9/30/2013. GMO analytiikka. Termistöä. Markkinoilla olevien GM kasvien ominaisuuksia

Transkriptio

1 GMO analytiikka Kemian ja toksikologian tutkimusyksikkö Evira Termistöä geenimuuntelu muuntogeeninen siirtogeeninen GM GMO (geneettisesti muunnettu organismi) GM tapahtuma (event): käytetään silloin kun tarkoitetaan kasvilinjaa, joka on peräisin yhdestä geenimuunnostapahtumasta (vrt. lajike) Geneettisesti muunneltua ainesta sisältävä rehu Markkinoilla olevien GM kasvien ominaisuuksia kestävyys rikkakasvien torjuntaaineille vastustuskyky hyönteisiä vastaan stacked genes, geenipakka : GM vanhempien molemmat ominaisuudet muuttunut rasvahappokoostumus tärkkelysperuna 1

2 Lainsäädäntö Euroopan unionin alueella elintarvikkeet ja rehut saavat sisältää ainoastaan EU:ssa hyväksyttyjä muuntogeenisiä (GM) aineksia ja ne on merkittävä selvästi, jos ne sisältävät enemmän kuin 0,9 % GM materiaalia. Hyväksymätöntä GM ainesta sisältävät elintarvikkeet ja rehut on vedettävä markkinoilta. Yhteistyö EU:n alueella European Network of GMO Laboratories, ENGL Kansallisten GM laboratorioiden yhteistyöelin testaa ja validoi GM tapahtuman havaitsemis- ja tunnistamismenetelmät Hakija toimittaa menetelmän ja referenssimateriaalia Kehittää ohjeita validointia, näytteenottoa yms. varten GMO menetelmätietokanta GM analyysivaiheet Skriinaus positiivinen negatiivinen GMO? on/ei (kasvilajit) Identifiointi kyllä ei hyväksyttyjä? kyllä/ei kvantitointi yksittäisten ainesosien kvantitointi Yli 0,9% alle 0,9% valvonnan toimenpiteet takaisinveto-ohjeen mukaan täytyykö merkitä? kyllä/ei merkittävä ei tarvitse merkitä 2

3 GM analytiikkaa tehdään pääasiassa kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR:llä (Q-PCR) Rehusta tai elintarvikkeesta eristetään DNA analytiikka sopii vain matriiseille, joista voidaan eristää DNA:ta DNA:n hajoaminen voi olla ongelma pitkälle prosessoiduissa tuotteissa Q-PCR:n avulla katsotaan onko näytteessä GM ainekseen liittyvää DNA:ta, joka monistuu skriinaus identifiointi GM aineksen osuus mitataan vertaamalla GM tapahtuman DNA:n määrää kasvilajispesifiseen DNA:n määrään soija vs. soija GM tapahtuma maissi vs. maissi GM tapahtuma jne. PCR Polymerase chain reaction DNA:n monistamista kontrolloidusti Tarvitaan DNA-polymeraasi-entsyymi, joka rakentaa uuttaa DNA-juostetta ja kestää kuumuutta denaturoitumatta alukkeet, jotka sitoutuvat DNA templaattiin polymeraasiketjureaktion aloittamiseksi (oligonukleotideja l. lyhyitä DNA juosteita) Nukleotideja uusien DNA-juosteiden rakennusaineiksi Sopiva puskuri Lämpötilaa säätelevä kone Esimerkkejä PCR:n käytöstä Voidaan analysoida tuleeko PCR tuotetta vai ei Voidaan analysoida minkä pituisia juosteita PCR tuottaa (esimerkiksi isyystutkimus, rikospaikkatutkinta ) voidaan analysoida lähtömateriaalin määrää (kvantitatiivinen PCR) voidaan käyttää geenien kloonaamiseen Voidaan tuottaa mutatoituja geenejä, jotka voidaan siirtää eliöihin 3

4 PCR-reaktioseosta kuumennetaan ja jäähdytetään kontrolloidusti 94 C denaturaatio: DNA-kaksoisjuoste aukeaa 60 C Alukkeet ja polymeraasi Sitoutuvat 72 C Uusi juoste syntetoidaan DNA:n määrä lisääntyy PCR:ssä eksponentiaalisesti 4. sykli haluttu geeni 3. sykli 2. sykli 1. sykli 35 sykliä templaatti DNA 2 2 = 4 kopiota 2 3 = 8 kopiota 2 4 = 16 kopiota 2 5 = 32 kopiota 2 36 = 68 miljardia kopiota PCR-tuotteen analysointi Tavanomaisessa PCR:ssä tuote täytyy analysoida geelielektroforeesilla. Voidaan esimerkiksi tutkia syntyykö PCR tuotetta vai ei (onko tutkittavassa DNA:ssa jakso, johon alukkeet tarttuvat) 4

5 Q-PCR:n periaate Mittaa PCR tuotteen määrän jokaisen PCR syklin jälkeen (tavallisessa PCR:ssä mitataan vain lopputuotteen määrä, end-point measurement) PCR tuotteen määrä mitataan fluoresoivien väriaineiden avulla SYBR Greenin periaate SYBR Green fluoresoi silloin kun se on sitoutuneena 2-juosteiseen DNA:han. Kun DNA on denaturoitunut, fluoresenssin määrä laskee huomattavasti Ekstensovaiheessa SYBR Green sitoutuu taas 2-juosteiseen DNA:han ja fluoresoi voimakkaasti Fluoresenssia on sitä enemmän mitä enemmän on 2-juosteista DNA:ta eli PCR-tuotetta. TagMan periaate fluorofori sammuttaja TagManissa käytetään koettimia, jotka ovat kaksois-leimattuja fluoresoivalla reportterilla ja sammuttajalla (quencher). Kun koetin on ehjä, molekyylin energia siirtyy sammuttajalle, jolloin fluoresenssia ei havaita. Polymeraasin eksonukleaasiaktiivisuus pilkkoo koetinta samalla kun se valmistaa uutta juostetta. Sammutin irtoaa reportterista ja ei enää pysty vaimentamaan reportterin fluoresoivaa signaalia. Mitä enemmän reaktioon syntyy DNA:ta, johon koetin pystyy sitoutumaan ja josta polymeraasi sen pilkkoo, sitä enemmän syntyy mitattavaa fluoresenssia. 5

6 Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR syklin jälkeen DNA:ta on kaikissa suunnilleen saman verran Erot tässä vaiheessa selittyvät sillä että templaattia, eli DNA:ta on eri määriä eri näytteissä kvantitointi Miten GM kasvit tehdään ja kuinka tätä käytetään hyväksi GM analytiikassa 1. Geenin siirtäminen kasvisoluun Siirrettävä geeni saadaan kasvisoluun Agrobakteerin avustuksella Tai siirrettävä geeni on kultahiukkasten pinnalla, jotka ammutaan kohdesolukkoon 6

7 2. Geeni integroituu solun kohdegenomiin 3. Solu monistetaan ja selektoidaan muista soluista esim. kasvattamalla antibioottialustalla 4. Kasvisolukko erilaistuu versot ja juuret uusi GM kasvi 7

8 Mitä GM kasveihin on siirretty selektiogeeni geeni, jolla saadaan aikaan haluttu ominaisuus kasvi DNA P geeni A T P geeni B T kasvi DNA promoottori, laittaa geenin päälle terminaattori, ilmoittaa mihin geeni loppuu kullakin geeninsiirtotapahtumalla on spesifinen kohta kasvigenomissa, mihin siirretty geenikasetti on integroitunut geenikasetti Miten GM kasvien ominaisuuksia käytetään hyväksi GM analytiikassa selektiogeeni geeni jolla saadaan aikaan haluttu ominaisuus kasvi DNA P geeni A T P geeni B T kasvi DNA Kasvilajin tunnistus kasvilaji-spesifisillä alukkeilla, referenssigeeni 2. skriinaus: konstruktispesifiset alukkeet: onko GM kasveille tyypillisiä geenin osia, esimerkiksi geeninsiirrossa käytettyjä promoottereita tai terminaattoreita (joita ei kasveista yleensä löydy) 3. Tapahtumaspesifinen tunnistus siirretyn geenin ja kasvigenomin integraatiokohtaan kiinnittyvillä alukkeilla: toinen aluke kiinnittyy siirrettyyn geeniin ja toinen kohdegenomiin, hyvin spesifinen GM analytiikka käytännössä Rehut: Eviran valvontaviranomaisten kotimaisen valmistuksen tai markkinavalvonnan näytteitä Koulutetut näytteenottajat Tulokset julkaistaan vuosittain Eviran julkaisusarjassa ut/?a=view&productid=356 8

9 Edustava näytteenotto! 50t rehua esim. rehulinjastolta 10 x 1 kg osanäyte rehuvirrasta tasaisin väliajoin (laboratorionäyte) 10 x 1 kg rinnakkaisnäyte, joka jää toimijalle Jokainen 10 osanäytteestä jaetaan kahtia Puolikkaat yhdistetään ja sekoitetaan kokoomanäytteeksi Kokoomanäyte supistetaan näytteenjakajalla 1 kg:ksi, joka jauhetaan Valvontanäytteestä laboratorionäytteeksi 11 DNA:n eristystä varten otetaan 2 x 1 g näyte PCR levylle pipetoidaan (2x) 3 x ng DNA:ta Jos GM aineksen pitoisuus on mittausepävarmuus huomioon ottaen lähellä merkintärajaa, jokainen 0,5 kg osanäyte analysoidaan Skriinaus: kasvilajit ja GM elementit Kolme GM elementtiä ja 1 kasvilaji 9

10 Identifiointi skriinaustuloksen perusteella soijan GM tapahtumat skriinauselementit Vihreä: GM tapahtuma sisältää ko. GM elementin Oranssi: GM tapahtuma ei sisällä ko. GM elementtiä Tarkistetaan Q-PCR:llä mitkä GM tapahtumat näytteestä löytyvät Identifioidun GM tapahtuman osuus mitataan ja suhteellinen osuus lasketaan Näytteissä olevan GM aineksen määrä (genomikopiolukumääränä) arvioidaan standardisuoran avulla, joka on tehty tietyn määrän GM ainesta sisältävästä DNA:sta Näytteessä olevan kasvilajin genomikopiolukumäärä arvioidaan samalla tavalla. GM tapahtuman genomikopio lkm kasvilajin genomikopio lkm X 100% Suhteellinen kvantitointi 1% GM ref. materiaali ~5% GM materiaalia voidaan sanoa vain kuinka paljon näytteessä olevasta soijasta on GM soijaa, ei kuinka paljon GM tapahtumaa on koko näytteessä tai kuinka paljon näytteessä on soijaa 10

11 Suhteellinen kvantitointi 100 % soijaa 0 % GM soijaa 100 % soijaa 10 % GM soijaa 90 % maissia 10 % soijaa 10 % GM soijaa Uuden polven GM kasvit uudet analyysitavat Geeninsiirtotapa erilainen rekombinaatio pistemutaatio siirretään ainoastaan kasvin omia geenejä tai säätelyalueita cis-geneesi: siirretään saman kasvilajin kokonaisia geenejä Intrageneesi: muuten sama kuin cis, mutta geenifragmentteja on järjestetty uudelleen eri tapahtumia sisältävät GM kasvit risteytetty (stacked events) geenipakka esim. MON89034 x 1507 x MON88017 x Muuttuneet ominaisuudet ravintosisältö muuttunut (kultainen riisi) Siirretty geeni, joka säätelee usean muun geenin toimintaa kasvin useita ominaisuuksia on muuttunut Uuden polven GM kasvit Tähän asti esim. glyfosaatinkestävyys saadaan siirtämällä kasveihin Agrobakteerin CP4 kannan EPSP syntaasi, joka ei ole herkkä glyfosaatille tai muuttamalla kasvin omaa EPSPS syntaasia ja siirtämällä se takaisin kasviin Ero herkkään/kasvin omaan EPSP syntaasiin vain muutama aminohappo Uuden polven GM kasvit: kohdennettu pistemutaatio: muutetaan vain halutut aminohapot, ei siirretä enää kokonaisia geenejä Ovatko GM vai ei? 11

12 Sulamiskäyrä-analyysi SYBR greenillä Tm vaihtelee sen mukaan miten pitkä PCR tuote on, tai missä suhteessa eri nukleotideja siihen on sitoutunut A-T sidoksen sulaminen vaatii matalampaa lämpötilaa kuin G-C sidoksen sulaminen High resolution melting, HRM Voidaan nähdä jopa yhden nukleotidin erot PCR tuotteessa uuden polven GM kasvien analyysi Nettisivuja, joissa tietoa GMO:sta et/muuntogeeniset+tuotteet+/