UUDET TEKNIIKAT SISÄYMPÄRISTÖN MIKROBIEN TOTEAMISESSA

Koko: px

Aloita esitys sivulta:

Download "UUDET TEKNIIKAT SISÄYMPÄRISTÖN MIKROBIEN TOTEAMISESSA"

Heli Lattu
8 vuotta sitten
Katselukertoja:

1 UUDET TEKNIIKAT SISÄYMPÄRISTÖN MIKROBIEN TOTEAMISESSA LIITU-päivä FT Helena Rintala Kansanterveyslaitos, Ympäristöterveyden osasto

2 Mihin sisäympäristön mikrobien mittauksia tarvitaan? Rakennusten kosteus- ja mikrobivaurioiden toteaminen (tutkituista rakennuksista n. 50%:ssa on korjausta vaativia vaurioita) Osana kosteusvauriorakennusten korjausten onnistumisen seurantaa Tutkimustarkoituksiin; ihminen viettää suurimman osan ajastaan sisätiloissa altistuen kaikelle, mitä sisätiloista löytyy, mikrobien terveydellinen merkitys voi olla aiemmin oletettua monimuotoisempi

50%:ssa on korjausta vaativia vaurioita) Osana kosteusvauriorakennusten korjausten onnistumisen seurantaa

3 Mitä voidaan mitata ja miten? Mikrobisolut; määrä, laatu Solun rakenneosat; esim. ergosteroli, muramiinihappo ja 3-OH rasvahapot Aineenvaihduntatuotteet ja toksiinit Viljely, DNApohjaiset, esim. PCR esim. kaasukromatografiamassaspektrometria (GC-MS) esim. GC/LC-MS, immunokemialliset menetelmät tai in vitro-testit

ergosteroli, muramiinihappo ja 3-OH rasvahapot Aineenvaihduntatuotteet ja

4 DNA-pohjaisia menetelmiä sisäilman mikrobien toteamiseen PCR Tietyn DNA alueen monistaminen spesifisten alukkeiden avulla ja monistustuotteen mittaaminen Saadaan tieto yhden mikrobilajin tai ryhmän esiintymisestä / pitoisuudesta näytteessä DNA-siru Menetelmä, jossa lasilevylle kiinnitettyjen spesifisten DNA-koettimien avulla poimitaan näytteestä vastindna, jonka tarttuminen koettimiin todetaan fluoresenssin avulla Saadaan laaja kuva lajistosta, ei määristä

näytteessä DNA-siru Menetelmä, jossa lasilevylle kiinnitettyjen spesifisten DNA-koettimien avulla poimitaan

5 PCR:n toimintaperiaate

6 PCR:n toimintaperiaate

7 Kvantitatiivinen PCR Näytteestä monistetaan PCR:n avulla tiettyä mikrobia tai - ryhmää DNAsekvenssitiedon perusteella suunniteltujen alukkeiden avulla TaqMan-kemiassa lisäksi kaksoisleimattu koetin

8 Kvantitatiivinen PCR PCR -tuotteen monistumisen määrää seurataan fluoresoivien väriaineiden avulla jokaisessa syklissä Kvantitointi tapahtuu joko standardisuoran tai referenssinäytteen perusteella

avulla jokaisessa syklissä Kvantitointi tapahtuu

9 Kvantitatiivinen PCR Tärkeimmille sisäilman homeille on olemassa QPCR testejä (US EPA, ym.) KTL:ssä on kehitetty QPCR menetelmä streptomykeeteille (kosteusvauriota indikoiva bakteeri); myös muille bakteereille kehitteillä Streptomykeetti-PCR:n testaus huonepölynäytteillä (54 kpl): 53 näytettä oli positiivisia, pitoisuus vaihteli /25 mg viljelyllä aktinomykeettejä löytyi 20 näytteessä

muille bakteereille kehitteillä Streptomykeetti-PCR:n testaus huonepölynäytteillä (54 kpl): 53

10 Kvantitatiivinen PCR - yhteenvetoa Alhaisempi detektioraja kuin viljelyllä Nopea QPCR-testi voidaan suunnitella eri taksonomisille tasoille (laji-, suku-, tai ryhmäspesifinen) Vaatii erityisosaamista, laitteet ja reagenssit suhteellisen kalliita Ennen kuin otetaan rutiinikäyttöön, täytyy validoida suuremmilla näyteaineistoilla

ryhmäspesifinen) Vaatii erityisosaamista, laitteet ja reagenssit suhteellisen

11 DNA-sirun toimintaperiaate leima koetin koetin zip-sekvenssi Koettimien sitoutuminen templaatti-dna

12 leima koetin koetin zip-sekvenssi Koettimien sitoutuminen templaatti-dna leima koetinkoetin Ligaatio ligaatiokohta

13 leima koetin koetin zip-sekvenssi Koettimien sitoutuminen templaatti-dna leima koetinkoetin Ligaatio ligaatiokohta Ligaatiotuotteen monistuminen

14 Hybridisaatio sirulle sitoutuneiden ligaatiotuotteiden detektio leiman fluoresenssisignaalin avulla zip-sekvenssi sitoutuu vastinsekvenssiinsä sirulla DNA-siru

15 Esimerkki siruhybridisaatiosta

16 DNA-siru yhteenvetoa Voidaan detektoida paljon lajeja yhdellä kertaa huomattavasti pienemmässä ajassa kuin viljelyllä Vähemmän käsityötä kuin viljelyssä Pitkälle automatisoitavissa Vaatii erityisosaamista ja kalliita laitteita Kvalitatiivinen

viljelyllä Vähemmän käsityötä kuin viljelyssä Pitkälle

17 DNA-siru yhteenvetoa tarvitaan DNA-sekvenssitietoa etukäteen, joka ei ole kaikilta osin vielä kattavaa kaikille lajeille ei luultavasti löydy spesifisiä koettimia Sienten taksonomia perustuu vielä paljolti morfologiaan, DNA-sekvensointi saattaa muuttaa sukulaisuussuhteita

luultavasti löydy spesifisiä koettimia Sienten taksonomia perustuu

18 Sisäilman mikrobien määritys viljelymenetelmällä Homeet: viljely vähintään kahdelle alustalle kasvatus 1 viikko tunnistus mikroskopoimalla sukutasolle, jotkut lajitasolle Bakteerit /sädesienet: viljely, kasvatus 2 viikkoa tunnistus mikroskopoimalla lahkotasolle Muut bakteerit: Ei tunnisteta nykyisin rutiinisti

jotkut lajitasolle Bakteerit /sädesienet: viljely, kasvatus 2 viikkoa

19 Viljely vs. DNA-pohjaiset Löytää vai elinkykyiset Hidas (pitkät; 5-14 vrk, kasvatusajat) Ei vaadi erityisiä laitteita (mikroskooppi) Lajitason tunnistus vaatii huomattavasti lisätyötä Paljon ihmistyötä Vaatii tunnistuksen tekijältä asiantuntemusta Tulkintaohjeet olemassa Löytää kaikki Nopea (vastaus 2-3:ssa päivässä) Vaatii erityislaitteistot ja reagenssit (kustannukset) Lajitason tunnistus mahdollista suoraan Automatisoitavissa Kun menetelmä on ajettu sisään, analyysin voi tehdä rutinoitunut laborantti Ei tulkintaohjeita vielä

tunnistus vaatii huomattavasti lisätyötä Paljon ihmistyötä Vaatii tunnistuksen tekijältä asiantuntemusta Tulkintaohjeet olemassa

20 Mikrobien DNA-pohjaisen detektion hyödyntämismahdollisuuksia Uusia, nopeampia ja tarkempia menetelmiä sisäympäristöjen haitallisten mikrobien toteamiseen Käyttökohteita esim. kosteusvaurioiden toteaminen ja korjausten onnistumisen seuranta Voidaan laajentaa myös muihin ympäristöihin Ennen rutiinikäyttöön ottamista menetelmiä täytyy vielä validoida suuremmilla näyteaineistoilla

kosteusvaurioiden toteaminen ja korjausten onnistumisen seuranta Voidaan laajentaa myös muihin

21 Pienhiukkasten biologisen fraktion mittaaminen ja karakterisointi - BioFine Kansanterveyslaitos Helsingin Yliopisto, Biotekniikan instituutti Helsingin Yliopisto, Fysikaalisten tieteiden laitos DNA-siru sisäympäristöjen haitallisten mikrobien toteamiseen Kansanterveyslaitos Helsingin Yliopisto, Biotekniikan instituutti Yrityksä

22 Tutkijan näkökulma hyödyntämiseen Hyödyntäminen on ok, mutta: Yrityskumppaneita on vaikea löytää Sopivia ei ole (ainakaan Suomessa) Yritysten haluttomuus rahoitukseen Patentointi hidastaa julkaisemista Markkinat Suomessa ovat pienet

Samankaltaiset tiedostot

Materiaalinäytteiden qpcr-tulosten tulkinnasta

Materiaalinäytteiden qpcr-tulosten tulkinnasta Helena Rintala ja Teija Meklin Sisäilmastoseminaari 13.3.2014 Taustaa qpcr (kvantitatiivinen PCR) on nopea menetelmä mikrobien toteamiseen Käytetty paljon