Syto- ja molekyyligeneettisten

1831 Katsausartikkeli Sytogenetiikka ja molekyylipatologia syöpätautien diagnostiikassa esimerkkeinä lymfoomat ja sarkoomat SAKARI KNUUTILA Syto- ja molekyyligenetiikka perinteisen patologian tukena täsmentää histopatologista luokitusta joissakin tilanteissa. Erityisesti hematologisissa maligniteeteissa ja sarkoomissa on sytogeneettisiä ja molekulaarisia muutoksia, joilla on itsenäistä kliinistä merkitystä. Geenien toimintaa laajaalaisesti mittaava mikrolevyanalytiikka avaa uusia näköaloja histologisesti yhtäläisten syöpätyyppien jaotteluun ennusteen tai hoitovasteen suhteen erilaisiin geeniekspressioryhmiin. Syto- ja molekyyligeneettisten menetelmien kehitys on ollut nopeaa viime vuosien aikana. Fluoresoivien koettimien käyttö in situ -hybridisaatiossa ja digitaalinen kuvankäsittely ovat tarkentaneet, täsmentäneet ja ennen muuta herkistäneet perinteistä kromosomiraitoihin perustuvaa sytogeneettistä tutkimusta. Perinteisessä sytogenetiikassa on tutkittavien solujen oltava mitoosissa ja tutkimuksen työläyden vuoksi voidaan yleensä analysoida vain 20 solua (herkkyys kärsii) ja poikkeavuuksien yksityiskohtainen tulkinta on hankalaa. Näiden rajoitusten vuoksi menetelmästä on hyötyä lähinnä hematologisten maligniteettien ja sarkoomien diagnostiikassa. Syto- ja molekyyligeneettiset tutkimukset varmentavat ja täsmentävät leukemioiden ja myös lymfoomien ja sarkoomien diagnostiikkaa ja ennusteen arviointia, ja menetelmillä on erityinen merkitys taudin seurannassa. Tässä katsauksessa tarkastelen uuden sytogenetiikan ja molekyyligenetiikan hyötyä ensisijaisesti lymfoomien ja sarkoomien valossa. Tarkastelu pohjautuu paljolti vuosien kuluessa rakennetun syto- ja molekyyligenetiikan (CMG) laboratorion kokemuksiin. Kuva 1 esittää syto- ja molekyyligeneettisten menetelmien viimeaikaisen kehityskulun. Portaikon menetelmät ovat rutiininomaisesti käytössä HYKS-Laboratoriodiagnostiikan CMG-laboratoriossa. KROMOSOMIRAITA- TUTKIMUS, TRANSLOKAATION PALJASTAVA MENETELMÄ Kromosomiraitoihin perustuva metafaasivaiheisten kromosomien morfologinen tutkimus on perusmenetelmä, joka paljastaa sekä lukumääräiset että rakenteelliset kromosomien poikkeavuudet (kuva 2). Rakenteellisista poikkeavuuksista diagnostiikan kannalta keskeisimpiä ovat kromosomien translokaatiot. Näillä poikkeavuuksilla on hämmästyttävä syöpätyyppispesifisyys. Monet leukemioiden spesifisistä translokaatioista ovat niin merkittäviä, että leukemioita jo puolittain luokitellaan translokaatioiden mukaisesti: Philadelphia- (9;22-translokaatio), 15;17-translokaatio- tai 8;14-translokaatio-positiiviset leukemiat. Taulukossa 1 on esitetty lymfooma- ja sarkoomaspesifisiä translokaatioita. Hodgkinin taudissa ei toistaiseksi tunneta erityisen spesifisiä kromosomipoikkeavuuksia. Sarkoomat jakautuvat spesifisten poikkeavuuksien suhteen kahtia siten, että joissakin alatyypeissä on hyvinkin spesifisiä translokaatioita (taulukko 1), kun taas joissakin, esimerkiksi osteo- ja kondrosarkoomassa sekä malignissa fibroosisessa histiosytoomassa ja leiomyosarkoomassa, ei tyyppipoikkeavuuksia todeta. Useimpien translokaatioiden molekulaarinen tausta on selvitetty. Translokaatiossa kromosomin osien vaihtaessa paikkaansa tapahtuu geenien uudelleenjärjestymistä. Geenifuusiossa aktivoituu useimmiten solun kasvua, DNA:n kahdentumista, transkriptiota, solusykliä tai solukuolemaa säätelevä geeni. Lymfaattisten kasvainten kohdalla toisena osapuolena on useasti jokin immunoglobuliini- tai T-solureseptorigeeneistä: B-soluisessa maligniteetissa yleensä immunoglobuliinigeeni ja T- soluisessa T-solureseptorigeeni. Näyttää siltä, että sellainen antigeenireseptorigeeni, joka on aktiivinen (tapahtuu normaalifysiologista uudelleenjärjestymistä), on osallisena translokaatiossa aktivoimalla soluonkogeenin. Antigeenireseptorigeenin muodostamat geenifuusiot

1832 S UOMEN L ÄÄKÄRILEHTI 17/2000 VSK 55 Taulukko 1. Lymfoomien ja sarkoomien toistuvia kromosomipoikkeavuuksia. Syöpätyyppi Kromosomipoikkeavuus Geenimuutos 1 Lymfoomat Burkitt t(8;14)(q24;q32) CMYC;IGH (80 %) B-solu t(14q32), t(2p12), t(22q11) IGH, IGK, IGL Manttelisolu t(11;14)(q13;q32) BCL1;IGH del(11q22)? Pienilymfosyyttinen t(9;14)(p13;q32)?; IGH +12? MALT t(11;18)(q21:q21) API2;MLT Follikulaarinen t(14;18)(q32;q21) IGH;BCL2 Ki-1 t(2;5)(p23;q35) ALK;NPM Plasmasolu t(14q32) IGH del(13q)? T-solu t(7q34), t(14q11), t(7p15) TCRB, TCRD, TCRG Sarkoomat Osteosarkooma kompleksinen Kondrosarkooma useita Ekstraskeletaalinen kondrosarkooma t(9;22)(q22;q12) CHN;EWS t(9;17)(q22;q11) CHN;TAF2N Ewingin sarkooma t(11;22)(q24;q12) FLI1;EWS (n. 90 %) t(21;22)(q22;q12) ERG;EWS (n. 5 %) t(7;22)(p22;q12) ETV1;EWS (< 5 %) t(2;22)(q33;q12) FEV;EWS t(17;22)(q12;q12) EIAF;EWS Lipooma t(3;12)(q27-29;q14-15) LPP;HMGIC Neurilemmooma del(22q) BCH (puutos) Dermatofibrosarkooma t(17;22)(q22;q13) COL1A1;PDGFB Kirkassolusarkooma (clear cell) t(12;22)(q13;q12) ATF1;EWS Desmoplastinen pieni pyöreätumainen t(11;22)(p13;q12) WT1;EWS Juveniili fibrosarkooma t(12;15)(p13;q25-26) ETV6;NTRK3 Leiomyosarkooma kompleksinen Myksoidinen liposarkooma t(12;16)(q13;p11) CHOP;FUS (n. 90 %) t(12;22)(q13;q12) CHOP;EWS (n. 5 %) MFH (maligni fibroottinen histiosytooma) kompleksinen Alveolaarinen rabdomyosarkooma t(2;13)(q35;q14) PAX3;FKHR (n. 70 %) t(1;13)(q36;q14) PAX7;FKHR (n. 5 %) Synoviaalisarkooma t(x;18)(p11;q11) SYT;SSX1, SSX2 Alveolaarinen pehmytosasarkooma t(x;17)(p11;q25)? Aneurysmaattinen luukysta t(16;17)(q22;p13)? 1 puolipiste erottaa geenifuusioon osallistuvat geenit; t = kromosomien translokaatio; del = kromosomideleetio Tuumori-mikrolevytesti/Syöpägeenien kliinisen merkityksen selvittäminen cdna-mikrolevytesti/syövän molekulaarinen luokittelu PCR/Luuytimensiirronjälkeinen kimerismi 24-väri-FISH/Perusmenetelmän täydentäminen VGH/Perusmenetelmän täydentäminen Geenifuusion osoittaminen PCR:llä/Jäännöstauti FISH/Jäännöstauti Southern blotting/antigeenireseptorien klonaliteetti Geenifuusion osoittaminen Southern blottingilla/ Kromosomitranslokaation varmentaminen MAC/Immunofenotyypin yhdistäminen/linjaspesifisyyden osoittaminen Kromosomien raidoitus/perusmenetelmä Kuva 1. Syöpätautien syto- ja molekyyligeneettinen diagnostiikkaportaikko HYKS-Laboratoriodiagnostiikassa. 2000 01 2000 01 1999 1999 1994 1993 1990 1984 1984 1982 1979 rajoittuvat lymfaattisiin maligniteetteihin eikä lymfaattisen maligniteetin geenifuusiossa ole aina osallisena antigeenireseptorigeeni. KROMOSOMI- TRANSLOKAATIO DNA- JA RNA-TUTKIMUKSESSA Kromosomitranslokaatioiden aiheuttamat geenifuusiot voidaan todeta Southern blotting -hybridisaatiomenetelmällä ja käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktioeli RT-PCR-menetelmällä. Southern blottingissa sopivilla DNA:ta pilkkovilla entsyymeillä fuusiogeenistä pilkkoutuu normaaliin geeniin verrattuna poikkeavan kokoinen DNApätkä, joka voidaan havaita geenin tunnistavalla koettimella elektroforeesiajon jälkeen (1) (kuva 3). Molekyylitasolla geenifuusion syntyessä DNA:n katkoskohdat vaihtelevat potilaasta toiseen siinä määrin, ettei PCR:ssa yhdellä eikä edes muutamalla alukeparilla pystytä jäljittämään eikä monistamaan fuusioaluetta. DNA:ta ei tällöin voida käyttää tutkimuksessa. Sen sijaan RNA:n syntyessä DNA:sta pilkkoutuvat eikoodaavat intronialueet pois, joten lyhyempään RNA:han voidaan rakentaa fuusiokohdan tunnistavat alukkeet. RNA:n hajoamisen vuoksi tutkimuksessa käytetään RNA:sta käänteiskopioijaentsyymillä (reverse transcriptase) rakennettua komplementaarista DNA:ta (cdna). Follikulaarisen lymfooman 14;18- translokaation aiheuttamassa IGH- BCL2-geenifuusiossa katkoskohdat eri potilailla rajoittuvat lähinnä kahdelle suppealle alueelle, jolloin PCR:lla voidaan kahta erillistä alukeparia käyttämällä tunnistaa fuusioalue suoraan DNA:sta (kuva 4) yli 80 %:lta kaikista translokaatiopositiivisista potilaista (1). Näitä DNA- ja RNA-menetelmiä käytetään diagnostiikan tukena tavanomaisen kromosomiraita-analyysin tuloksen mukaan. Tärkeää on aina pakastaa näytettä 80 C:n lämpötilaan, jotta tutkimus voidaan tarvittaessa tehdä myöhemmin. Etenkin silloin, kun taudin seurannassa tulee tarve käyttää geenifuusiota, on seurannan välttämättömänä perustana, että diagnosointihetken näytteestä on osoitettu geenien uudelleenjärjestymä eli geenifuusio. RNA:n eristäminen ei ole nykyisin hankalaa, mutta se edellyttää

1833 Kuva 2. Epätyypillisellä (follikulaarisen lymfooman piirteitä) Burkittin lymfoomapotilaalla todettu kromosomipoikkeavuus imusolmukkeen soluissa. Nuolet osoittavat Burkittin lymfoomaan liittyvän 8;22- translokaation ja follikulaarisen lymfooman 14;18-translokaation. Lisäksi kromosomi 1 on poikkeava ja kromosomi 7 on ylimääräinen. Karyotyyppipoikkeavuus merkitään: 47,XX,add(1)(q32),+7,t(8;22) (q24;q11),t(14;18)(q32;q21). Kuva 3. Autoradiografian antama tulos Ph-translokaation DNAanalyysista. Näytteissä 4, 5 ja 8 (kroonista myelooista leukemiaa sairastavia potilaita) nähdään normaali BCR-signaali sekä muuttuneet BCR-signaalit, jotka on merkitty kuvaan nuolilla. Näytteissä 1 3 ja 6 7 (akuuttia myelooista leukemiaa sairastavia potilaita) nähdään ainoastaan normaali BCR-signaali. Kustannus Oy Duodecimin luvalla (1) kasvainbiopsian nopeaa (alle 2 tuntia) kuljettamista laboratorioon. Luuydinnäyte tulee ottaa RNA:n hajoamista estävään liuokseen. 9;22-Philadelphia-translokaatioon ja 11;22-Ewing-translokaatioon liittyviä ABL/BCR- ja EWS/FLI1-fuusiogeenejä tutkitaan HYKS:n CMGlaboratoriossa ensisijaisesti RT-PCRmenetelmällä ja tarvittaessa Southern blotting -menetelmällä. 14;18- translokaatioon liittyvä IGH/BCL2- fuusiogeeni tutkitaan DNA:sta herkennetyllä polymeraasiketjureaktiolla (nested PCR). DNA- JA RNA-TUTKIMUS PALJASTAA KLONAALISEN SOLUKON LYMFAATTISISSA MALIGNITEETEISSA Southern blotting- ja RT-PCR-analyyseillä voidaan siis todeta spesifinen kromosomipoikkeavuus ja siihen liittyvä geenien uudelleenjärjestyminen. Muista kuin kromosomitranslokaatioiden aiheuttamista geenitason muutoksista kliinistä merkitystä on immunoglobuliini- ja T-solureseptorigeenien normaaliin fysiologiaan liittyvällä uudelleenjärjestymisellä. Vaikka viime aikoina on kuvattu valtava määrä erilaisia geenimuutoksia erityyppisissä syö- vissä, ei tämä tieto ole vielä varsinaisesti kliinisen hyödyntämisen tasolla lymfoomissa eikä sarkoomissa. Eräiden geenien monistumisella, kuten NMYC neuroblastoomassa, ja P53- mutaatioilla erityyppisissä syövissä saattaa olla kliinistä merkitystä. Tässä katsauksessa en käsittele periytyvän rintasyövän, paksusuolen syövän enkä muiden periytyvien syöpien geenimutaatioita ja niiden toteamiseen käytettäviä testejä; niitä on käsitelty mm. Mecklinin ym. katsauksessa (2). Immunoglobuliinigeenien ja T-solureseptorigeenien uudelleenjärjestyminen kuuluu B- ja T-solujen normaaliin fysiologiaan (1) (kuva 5). Koska uudelleenjärjestymät normaalisti vaihtelevat soluittain näin taataan suunnaton vasta-aineiden kirjo tarvitsematta tuhansia erillisiä geenejä ei Southern blotting -menetelmä havaitse niitä. Vain mikäli soluja, joissa on samanlainen uudelleenjärjestymä, on vähintään 5 %, voidaan uudelleenjärjestymä todeta Southern blotting -menetelmällä. Koska lymfaattiset maligniteetit, kuten muutkin syövät, ovat monoklonaalisia tauteja, ovat syöpäsolut samankaltaisia myös uudelleenjärjestymisen suhteen ja Southern blottingissa voidaan todeta uudelleenjärjestymäraita. Kuva 4. Seitsemän lymfoomapotilaan imusolmukenäytteiden tutkiminen PCR-menetelmällä pääkatkosalueen (MBR) alukkeilla (kaistat 1 7). Kahdeksas näyte on negatiivinen reagenssikontrolli ilman DNA:ta, ja laitimmaisen kaistan juovat ovat DNAfragmenttien kokoa ilmaisevia verrokkeja. Näytteissä 1, 4 ja 6 on uudelleenjärjestymäjuova. Kustannus Oy Duodecimin luvalla (1) Antigeenireseptorigeenin uudelleenjärjestymän osoittamisessa voidaan käyttää myös PCR-menetelmää, joko suoraan DNA:sta tai cdna:sta. DNA:n PCR:ssa tarvitaan useita alukepareja, jotta uudelleenjärjestymä voidaan löytää, ja parhaimmillaan noin 80 % uudelleenjärjestymistä on löydettävissä. Jotta antigeenireseptorin uudelleenjärjestymän toteaminen RT-PCRmenetelmällä on mahdollista, on jokaiselle potilaalle rakennettava DNA-sekvensointia apuna käyttäen kloonispesifiset alukkeet. Menetelmä on vaativa ja tulkinta aiheuttaa vaikeuksia; on mm. havaintoja, että

1834 S UOMEN L ÄÄKÄRILEHTI 17/2000 VSK 55 Kantalinja (germ line) V n V n+1 V n+2 V n+3 V n+4 V n+5 D n n+5 J 1 6 C + Uudelleenjärjestymä Kantalinja (germ line) V n V n+1 V n+2 C A. D n J 3 6 B. Uudelleenjärjestymä Kuva 5 A. Hypoteettinen esimerkki yhdessä B-solussa tapahtuvasta immunoglobuliinigeenin normaalista fysiologisesta uudelleenjärjestymästä. Ylhäällä on esitetty V-, D-, J- ja C-osat IGH-geenissä ja alaosassa muokkautunut uudelleenjärjestynyt geeni. Nuolet osoittavat restriktioentsyymin katkaisukohtia. V n, V +1 ja V n+5 ovat viimeiset sadoista V-geeneistä, jotka ovat kromosomeissa peräkkäin. Kun solut erilaistuvat B-lymfosyyteiksi, jokin viidestä D-geenistä saa kylkiinsä yhden V-geeneistä ja yhden J-geeneistä. Tällöin välissä olevat osat häviävät. Normaalisti samalla tavalla uudelleenjärjestyneitä soluja esiintyy vain harvoin, mistä johtuen SB-menetelmän herkkyys ei riitä osoittamaan uudelleenjärjestymiä. B. Klonaaliseen yhdestä solusta lähtöisin olevaan lymfosyyttipopulaatioon viittaava uudelleenjärjestymä. Kustannus Oy Duodecimin luvalla (1) TEL A. 12 12 Normaali 21 21 Normaali AML1 12 12 TEL-AML1-fuusio 21 21 taudin edetessä uudelleenjärjestymä voi muuttua toisenlaiseksi, jolloin alun perin rakennetuilla alukkeilla ei enää voidakaan todeta uudelleenjärjestymistä. HYKS:n CMG-laboratoriossa on käytössä Southern blotting -pohjainen menetelmä sekä immunoglobuliinigeenin raskaan ketjun että T-solureseptorigeenin (b) uudelleenjärjestymän katsomiseksi ja lisäksi PCR-menetelmä IGH:n uudelleenjärjestymien katsomiseksi. Southern blottingia voidaan käyttää vain tuore- ja pakastusnäytteiden tutkimuksiin, kun taas PCR-menetelmää voidaan käyttää myös parafiinileikemateriaaliin. B. Kuva 6. Lasten akuutin lymfaattisen leukemian yleisimmän translokaation t(12;21) osoittaminen in situ -kaksivärifluoresenssihybridisaatiolla. A. Koettimet on valittu niin, että translokaation tapahtuessa TEL-geenin vihreä signaali sulautuu punaiseen AML-geenin signaaliin muodostaen keltaisen signaalin. Lisäksi AML-geenistä jää pieni fragmenttisignaali, sillä koetin on valittu keskeltä geeniä, jolloin se translokaation myötä halkeaa. B. 12;21-translokaation osoittavia sinisiä interfaasisoluja. IN SITU -MONIVÄRI- FLUORESENSSI- HYBRIDISAATIO JA VERTAILEVA GENOMINEN HYBRIDISAATIO TÄYDENTÄVÄT KROMOSOMIRAITA- TUTKIMUSTA Tavanomaiseen kromosomitutkimukseen liittyy kolme keskeistä heikkoutta: interfaasisoluja ei voida tutkia, kromosomien raidoituksen laatu ei aina riitä kyllin yksityiskohtaiseen analyysiin ja todettu poikkeavuus on liian monimutkainen tulkittavaksi. In situ -fluoresenssihybridisaatiomenetelmät ja vertaileva genominen hybridisaatio tuovat ratkaisun mainittuihin ongelmiin. Ne täydentävät kromosomiraitatutkimusta mutta eivät korvaa sitä.

1835 Interfaasisytogenetiikassa ei tarvita mitoottisia soluja Fluoresoivilla paikkaspesifisillä DNA-koettimilla in situ -hybridisaatiossa voidaan tutkia kromosomien lukumäärää, geenikopioita ja kromosomitranslokaatioita (kuva 6), myös interfaasisoluista. HYKS:n CMG-laboratoriossa on käytössä lähes jokaisen kromosomin sentromeerikoettimet, joilla voidaan tunnistaa näiden kromosomien lukumääräiset poikkeavuudet. Taulukossa 2 on esitetty käytettävissä olevat interfaasisytogenetiikkaan soveltuvat translokaatio-, geenideleetioja geenimonistumaspesifiset koettimet. Vertailevalla genomisella hybridisaatiolla voidaan selvittää kromosomaalisia muutoksia DNA:sta Käänteinen kromosomimaalaus eli vertaileva genominen in situ -hybridisaatio (VGH) on avannut merkittäviä mahdollisuuksia syöpätautien, myös lymfoomien ja sarkoomien syöpägeenien monistumisen ja syövän suojageenien häviämisen tutkimisessa. Tässä menetelmässä kasvain- ja vertailukudoksen eri väreillä merkittyä DNA:ta käytetään samanaikaisesti testikromosomivalmisteiden koettimina (3) (kuva 7). Mikäli kahden värin esimerkiksi punaisen kasvainkudoksen ja vihreän vertailu-dna:n sävykartta muuttuu, voidaan osoittaa kromosomialueet, joissa on tapahtunut geeniaineksen määrän muutoksia. Analyysiin tarvitaan fluoresenssimikroskoopin lisäksi puna-viherintensiteetit herkästi paljastava CCD-kamera ja tietokoneohjelma, joka esittää kunkin kromosomin ja kromosomiraidan osalta DNA:n kopiomäärän käyränä ja osoittaa normaalit rajaarvot ylittävät kohdat (kuva 8). Sen jälkeen kun menetelmä 1992 kuvattiin, on eri syöpien DNA:n kopiomääristä ilmestynyt yli 300 julkaisua (4). Tutkimusryhmämme www-sivuille on syöpätyypeittäin taulukoitu tiedot DNA:n kopiomäärien muutoksista (http://www.helsinki.fi/~lgl_www/cmg.html). Parafiiniblokkien hyväksikäyttö on mahdollistanut monista syövistä ensimmäistä kertaa kromosomaalisten muutoksien kuvaamisen. Menetelmän avulla on kuvattu huomatta- Vertailu-DNA 800 emäsparin pätkinä punaiseksi leimattuna Nick-translaatio VGH-1 In situ -hybridisaatio Nick-translaatio 1 Fluoresoiva kromosomi Tutkittava DNA 800 emäsparin pätkinä vihreäksi leimattuna 1,17-raja-arvo DNA-ylimäärä 0,85-raja-arvo DNA-puutos Kuva 7. Vertaileva genominen hybridisaatio kaavamaisesti esitettynä. Punainen ja vihreä fluoresenssi mitataan fluoresenssimikroskoopissa digitaalisella kuvankäsittelyohjelmalla ja tulos esitetään kunkin kromosomin osalta suhdekäyrällä. Kromosomit tunnistetaan DAPIfluoresenssilla. Kustannus Oy Duodecimin luvalla (3) Taulukko 2. Spesifisten kromosomi- ja geenimuutosten osoittaminen interfaasisoluista (poikkeavuus voidaan luonnollisesti todeta myös metafaasivaiheen solusta). Maligniteetti Kromosomipoikkeavuus Geeni Krooninen myelooinen ja akuutti lymfaattinen leukemia t(9;22)(q34;q11) ABL; BCR Akuutti myelooinen leukemia AML-M3 t(15;17)(q22;q21) PML; RARA Akuutti lymfaattinen leukemia t(12;21)(p13;q22) TEL; AML1 Anaplastinen suurisoluinen lymfooma t(2;5)(p23;q35) ALK;NPM Myelodysplastinen oireyhtymä/ akuutti myelooinen leukemia del(5)(q31) EGR1 Myelodysplastinen oireyhtymä/ akuutti myelooinen leukemia del(5)(q33-q34) CSFIR B-solutyypin krooninen lymfaattinen leukemia del(13)(14.3) RB1 Akuutti myelooinen leukemia del(7)(q31)? Myeloproliferatiiviset taudit, myelodysplastinen oireyhtymä del(20)(q12)? Useat tuumorit del(17p13.1) P53 Neuroblastooma amp 2p23-p24 MYCN Eturauhassyöpä amp Xq12 AR Useat tuumorit amp 8q24 MYC Rintasyöpä, useat muut amp 17q11.2-q12 ERBB2/HER2/ neu Useat tuumorit amp 20q13.2 ZNF217 Rintasyöpä, useat muut amp 11q13 Cyclin D, PRAD1, CCND1 amp DNA:n kopiomäärän monistuminen; t kromosomien translokaatio; del kromosomideleetio

1836 S UOMEN L ÄÄKÄRILEHTI 17/2000 VSK 55 Kuva 8. Vertailevassa genomisessa hybridisaatiossa nähdään DNA:n kopiomäärän muutokset koko kromosomiston osalta (yläosa). Digitaalinen kuvankäsittelyohjelma paljastaa vihreän (kopiomäärän lisääntyminen) ja punaisen (kopiomäärän puuttuminen) rajaarvon ylittävät kopiomäärän muutokset. va määrä uusia kromosomaalisia alueita, joissa on joko DNA:n puutosta tai monistumaa. Mikrodissektoimalla parafiinileikkeestä haluttu alue ja monistamalla DNA:ta ns. DOP-PCR:lla on tutkimus voitu kohdistaa muutaman solun suuruiselle alueelle, jolloin on saatu uutta tietoa syövän progressioon liittyvistä geneettisistä muutoksista. Menetelmä on niin ikään tuonut uutta tietoa monien syöpien molekulaarisista mekanismeista. Se on paljastanut kromosomialueita, joilta on muilla menetelmillä myöhemmin kloonattu syöpägeenejä; esimerkki tästä on LKB1-geeni Peutz Jeghersin oireyhtymän polyypeissä. Kliinistä hyötyä menetelmästä olemme todenneet lasten akuutissa lymfaattisessa leukemiassa tavanomaisen kromosomitutkimuksen täsmentäjänä. VGH-tutkimuksella voidaan paljastaa tässä leukemiatyypissä usein olevat ylimääräiset kromosomit (kuva 9). Ilman varmuutta siitä, mitkä kromosomit ovat ylimääräisiä, ei in situ -fluoresenssihybridisaatioon ole valittavissa luotettavia koettimia (markkereita). Useilla syöpätyypeillä on tyypillinen DNA:n kopiomäärään perustuva profiili. Esimerkiksi manttelisolulymfoomassa on tyypillisesti kromosomin 3 monistuma ja kromosomin 11 puutos. Näitä muutoksia ei nähdä diffuusissa suurisoluisessa B-solulymfoomassa, mutta nähdään 18q (BCL2)-monistuma. Mesoteliooman DNA-kopiomäärän Kuva 9. Vertaileva genominen hybridisaatio (vasemmalla alhaalla) varmentaa ongelmallisissa tilanteissa G- raita-analyysia (ylhäällä). Kuvassa on VGH:n avulla varmennettu kromosomin 5 ylimäärä. Tätä poikkeavuutta on käytetty taudin seurannassa in situ -hybridisaatiomenetelmässä (vasemmalla alhaalla kromosomin 5 ylimäärä metafaasivaiheisessa solussa).

1837 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 X X 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17 18 18 21 21 22 22 Amplifikaatio, lisäys 1,3 ja <1,5 Korkea-asteinen amplifikaatio, lisäys 1,5 profiili poikkeaa siinä määrin keuhkojen adenokarsinooman profiilista, että nämä kaksi toisinaan erotusdiagnostisen ongelman aiheuttavaa syöpää voidaan erottaa toisistaan yli 90 %:n todennäköisyydellä (5) (kuva 10). Sarkoomissa on toistuvia spesifisiä monistuma-alueita, joiden merkitys ei ole ainoastaan biologinen vaan myös diagnostinen ja ennusteellinen (taulukko 3). VGH-menetelmä on rutiininomaisesti käytössä HYKS:n CMG-laboratoriossa. Tutkimus voidaan tehdä myös parafiiniblokeista tai -leikkeistä eristetystä ja monistuneesta DNA:sta. In situ -monivärifluoresenssihybridisaatio tarkentaa komplisoitunutta karyotyyppipoikkeavuutta In situ -monivärifluoresenssihybridisaatiossa (M-FISH) saadaan viiden fluoresoivan aineen erilaisia yhdistelmiä käyttäen jokainen kromosomi maalattua eriväriseksi (kuva 11). Menetelmällä on suuri merkitys määritettäessä komplisoituneita kromosomipoikkeavuuksia, alkuperäl- Kuva 10. DNA:n kopiomäärän profilointi mesotelioomassa (MM) on merkittävästi erilainen kuin keuhkojen adenokarsinoomassa (LC). Erosta on erotusdiagnostista hyötyä. Viiva kuvaa potilasta, jolla on kyseisellä kromosomialueella DNA:n kopiomäärän lisääntymistä (kromosomin oikealla puolella) ja puuttumista (vasemmalla). British Journal of Cancerin luvalla (5) Taulukko 3. Lymfoomien ja sarkoomien toistuvia DNA:n kopiomäärän muutoksia. Syöpätyyppi Muutos Merkitys Ewingin sarkooma amp 1q22 amp 1q Useat amp 2 RET-monistuma Manttelisolulymfooma amp 3q Non-Hodgkin-lymfooma loss 6q Useat sarkoomat amp 8q24 ennustetta huonontava Useat loss 9p Manttelisolulymfooma, krooninen lymfaattinen leukemia loss 11q Liposarkooma amp 12q Krooninen lymfaattinen leukemia loss 13q ennustetta huonontava Osteosarkooma, leiomyosarkooma amp 17p Dermatofibrosarkooma amp 17q Diffuusi suurisoluinen B-solulymfooma amp 18q BCL2-monistuma amp = kopiomäärän monistuminen merkityllä kromosomialueella; loss = kopiomäärän vähentyminen; p = kromosomin lyhyt haara; q = kromosomin pitkä haara

1838 S UOMEN L ÄÄKÄRILEHTI 17/2000 VSK 55 Kuva 11. 24-värimaalatut kromosomit paljastavat luotettavasti translokaatioita, mistä tässä esimerkkinä komplisoitunut t(9;13;22)- Philadelphia-translokaatio. Vertailukudos mrna cdna Mikrolevy Kuva 12. cdna-mikrolevytestin periaate. Tuumorikudos tään tunnistamattomia marker-kromosomeja ja raitamenetelmän ulottumattomissa olevia kromosomipoikkeavuuksia. Menetelmä täsmentää erityisesti lymfoomien sytogeneettistä tutkimusta. M-FISH on rutiininomaisesti käytössä. Se täydentää tarvittaessa kromosomien raita-analyysiä. Tutkimukseen ei useinkaan tarvita uutta näytettä, vaan tavanomaisesta tutkimuksesta ylijääviä valmisteita voidaan käyttää tutkimukseen (M- FISH-värjäykseen käytettävät valmisteet ovat samanlaisia kuin raita-analyysiin käytettävät valmisteet). MIKROLEVYTESTEILLÄ VOIDAAN TUTKIA TUHANSIEN GEENIEN TOIMINTAA JA TUHANSIA NÄYTTEITÄ SAMANAIKAISESTI cdna-mikrolevytestissä tuumorista eristettyä vihreäksi leimattua ja muusta kudoksesta eristettyä punaiseksi leimattua RNA:ta (komplementaariseksi DNA:ksi muutettuna) hybridisoidaan mikrolevyllä oleville tuhansille geenejä edustaville cdnajaksoille (6) (kuva 12). Mitä voimakkaammin geeni on ekspressoitunut, sitä voimakkaampi on vihreäksi leimatun koettimen fluoresenssi, ja punainen väri kuvastaa puolestaan geenin heikkoa ekspressiota (kuva 13). Yhdellä hybridisaatiolla voidaan näin selvittää tuhansien geenien samanaikaista toimintaa syöpäkudoksessa. Tehokkaiden bioinformaatioohjelmien avulla on ollut mahdollista tarkastella ekspressiota geeniryhmittäin. Gene clustering onkin käsite, joka on esiintynyt usein tuoreimpien Nature Genetics -aikakausilehtien sivuilla. Geeniklusterien avulla on voitu luokitella yhtenäinen histologinen syöpätyyppi useaan ennusteellisesti ja hoitovasteeltaan erilaiseen molekulaariseen alatyyppiin. Diffuusi suurisoluinen B-solulymfooma on tästä hyvä esimerkki (7) (kuva 14 A). Histologisesti tauti on samankaltainen (homogeeninen) mutta kliiniseltä kulultaan, kuten ennusteeltaan ja hoitovasteeltaan, heterogeeninen. Amerikkalaiset tutkijaryhmät osoittivat, että geeniekspressioklusteri, joka muistuttaa itukeskuksesta peräisin olevien solujen geeniekspressiota, on ennusteen kannalta suotuisa merkki, kun taas aktivoituneiden B-solujen ekspressiota muistuttava geeniekspressioklusteri on ennusteen kannalta huono merkki (kuva 14 B). Vastaavanlaista geeniryhmien ekspressioon perustuvaa molekulaarista luokittelua ollaan tekemässä useista eri syöpätyypeistä monissa laboratorioissa. HYKS:n CMG-laboratoriossa on tutkittu mm. kroonisen lymfaattisen leukemian geeniekspressiota ja todettu geeniekspressiossa eroja todettujen kromosomipoikkeavuuksien suhteen. Jo nyt on markkinoilla erityyppisiä joko lasi- tai filtteripohjaisia mikrolevystöjä, mm. yleissyöpälevystöjä, prostatamikrolevystö, hematologi-

1839 Kuva 13. Mikrolevystöllä vihreänä fluoresoivat levyt osoittavat geenin voimakasta ekspressiota, punaiset levyt heikkoa ja keltaiset normaalia ekspressiota käytettyyn referenssiin nähden. nen tai immunologinen tai hematoimmunologinen levystö, onkogeeni-, kasvutekijä- ja apoptoosilevystöjä. On myös mahdollista teettää yksilöllinen mikrolevystö valitsemalla omaan kysymyksen asetteluun tarvittavat cdna:t. Kaupalliset levystöt ovat suhteellisen kalliita. Siksi Meilahden kampusalueelle on perusteilla tukilaboratorio, joka auttaa yksilöllisten levystöjen suunnittelussa ja tekemisessä. Toistaiseksi HYKS:n CMG-laboratorion useissa tutkimusprojekteissa on käytetty filtteripohjaista mikrolevytestiä. Tutkimustulokset ovat siinä määrin rohkaisevia, että olen vakuuttunut menetelmän olevan kliinisessä käytössä kahden vuoden kuluttua. Tuumorimikrolevystöllä selviää tutkittavan geenin kliininen merkitys Yhdelle tuumorimikrolevystölle voidaan panna jopa tuhannen potilaan parafiinikudosnäytteet. Halutusta tuumoriblokin kohdasta otetaan erityislaitteistoon kiinnitetyllä neulalla 0,6 mm:n levyinen näyte, joka siirretään tyhjään parafiiniblokkiin (8) (kuva 15). Blokkiin voidaan sijoittaa näytteet jopa tuhannesta tuumorista. Blokista voidaan leikata 4 5 µm:n viipale tavanomaisesti ja asettaa se lasille. Näin aikaansaatu mikrolevystö voidaan värjätä periaatteessa kaikilla histokemiallisilla ja immunohistokemiallisilla menetelmillä tai sille voidaan tehdä in situ -fluoresenssihybridisaatioanalyysi yhdellä tai useammalla geeni-, lokus- tai kromosomispesifisellä koettimella (kuva 16). Myös geenien toiminnan selvittäminen RNA in situ -hybridisaatiolla on mahdollista, joskin hankalaa. HYKS:n CMG-laboratoriossa on tehty tuumorimikrolevystöjä joillekin tuumorityypeille; valmius tuumorimikrolevystöjen tekemiseen on siis olemassa. Lähinnä yhteistyössä on tehty levystöjä muillekin. A. B. 1,0 Eloonjäämisen todennäköisyys 0,5 Kaikki potilaat GC B-kaltainen 19 potilasta 6 kuolemaa Aktivoitu B-kaltainen 21 potilasta 18 kuolemaa 0,0 0 2 4 6 8 10 12 Kuva 14 A. Normaalien B-solujen erilaistumiseen ja aktivaatioon perustuva geeniekspressioryhmittely diffuusissa suurisoluisessa B-solulymfoomassa. Oranssi: itukeskusperäisten solujen kaltainen geeniekspressio; sininen: aktivoituneiden B-lymfosyyttien kaltainen geeniekspressio. Pystyrivit edustavat potilaita ja vaakarivit geenejä. Punainen väri kuvaa geenin voimakasta ekspressiota ja vihreä osoittaa ettei geeni ekspressoidu. Potilaat voidaan jakaa geeniekspression mukaan kahteen ryhmään: itukeskussolujen geeniekspression kaltaisiin ja aktivoituneiden B- solujen geeniekspression kaltaisiin. B. Ensimmäiseen ryhmään kuuluvilla potilailla (oranssi käyrä) on merkittävästi parempi ennuste kuin jälkimmäiseen ryhmään (sininen käyrä) kuuluvilla. Naturen luvalla (7), copyright 2000 Macmillan Magazines Ltd

1840 S UOMEN L ÄÄKÄRILEHTI 17/2000 VSK 55 Tuumoriblokki Uusi blokki johon stanssatut tuumoripalat on sijoitettu Leike stanssatuista tuumoripaloista Kuva 15. Kudosmikrolevystön periaate Konosen ym. (8) mukaan. Parafiiniin valetusta tuumorinäytteestä otetaan 0,6 mm levyinen näyte, joka siirretään tyhjään parafiiniblokkiin. Tästä voidaan tehdä tavanomaisia leikkeitä histokemiallisia, immunologisia ja sytogeneettisiä värjäyksiä varten (kuva 16). Kuva 16. In situ -2-värihybridisaatiolla värjätty tuumorimikrolevystö (alla) diffuusista suurisoluisesta B-solulymfoomasta. MIKÄ MENETELMÄ LYMFOOMIEN JA SARKOOMIEN DIAGNOSTIIKKAAN? Diagnostiikassa kromosomiraitatutkimus antaa yleiskuvan perintöaineksen muutoksista paljastaen kliinispatologisesti merkittäviä, jopa diagnostisia poikkeavuuksia. Perusmenetelmän täydentämiseen ja täsmentämiseen käytetään tarvittaessa moniväri- ja muita in situ -fluoresenssihybridisaatiomenetelmiä ja vertailevaa genomista hybridisaatiota. Lymfooma- ja sarkoomaspesifisten translokaatioiden varmentamiseen ja toteamiseen voidaan käyttää Southern blotting- ja PCR-menetelmiä tai jompaakumpaa niistä, ellei kromosomiraitatutkimusta tuorenäytteen puuttuessa ole voitu tehdä. Immunoglobuliini- ja T-solureseptorigeenien uudelleenjärjestymän tutkimisesta on apua lymfooman ja muiden pieni- ja pyöreätumaisten tuumorien (small round cell tumors) erotusdiagnostiikassa (lymfooma, Ewingin sarkooma ja neuroblastooma). MITÄ MENETELMIÄ JÄÄNNÖSTAUDIN TOTEAMISEEN JA SEURANTAAN? Perinteinen kromosomitutkimus ei ole riittävän herkkä jäännöstaudin tutkimiseen. In situ -fluoresenssihybridisaatio on jopa sata kertaa herkempi. Menetelmää voidaan kuitenkin käyttää vain silloin, kun diagnoosivaiheessa todettu kromosomipoikkeavuus on löydettävissä kromosomimaalauksella tai interfaasisytogeneettisellä tutkimuksella tai kummallakin. Molekyylisytogenetiikan herkkyys löytää maligneja soluja on noin 1/1 000 (0,1 %); Southern blotting -analyysin vastaava herkkyys on 2 5 %, joten siitä ei ole sanottavasti hyötyä jäännöstaudin osoittamisessa. PCR:n herkkyys on jopa 1/10 000, mutta sen käyttö rajoittuu aiemmin mainittujen translokaatioiden toteamiseen. Molekyylisytogenetiikkaan verrattuna PCRmenetelmä ei ole kvantitatiivinen ja kontaminaatio-ongelmat ovat merkittäviä.

1841 Leukemiaspesifisen translokaation osoittaminen fluoresenssi in situ -hybridisaatiolla spesifinen ja luotettava jäännössolujen osoittamisessa. Interfaasisytogenetiikassa arvioidaan hybridisaatiosignaaleja. Koska siinä ei voida suoraan nähdä poikkeavuutta, liittyy menetelmään noin prosentin suuruinen väärän positiivisen tulkinnan mahdollisuus. Väärien positiivisten signaalien määrä vähenee merkittävästi, jos on mahdollista käyttää kaksi eri poikkeavuutta samanaikaisesti osoittavaa kaksivärifluoresenssi in situ -hybridisaatiota. Noin 30 %:lla non-hodgkin-lymfooma- ja sarkoomapotilaista on sellainen poikkeavuusyhdistelmä, että kaksivärimenetelmää voidaan käyttää luotettavasti interfaasisytogenetiikassa. Metafaasivaiheen in situ -hybridisaatioon soveltuu noin 60 % non-hodgkin-lymfoomapotilaista. Sarkoomat ovat translokaatioiden suhteen varsin erilaisia, joten myös metafaasi-fish soveltuu seurantaan hyvin eri tavalla eri sarkooma-alatyypeissä. Taulukossa 1 on esitetty ne sarkoomat, joihin liittyy spesifisiä translokaatioita. SYTOGENETIIKKA JA MOLEKYYLIPATOLOGIA JO NYT KLIINISTÄ PATOLOGIAA Kromosomien taustavärjäys DAPI:lla In situ -hydridisaatio kromosomin 17 maalauskoettimella Edellä esitetty sytogenetiikan ja molekyylipatologian diagnostiikkaportaikko on tullut mukaan kliiniseen syöpäpatologiaan. Lyhyesti kuvaamani esimerkit toivon mukaan valaisivat sitä, kuinka sytogeneettisellä ja molekyyligeneettisellä alaluokittelulla entistä kliinismorfologista luokittelua täydentämällä voidaan morfologisesti tai histologisesti yhteneväisestä entiteetistä löytää molekulaarisia alatyyppejä, joilla on erilainen kliininen käyttäytyminen ja hoitovaste. Uskonkin, että lymfoomien ja sarkoomien lisäksi myös muita syöpätyyppejä on lähitulevaisuudessa mahdollista jaotella täsmähoidon kannalta merkittäviin molekulaarisiin alatyyppeihin. Kuva 17. 15;17-translokaation osoittaminen metafaasi-fish:lla (oikealla alhaalla). Kromosomit voidaan tunnistaa DAPI-kromosomien taustavärjäyksellä. Nuolet osoittavat translokaation. Maligneja jäännössoluja tutkittaessa voidaan genotyypin määritys kohdistaa tiettyyn fenotyyppiin. Kromosomitutkimuksen spesifisyyttä ja herkkyyttä voidaan lisätä kohdistamalla se esimerkiksi B-solulymfoomassa immunoglobuliini-kevytketjun suhteen klonaalisiin soluihin. MAC-yhdistelmämenetelmään voidaan liittää solujen rikastaminen esimerkiksi immunomagneettihelmien avulla. Jäännöstaudin toteamisen ohella MAC-menetelmää voidaan käyttää myös perifeerisen veren kantasolusiirrossa leukafereesillä ja kantasolurikastuksella saatujen solujen karakterisointiin. Metafaasikromosomien maalaus in situ -hybridisaatiolla mahdollistaa kromosomin morfologian toteamisen (kuva 17). Menetelmä onkin varsin KIRJALLISUUTTA 1 Knuutila S. Sytogeneettiset ja molekyylibiologiset tutkimukset. Kirjassa: Ruutu T, Rajamäki A, Krusius T, toim. Veritaudit. Jyväskylä: Kustannus Oy Duodecim 1996;46 59. 2 Mecklin J-P, Peltomäki P, Aaltonen L, Kääriäinen H. Periytyvä syöpä. Suom Lääkäril 1995;50:2057 2064. 3 Knuutila S. Kromosomien rakenne ja toiminta. Kirjassa: Aula P, Kääriäinen H, Leisti J, toim. Perinnöllisyyslääketiede. Jyväskylä: Kustannus Oy Duodecim 1998;44 62. 4 Knuutila S, Björkqvist A-M, Autio K ym. DNA copy number amplifications in human neoplasms. Review of comparative genomic hybridization studies. Am J Pathol 1998;152:1107 1123. 5 Björkqvist A-M, Tammilehto L, Nordling S ym. Comparison of DNA copy number changes in malignant mesothelioma, adenocarcinoma and largecell anaplastic carcinoma of the lung. Br J Cancer 1998;77:260 269. 6 Nat Genet 1999;21 supplement. 7 Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE ym. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 2000;403:503 511. 8 Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A ym. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med 1998;4:844 847. Kirjoittaja SAKARI KNUUTILA FT, professori Haartman-instituutti ja HYKS, lääketieteellisen genetiikan osasto sähköposti: Sakari.Knuutila@helsinki.fi