.raasakka@oulu.fi

Transkriptio

1 Työ 1. Rekömbinanttipröteiinin puhdistaminen Ni-NTA affiniteettikrömatögrafialla seka pröteiinin mölekyylipainön ma a ritys elektröföreesilla ja geelisuödatuskrömatögrafialla Biokemian labrameiningit I harjoitustyöosuus Arne Raasakka, Työ suoritettu: arne.raasakka@oulu.fi

2 Sisällysluettelo 1. Johdanto Työn suoritus Tulokset Tulosten tarkastelu ja johtopäätökset Kirjallisuusviitteet

3 1. Johdanto Affiniteettikromatografialla voidaan erotella makromolekyylejä toisistaan niiden spesifisten ja selektiivisten kemiallisten vuorovaikutusten perusteella. Agaroosikonjugoitua Ni 2+ -nitrilotrietikkahappo (Ni-NTA) matriksia voidaan käyttää rekombinanttiproteiinin puhdistuksessa, jonka C- tai N- päähän on liitetty polyhistidiinimerkki, joka sitoutuu Ni-NTA matriksiin. Sitoutuminen perustuu histidiinien sivuketjujen imidatsoliryhmien ja matriksin Ni 2+ ionien väliseen koordinaatiokemiaan neutraalissa tai emäksisessä ph:ssa. Rekombinanttiproteiinin sitoutuessa matriksiin, muut sitoutumattomat (makro)molekyylit virtaavat pylvään lävitse. Rekombinanttiproteiini voidaan pestä pylväästä erilleen joko (1) laskemalla ph:ta, jolloin histidiinien sivuketjut protonoituvat ja ne irtoavat matriksista, (2) käyttämällä etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), joka kompleksoi Ni 2+ ioneja tehokkaasti ja vapauttaa ne matriksista, tai (3) pesemällä matriksia imidatsolilla, joka kilpailee proteiinin histidiinien kanssa Ni 2+ kompleksoitumisesta, syrjäyttäen rekombinanttiproteiinin matriksista. Mikäli eluutio suoritetaan hapolla tai imidatsolilla, voidaan Ni- NTA matriksia käyttää muutamaan kertaan uudelleen vastaavassa työssä. EDTA-eluution jälkeen joudutaan matriksi regeneroimaan laimeilla NiCl2 tai NiSO4 liuoksilla, mikäli matriksia halutaan käyttää tulevaisuudessakin (Heikkinen et al. 2007). Proteiineja voidaan erotella denaturoivissa olosuhteissa molekyylipainon perusteella käyttämällä natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesia (SDS-PAGE). Tällaisessa elektroforeesissa polyakryyliamidigeeliin johdetaan sähkövirta, jonka mukana negatiivisesti varautuneet ionit liikkuvat kohti positiivista napaa (anodia). Natriumdodekyylisulfaatti (SDS) on anioninen detergentti, joka häiritsee oligomeeristen proteiinien kvaternaarirakennetta, jolloin monomeeriset alayksiköt irtoavat toisistaan. Proteiinit voidaan lisäksi denaturoida keittämällä, jolloin SDS sitoutuu proteiinien hydrofobisiin osiin ja denaturoituneet proteiinit saavat negatiivisen nettovarauksen. Tällöin proteiinit liikkuvat elektroforeesissa positiivista napaa kohti nopeudella, joka on kääntäen verrannollinen niiden molekyylipainojen logaritmiin. Vertaamalla proteiinien kulkeutumismatkaa tunnetun molekyylipainon omaaviin standardeihin, voidaan arvioida tutkittavan proteiinin molekyylipainoa. Proteiinien denaturoimisessa käytetään usein myös disulfidisidoksia pelkistävää yhdistettä, esim. β-merkaptoetanolia, jolloin proteiinien sisältämät rikkisillat pelkistyvät tioleiksi ja kaikista stabiileimmatkin proteiinit denaturoituvat kokonaan (Brewbaker 2006, Heikkinen et al. 2007). Proteiineja voidaan erotella koon perusteella myös natiiviolosuhteissa esimerkiksi geelisuodatuskromatografialla, jossa proteiint erottuvat niiden hydrodynaamisen säteen perusteella. Suuret proteiinit, joilla on suuri hydrodynaaminen säde, liikkuvat nopeammin geelissä, koska geelimatriksin hiukkaskoko on liian pieni hidastamaan niitä. Pienet molekyylit taas jäävät 3

4 loukkuun matriksin geelihelmiin, mistä johtuen pienet molekyylit kulkevat suuremman tilavuuden pylvään sisällä ja eluoituvat myöhemmin kuin suuret molekyylit. Myös proteiinien laskostuminen vaikuttaa liikkumiseen geelisuodatusmatriksissa ja tämän takia onkin muistettava, että pääasiassa vain globulaaristen proteiinien molekyylipainot voidaan selvittää tarkasti niiden retentiotilavuuksien perusteella, joka taas ei ole mahdollista esim. laskostumattomille tai filamenttisille proteiineille (Heikkinen et al. 2007). Biokemian labrameiningit I opintojakson harjoitustyöosuuden työ 1 käsitteli erään entsyymin (Mr = ,10 Da) rekombinanttista tuottoa bakteereissa ja affiniteettipuhdistusta sekä molekyylipainon kokeellista analysointia. Työ suoritettiin lokakuuta Työssä kasvatettiin bakteerikasvusto tuottamaan rekombinanttiproteiinia, joka sittemmin puhdistettiin Ni-NTA affiniteettikromatografialla sekä analysoitiin geelisuodatuskromatografialla ja SDS-PAGE:lla. 2. Työn suoritus Työ suoritettiin Biokemian labrameiningit I harjoitustyöosuus (Heikkinen et al. 2007) työohjeen sivujen 4 9 mukaisesti. Rekombinanttiproteiinin puhdistus on esitetty pääpiirteissään oheisessa työvaihekaaviossa (Kuva 1). Kuva 1. Rekombinanttiproteiinin affiniteettipuhdistuksen työvaihekaavio. Ennen mahdollista proteiinianalyysia, rekombinanttiproteiinin affiniteettipuhdistus voidaan jakaa kolmeen keskeiseen työvaiheeseen. Työohjeesta poiketen, kohdassa käytetyn eluutiopuskurin koostumus oli seuraavanlainen: 50 mm HEPES, 500 mm NaCl, 50 mm (NH4)2SO4, 10 % glyseroli, 1 mm ditiotreitoli, 500 mm imidatsoli, ph 7.0. Lisäksi, kohdan 3.4. SDS-PAGE geelin värinpoisto tehtiin käyttämällä tislattua vettä värinpoistoliuoksen sijasta. Ajan säästämiseksi, työn suorituksen kohdassa 4.2., geelisuodatuspylvään standardinäytteiden ajoa ei suoritettu, vaan ennalta määritetty standardikuvaaja saatiin assistenteilta molekyylipainoanalyysia varten. 4

5 MW (Da) 3. Tulokset ja niiden käsittely Bakteerit kasvatettin autoindusoivassa kasvatusliuoksessa, jonka jälkeen solut kerättiin sentrifugoinnilla ja hajoitettiin ultrasonikoimalla. Liukoisesta fraktiosta puhdistettiin rekombinanttiproteiinia Ni-NTA affiniteettikromatografialla.. Affiniteettikromatografian jälkeen, Ni-NTA-fraktioista suoritettiin SDS-PAGE analyysi positiivista napaa kohti (Kuva 2A). Geelikuvasta määritettiin standardien kulkemat matkat mittaamalla: Taulukossa I, sivulla 6, on esitetty molekyylipainostandardien vyöhykkeiden molekyylipainot sekä kulkeutumismatkat, joita käytettiin standardikuvaajan laatimiseen (Kuva 2B). Eluutiofraktio ladattiin tämän jälkeen geelisuodatuspylvääseen ja absorbanssia seurattiin aallonpituudella 280 nm koko kromatografian ajan (Kuva 2C). Assistenteilta saatua geelisuodatuspylvään standardikuvaajaa (Kuva 2D) käytettiin proteiinin molekyylipainon määritykseen havaitun retentiotilavuuden avulla (sivu 6). A B 1,E+06 1,E+05 1,E+04 1,E d (mm) y = e -0,048x R² = 0,9887 C A280 D K av 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Retentiotilavuus (ml) 0 3,7 4,1 4,5 4,9 log MW y = -0,4304x + 2,209 R² = 0,9971 Kuva 2. (A) Elektroforeesiajon polyakryyliamidigeeli Coomassie värjäyksen ja värinpoiston jälkeen sekä (B) elektroforeesin standardikuvaaja. Elektroforeesi suoritettiin 4 20 % polyakryyliamidigradienttigeelillä 25 mm Tris, 192 mm glysiini, 0,1 % SDS ajopuskurissa 200 V jännitteellä 30 min ajan huoneenlämmössä. Std, molekyylipainostandardit; L, lysaatti; S, liukoinen proteiinifraktio; U, läpitullut fraktio; W, pesufraktio; E, eluutiofraktio. (C) Geelisuodatuskromatogrammi sekä (D) geelisuodatuskromatografian standardikuvaaja. Geelisuodatusliuoksen koostumus oli 20 mm Bis-tris, 300 mm NaCl, 1 % glyseroli, 1 mm TCEP, ph 5.5. Kromatografia-ajo suoritettiin +4 C:ssa 1 ml/min isokraattisella virtauksella. Trendiviivojen yhtälöt ja korrelaatiovakiot on esitetty standardisuorien kuvissa. 5

6 Taulukko I. SDS-PAGE standardien molekyylipainot ja kulkeutumismatkat elektroforeesigeelillä Vyöhyke geelillä Molekyylipainot, MW (Da) Kulkeutumismatkat, d (mm) Standardi Standardi Standardi Standardi Standardi Standardi Standardi Standardi Standardi Kulkeutumismatkat (d) on mitattu skannatusta geelikuvasta, ei itse geeliltä. Standardien kulkeutumismatkojen ja molekyylipainojen (MW) perusteella laadittiin standardikuvaaja ja selvitettiin kuvaajan eksponentiaalisen trendiviivan yhtälö (Kuva 2B): 0,048 d MW = e Eluoituneen proteiinin kulkeutumismatka (73 mm) sijoitettiin suoran yhtälöön ja sen perusteella laskettiin molekyylipaino: MW = e 0,048 d = e 0, mm = ,879 Da Da Geelisuodatuskromatogrammin (Kuva 2D) valtapiikin retentiotilavuuden (Ve, 66,77 ml) ja geelisuodatuspylvään tyhjätilavuuden (Vo) sekä kokonaistilavuuden (Vc) perusteella laskettiin proteiinille Kav (eng. average partition coefficient) arvo. Assistentit olivat aikasemmin määrittäneet käytetylle pylväälle Vo ja Vc tilavuudet: V o = 43,17 ml; V c = 120 ml; V e = 66,77 ml K av = V e V o 66,77 ml 43,17 ml = = 0,307 V c V o 120 ml 43,17 ml Lasketun Kav arvon avulla määritettiin geelisuodatuspylvään standardikuvaajan kaavan avulla molekyylipainon kymmenkantainen logaritmi (log MW), jonka jälkeen laskettiin molekyylipaino: K av = 0,4304 log MW + 2,209 eli log MW = K av 2,209 0,4304 log MW = 0,307 2,209 4,304 = 4,4187 MW = 10 log MW = 10 4,4187 = ,848 Da Da 6

7 4. Tulosten tarkastelu ja johtopäätökset Työssä suoritettu rekombinanttiproteiinin tuotto Escherichia coli bakteereissa, lyysi ja affiniteettipuhdistus onnistuivat odotetusti: polyakryyliamidigeelillä näkyy selkeä yliekspressio 15 ja 25 kda standardien välissä, joka lienee rekombinanttiproteiini odotetun ~24 kda molekyylipainon johdosta. Puhdistuksen eri vaiheet erottuvat selkeästi geeliltä: lysaatin sentrifugoinnin jälkeen liukoisen fraktion proteiinitausta on hieman pienempi, koska liukenemattomat proteiinit ja muut yhdisteet ovat poistuneet pelletin muodossa. Yliekspressiovyöhyke hävisi kun liukoinen fraktio ladattiin pylvääseen ja läpitullut fraktio kerättiin talteen. Tämä on merkki siitä, että rekombinanttiproteiini on onnistuneesti sitoutunut matriksiin. Pesufraktiossa on vielä pieniä pitoisuuksia taustaproteiineja, mutta pesupuskurin imidatsolipitoisuus (20 mm) ei ole tarpeeksi suuri irrottamaan rekombinanttiproteiinia matriksista. Lopulta eluutiofraktiossa rekombinanttiproteiini on eluoitunut selvästi korkeamman imidatsolipitoisuuden (500 mm) syrjäyttämänä. Tulos on hyvä, koska valtaosa proteiinista saatiin sidottua matriksiin ja eluoitunut proteiini on läsnä suurissa määrin sekä ylimääräisiä proteiinivyöhykkeitä ei havaita näytteessä. Lienee tosin syytä olettaa, että kaikkien proteiinien puhdistus ei ole yhtä suoraviivaista kuin tässä tapauksessa, jolloin joudutaan turvautumaan muihinkin puhdistusmenetelmiin. SDS-PAGE onnistui myös hyvin. Proteiinit ajautuivat kohti anodia ja erottuivat toisistaan tasaisiksi vyöhykkeiksi. Luonnollisesti joidenkin proteiinien molekyylipainoerot ovat niin pieniä, että ne eivät helposti erotu toisistaan. Tämä voitaisiin ehkä ratkaista käyttämällä erilaista geelikoostumusta. Rekombinanttiproteiinille määritettiin molekyylipaino (23 kda) käyttämällä hyväksi molekyylipainostandardien avulla laadittua standardikuvaajaa. Saatu molekyylipaino vastaa hyvin odotettua, vaikka molekyylipaino ei olekaan täysin oikea. SDS-PAGE:ssa virheelliseen molekyylipainoon vaikuttaa standardien ja näytevyöhykkeiden ajautuminen, vyöhykkeiden terävyys ja mistä kohtaa vyöhykkeitä kulkeutumismatka mitataan. Lisäksi, kuten kuvan 2A standardivyöhykkeistä voidaan huomata, proteiinien ajautuminen geelillä riippuu myös siitä missä kohtaa geeliä ne ajautuvat: mitä lähempänä reunoja proteiinit ovat, sitä enemmän ne ajautuvat jäljessä muihin verrattuna. Geeliä olisi voitu käsitellä ajon jälkeen vielä lisää: yleisen sinertävän taustan johdosta olisi geeliä voitu pitää värinpoistovedessä vielä hieman pidempään värjäyksen jälkeen. Geelisuodatuskromatografia sujui ongelmitta. Proteiini saatiin ladattua pylvääseen ja eluoitui sieltä aikanaan. Proteiinin muodostama piikki oli terävä ja symmetrinen, joka on merkki proteiinin korkeasta laadusta. Proteiinin retentiotilavuuden perusteella määritettiin valmiin standardikuvaajan avulla molekyylipaino (26,2 kda). Jälleen, molekyylipaino on lähellä odotettua, todellista molekyylipainoa, josta voidaan päätellä kaksi asiaa: (1) proteiini on todennäköisesti laskostunut, koska laskostumattoman proteiinin molekyylipaino vaikuttaisi geelisuodatuksessa merkittävästi 7

8 suuremmalta, sekä (2) proteiini on monomeerinen, koska määritetty molekyylipaino vastaa jotakuinkin monomeeria. Mikäli proteiini olisi liuoksessa esim. dimeeri, olisi molekyylipaino kaksinkertainen verrattuna teoreettiseen sekä SDS-PAGE:ssa määritettyyn molekyylipainoon. Geelisuodatuksessa määritetty molekyylipaino heittää hieman teoreettisesta, johon voi olla syynä esimerkiksi se, että työssä käytettiin proteiinipuhdistukseen tarkoitettua preparatiivista pylvästä, jonka erottelukyky on huonompi kuin ns. analyyttisen pylvään. Lisäksi, proteiinin retentiotilavuus ei ole välttämättä täysin vertailukelpoinen standardien retentiotilavuuksiin, koska retentiotilavuuksiin ei vaikuta pelkästään pylvään geelimatriksin tilavuus, vaan myös mm. pumpun ja laitteiston putkien tilavuudet, lämpötila ja geelimatriksin kunto. Tarkin tulos saataisiin määrittämällä sekä näytteiden että standardien retentiotilavuudet samalla kertaa saman työn aikana. Kun tarkastellaan geelisuodatuskromatogrammia, huomataan lisäksi että proteiinin muodostama piikki on ainoa koko kromatogrammissa. Tämä on erittäin hyvä merkki proteiininäytteen laatua ajatellen. Mikäli samasta näytteestä havaittaisiin esim. monomeeri- ja dimeeripiikki, olisi ilmiselvää, että kyseessä on seos, jossa vallitsee kemiallinen tasapaino. Vaikka pelkkä monomeeri saataisiin eristettyä, palautuisi se ajan kuluessa mahdolliseen alkutasapainoonsa, jossa monomeeria ja dimeeriä on tietyssä suhteessa, ellei tätä estettäisi jotenkin. Lisäksi, proteiinista ei tullut ns. void piikkiä, joka on täsmälleen tyhjätilavuuden kohdalla ilmestyvä piikki. Tämä on tyypillinen merkki siitä, että proteiini on aggregoitunut, eli epäspesifisesti kasaantuu itsensä kanssa suuriksi proteiinikerääntymiksi. Tällainen näyte on hyvin heterogeeninen ja usein entsymaattisesti inaktiivinen. Tämän työn tuloksista voidaan todeta, että työssä puhdistettu proteiini on geelisuodatuksen perusteella puhdas, tasalaatuinen ja monomeerinen, joka on hyvä lähtökohta esim. proteiinin kiteyttämistä ajatellen. Työ onnistui pääpiirteittäin hyvin. Työvaiheet saatiin suoritettua ilman suurempia ongelmia ja työn tulokset vastaavat odotettuja. Affiniteettipuhdistuksen tehokkuus ensimmäisenä puhdistusvaiheena on ilmeisesti erittäin hyvä ja ylipäänsä proteiinien rekombinanttinen tuotto vaikuttaa helpolta ratkaisulta, mikäli halutaan saada suuria määriä proteiinia eristettyä. Lisäksi opimme analysoimaan proteiinin molekyylipainon kahdella erilaisella, toisiaan täydentävällä menetelmällä, joista toinen, geelisuodatus, antaa myös tarvittaessa tietoa esim. proteiinin oligomeerijakaumasta liuoksessa. 5. Kirjallisuusviitteet Heikkinen J, Myllylä R & Tryggvason K (2007) Biokemian labrameiningit I harjoitustyöosuus. Oulun yliopisto, Biokemian laitos, Oulu, s. 4-9 Brewbaker M (2006) Demystifying SDS-PAGE, University of California at Davis, City of Davis [viitattu ] Saatavissa: 8