In Situ Hybridisaatio - menetelmä patologian laboratorion työvälineenä

Koko: px

Aloita esitys sivulta:

Download "In Situ Hybridisaatio - menetelmä patologian laboratorion työvälineenä"

Heidi Pääkkönen
7 vuotta sitten
Katselukertoja:

1 In Situ Hybridisaatio - menetelmä patologian laboratorion työvälineenä Mervi Jumppanen sairaalasolubiologi Seinäjoen keskussairaala, patologian yksikkö

2 Sisält ltö Menetelmän n periaate FISH ja CISH Käyttöalueet patologiassa ISH näytteiden laaduntarkkailu

3 ISH menetelmän n periaate tunnistetaan nukleiinihappokoettimien avulla halutut jaksot solujen DNA:sta tai RNA:sta tunnistettava kohde voi olla kromosomi, kromosomin tietty alue, geeni jne. sitoutuneet koettimet visualisoidaan joko fluoresoivilla leimoilla tai leimattu koetin tunnistetaan immunohistokemiallisesti

4 Koetin Näyte DNA Leimaus + denaturaatio Denaturaatio 95ºC Hybridisaatio 37ºC

6 FISH vs. CISH Fluorescence in situ hybridization = FISH koetin leimattu fluoresoivalla merkkiaineella leima tarkasteltavissa suoraan fluoresenssimikroskoopin avulla Chromogenic in situ hybridization = CISH koetin leimattu esim. biotiinilla tai digoxigeninilla leimattu koetin tunnistettava immunohistokemiallisesti

7 Substraatti-kromogeeni liuos Polymeeri kompleksi (linkattu anti-laji X vasta-aineeseen ja entsyymiin Anti-DIG vasta-aine (laji X) Hybridisoitunut DIG-leimattu koetin

8 FISH vs. CISH

9 FISH vs. CISH FISH tarvitaan fluoresenssimikroskooppi analysoijalla oltava vankka kokemus fluoresenssimikroskopiasta ja FISH-näytteiden tulkinnasta valmistettu näyte n säilyy s vain muutamia kuukausia usean koettimen samanaikainen tunnistus mahdollista CISH pärjätään n valomikroskoopilla kudoksen morfologia tarkasteltavissa paremmin säilyy pitkää ään voidaan tunnistaa kaksi koetinta samanaikaisesti

10 Menetelmän n herkkyys riippuu nukleiinihappojen säilymisests ilymisestä kudoksessa fiksaatio: patologian laboratoriossa käytk ytössä 4% formaldehydi DNA on melko stabiili molekyyli toimii mrna hajotetaan nopeasti entsymaattisesti soluissa nopea fiksaatio/jää äädytys tärket rkeää nukleliinihappojen saavutettavuudesta esikäsittely sittely parantaa koettimien kulkeutumista kudoksessa kuumennuskäsittely sittely entsymaattinen käsittely koettimen leimauksen tehokkuudesta nick-translation random priming synteettiset koettimet + end labeling

11 Menetelmän n herkkyys ja spesifisyys riippuu hybridisaatio-tehokkuudesta tehokkuudesta koettimen suunnittelu (pituus, GC emäsparit) koettimen konsentraatio (liian korkea epäspesif spesif.) formamidi (liian alhainen epäspesif spesif.) suolakonsentraatio (liian korkea epäspesif spesif.) hybridisaatio lämpötila (liian alhainen epäspesif spesif.) ph pesulämp mpötila (liian korkea vääriä negatiivisia) leiman tunnistusmenetelmän n herkkyydestä autofluoresenssi tausta immunohistokemiallisessa leiman tunnistuksessa

12 Sovellukset patologiassa Monistumat Deleetiot Translokaatiot HER-2 onkogeenimonistuma Lymfoomat ja leukemiat Sarkoomat Virtsarakon välimuotoisen v epiteelin kasvaimet Aivokasvaimet: 1p 19 q deleetio Tulevaisuudessa esim. EGFR, topoisomeraasi,, PTEN geenien kopiolukujen tutkiminen tai esim. patogeenien tunnistaminen (papillooma virukset) jne.

13 CISH: HER-2 diploidi

14 CISH: HER-2 geenimonistuma

15 FISH: HER-2

16 HER-2 2 diagnostiikka HER-2 2 statuksen merkitys primää ääri vaiheen syöväss ssä jo useat faasi III vaiheen tutkimukset ovat osoittaneet, että varhaisen vaiheen HER-2 positiivisissa rintasyöviss vissä Herceptin yhdessä kemoterapian kanssa vähentv hentää huomattavasti uusiutumisriskiä verrattuna pelkkää ään kemoterapiaan

17 Vaikutukset HER-2 diagnostiikkaan HER-2 2 määm äärityksen tekeminen heti primää äärivaiheessa mahdollisimman nopeasti korostuu IHC vai CISH/FISH vai molemmat? HER-2 2 ja Ch17 CISH kaikista näytteistn ytteistä Ch17 vai IHC? corebiopsiasta vai tuumoriblokista?

18 FISH: Urovysion Normaalissa interfaasi solussa jokaista tutkittavaa kromosomia ja p16 geeniä on kaksi kopiota; CEP 3 (punainen), CEP 7 (vihreä), CEP 17 (sininen) and LSI p16 (keltainen). 2. Epänormaali tulos: kaksi kopiota kromosomia 3 (punainen), neljä kopiota kromosomia 7 (vihreä), viisi kopiota kromosomia 17 (sininen) ja yksi kopio p16 geeniä (keltainen). 3. Epänormaali tulos: kolme kopiota kromosomia 3 (punainen), 7 (vihreä) ) ja 17 (sininen) ja p16 geenin molempien kopioiden deleetio.

19 Translokaatio

20 Normaali Translokaatio

21 Knuutila; Suomen Lääkärilehti 17/2000

22 Knuutila; Suomen Lääkärilehti 17/2000

23 Ongelmakohdat ISH-tekniikoissa reagenssierien väliset v vaihtelut (etenkin entsyymi) esikäsittely sittely vanhat näytteetn fiksaatioajat? mahdollinen tausta immunovärj rjäyksessä (CISH) autofluoresenssi (FISH) riittämätön n koettimen pesu

24 ISH-näytteiden analysointi Oltava selkeät t kriteerit tulkinnoille solumää äärät signaalit Koulutus ja kokemus tärkeitt rkeitä Esim. HER-2 onkogeenimonistuma TAI >10% tumia, joissa 6 6 HER-2 2 geenikopiota HER-2 2 / kromosomi 17 kopiolukujen suhde 2 Solumää äärä: : 20? 100?

25 ISH - sisäinenlaaduntarkkailu inenlaaduntarkkailu Uuden entsyymierän n ja koettimen testaus ennen käyttk yttöönottoa Lämpötilojen seuranta (denaturaatio( denaturaatio, hybridisaatio,, pesu) Näytteiden kaksoisluenta ajoittain solublokit voivat olla hyviä kontrolleja

26 ISH - ulkoinenlaaduntarkkailu Nordic Quality Control UK NEQAS referenssi laboratoriot

27 DC-CISH CISH eli kaksiväri ri-cish digoxigenin ja biotiini leimattujen koettimien hybridisaatio yhtäaikaisesti Peroksidaasi ja alkaalinen fosfataasi entsyymit käytössä New Fuchin punainen kromogeeni TMB eli tetrametyylibentsidiini - vihreä kromogeeni

28 Laakso et al. J Pathol 2006; 210: 3 9.

29 DC-CISH CISH vs. FISH

30 Lopuksi In situ hybridisaatio menetelmä on kasvava osa-alue alue patologian laboratorioissa Kliinisesti merkittävi viä sovelluksia tulee luultavimmin koko ajan lisää ja tästt stä syystä patologian laboratorioissa tulisi olla hyvä tieto-taito taito ISH asioista

Samankaltaiset tiedostot

Glioomien molekyylidiagnostiikkaa Maria Gardberg TYKS-Sapa Patologia / Turun Yliopisto

Glioomien molekyylidiagnostiikkaa 30.8.2013 Maria Gardberg TYKS-Sapa Patologia / Turun Yliopisto Glioomien WHO-luokitus on morfologinen Gradusten I-IV ryhmittelyn perustana on toiminut ennusteen huononeminen