α-amylaasi α-amylaasin eristäminen syljestä ja spesifisen aktiivisuuden määritys. Johdanto Tärkkelys Oligosakkaridit Maltoosi + glukoosi

Transkriptio

1 n eristäminen syljestä ja spesifisen aktiivisuuden määritys. Johdanto Työssä eristetään ja puhdistetaan merkittävä ja laajalti käytetty teollisuusentsyymi syljestä. pilkkoo tärkkelystä ensin oligosakkarideiksi ja sitten maltoosiksi ja glukoosiksi (kuva 1). Puhdistusvaiheiden jälkeen määritetään eri näytteiden proteiini- ja entsyymimäärät. Tuloksista täytetään lopuksi puhdistustaulukko ja tehdään tuloskuvaaja, josta selviävät näytteiden proteiinipitoisuudet ja spesifiset entsyymiaktiivisuudet. Amylaasimäärissä voi olla merkittäviä eroja henkilöiden välillä eli jokaisen tulokset ovat omanlaiset. Tee kaikki työvaiheet mahdollisuuksien mukaan kylmässä, etteivät proteaasit tuhoa tuotesaantoa. Suorita supernatanttien (yläliuos) poistot varovasti pipetillä tai alipaine-imulla, ettei sentrifugoitui pelletti irtoa pienoissentrifugiputken pohjasta. Merkitse ja säästä kaikki työvaiheen putket ja liuokset. Tärkkelys sininen Oligosakkaridit punertava Maltoosi + glukoosi keltainen Kuva 1 n toiminta ja jodireaktion värit. 1

2 Laboratoriotyö: n eristäminen syljestä ja spesifisen aktiivisuuden määritys.! Muista työturvallisuus: Huomioi töissä syljen mukana leviävien tautien mahdollisuus. Työssä käsitellään vaarallisia aineita, kuten jodia. Tutustu käyttöturvallisuustietoihin. 1. Aseta sentrifugi toimintakuntoon ja laita jäähdytys (+4 C) päälle jos ominaisuus laitteesta löytyy. 2. Sylje esimerkiksi dekantterilasiin sen verran, että voit pipetoida siitä sylkeä 2 x 1,5 ml pienoisputkiin. 3. Sentrifugoi pienoisputkia 8000 g, 5 min. 4. Siirrä supernatanttia 0,8 ml/putki kahteen puhtaaseen pienoisputkeen. Pipetoi loput saatavilla olevasta supernatantista talteen = näyte Lisää pisaroittain jääkylmää etanolia (noin 95 %) niin, että etanolin loppukonsentraatio liuoksessa on 40 %. Sekoita putkia joka tippalisäyksen jälkeen esimerkiksi vorteksissa. 6. Sentrifugoi g, 10 min. 7. Poista 1 ml/putki supernatanttia uusiin pienoisputkiin. Pipetoi loput saatavilla olevasta supernatantista talteen = näyte Kylmennä supernatantti ja lisää alla olevat kemikaalit kirjoitetussa järjestyksessä yksittäin putkeen. Sekoita putkia joka tippalisäyksen jälkeen esimerkiksi vorteksissa. 0,06 ml 0,2 M puskuri, ph 8,0 0,05 ml glykogeeni (pitoisuus 20 mg/ml) (engl. glycogen) 0,08 ml 95 % etanoli 9. Pidä putkia jäissä ja sekoita välillä 5 min. 10. Sentrifugoi 5000 g, 3 minuuttia. 11. Poista supernatantti varovasti (= näyte 3). Mahdollisessa valkeassa pelletissä on nyt pääosa amylaasista. 12. Lisää molempiin putkiin 500 µl jääkylmää liuosta, jonka koostumus seuraava (sekoita hyvin ennen käyttöä). Suspensoi pelletti pipetoituun liuokseen ja yhdistä molempien putkien sisältö lopuksi yhteen uuteen putkeen. 0,75 ml H 2 O 0,072 ml 0,2 M puskuri, ph 8,0 0,6 ml 95 % etanoli 13. Sentrifugoi 5000 g, 3 min. 14. Poista supernatantti (= näyte 4). 15. Liuota saostuma 0,4 ml 0,2 M puskuriin, ph 8 (= näyte 5). Tulosten mittaus Mittaa näytteiden proteiniipitoisuudet esim. Bradford-menetelmällä. Näytteiden proteiinitasot ovat oletettavasti melko matalat eli mahdollisimman suuren mittausalueen sijasta mittauksessa kannattaa keskittyä tarkkuuteen. Bradford-menetelmässä tarkkuutta saa lisää muuttamalla näytteen ja reagenssin suhdetta. Kun näyte-reagenssisuhde on suuruusluokkaa 10 µl/300 µl, niin lineaarinen mittausalue yltää noin 1,5-2 mg/ml proteiinipitoisuuksiin. Kun näyte-reagenssisuhde on suuruusluokkaa 50 µl/200 µl, niin mittaus on lineaarinen noin 100 µg/ml asti. Selvitä näytteiden tilavuudet ja päätä sitten miten proteiinimäärityksen suoritat. Tee näytelaimennoksia tarvittaessa. 2

3 Entsyymimäärityksissä kello käy eli nämä työt vaativat tarkkuutta ja järjestelmällisyyttä. Jos ohitat mittaushetken, niin sitä ei takaisin enää saa muuten kuin toistamalla työ. Tässä määrityksessä optimimääritysaika on 3-6 minuuttia, laimenna näytteitä jos reaktio on liian nopea (=jodireaktiossa kellertävä väri). Sentrifugoidusta alkusyljestä 1/100 ja 1/50 -laimennokset ovat todennäköisesti sopivat. Päättele muiden näytteiden sopivat laimennokset alkutulosten perusteella. Kannattaa aloittaa liian aktiivisilla näytteillä kuin laimeilla, kunhan näytteet eivät lopu kesken työn. Näin säästyy aikaa. Kun määritys tulee tutuksi niin voit toki ajaa useampaa näytettä tai näytelaimennosta samaan aikaan, esimerkiksi 30 sekunnin väleillä. 1. Pipetoi jodiliuosta 0,4 ml kuuteen läpinäkyvään pienoiskoeputkeen tms. Pidä putket huoneenlämmössä. 2. Pipetoi tärkkelysliuosta steriilillä pipetinkärjellä steriiliin pienoiskoeputkeen 750 µl ja aseta putki 40-asteiseen lämpöhauteeseen kahdeksi minuutiksi temperoitumaan. 3. Lisää 50 µl (mahdollisesti laimennettua) näytettä tärkkelysputkeen. Sekoita ja aloita ajanotto minuutin jälkeen poista 100 µl tärkkelys-amylaasiliuosta ensimmäiseen jodiliuosputkeen. Sekoita, merkitse kellonaika ja väri laboratoriopäiväkirjaan. Jos väri on kellertävä, niin amylaasinäytettä tarvitsee laimentaa ja tehdä mittaus alusta uudestaan. 5. Jatka näytteidenottoa 1-2 minuutin välein, aina 100 µl jodiputkeen siirtäen. Sekoita, merkitse kellonaika ja väri laboratoriopäiväkirjaan. 6. Aja loputkin näytteet samaan kellertävään värisävyyn ja kirjaa tulokset. Amylaasiaktiivisuus (U/dl) = 1,85 16 lopetusaika (min) näytelaimonnos Kuva 2 Jodireaktion värit tärkkelyksen pilkkoutumisen tahdissa. Alussa tärkkelys ja jodi muodostavat tummansinisen värin ja lopulta väri on kellertävä. 3

4 Reagenssit 0,2 M puskuri, ph 8.0, tarve muutamia millilitroja/työ 2 % (20 mg/ml) glykogeeni (esim. oyster glycogen, Sigma), tarve muutamia millejä/työ 95 % etanoli, tarve muutamia millejä/työ 20 mm puskuri ph 7, tarve muutamia millejä/työ Tärkkelysliuos, tarve noin 50 ml/työ o Tärkkelys (engl. starch) 0,75 g/l 20 mm Tris-puskurissa ph 7. Liuoksessa lisäksi 10 mm NaCl. Kiehauta ja sekoita tärkkelysliuos tekovaiheessa kirkkaaksi ja testaa jodi-reaktion toimivuus ennen mittauksia (kuva 3). Liuos ei säily ilman säilöntäaineita, joten valmista aina uusi liuos. Jodiliuos, tarve noin 20 ml/työ o 0,2 % jodia 20 mm Tris-puskurissa ph 7. Liuoksessa lisäksi 0,2 mm kaliumjodidia. Säilytä huoneenlämmössä. Liuos säilyy käyttökuntoisena pitkään. 0,5 % NaCl-liuos näytteiden laimentamiseen, tarve noin 10 ml/työ Kuva 3 Tärkkelys- ja jodiliuoksen testaus. Tuloksena pitää olla tummansininen reaktio. Tulosten käsittely Kirjaa mittaamasi tulokset puhdistustaulukkoon, laske tarvittavat laskut ja tee lopputuloksista kuvaaja. 4

5 Täytä oheista puhdistustaulukko töiden edetessä soveltuvin osin. Tee lopuksi tiedoista kuvaaja. Päivämäärä Proteiini Lähtömateriaali Entsyymiaktiivisuusmääritysmenetelmä Proteiinimääritysmenetelmä Vaihe V (ml) Proteiinipitoisuus (mg/ml) Proteiinia yht. (mg) (U/dl) Kokonais-αamylaasiaktiivisuus (U) Spesifinen aktiivisuus (U/mg) Saantoprosentti (%) Rikastuskerroin 5