GMO analytiikka Annikki Welling Kemian tutkimusyksikkö Evira

Transkriptio

1 GMO analytiikka Annikki Welling Kemian tutkimusyksikkö Evira

2 Millaisia GM kasvit ovat ja kuinka tätä käytetään hyväksi analytiikassa Aromaattisten aminohappojen biosynteesireitti kasvissa Kasvi tarvitsee EPSPS-entsyymiä (5-enolipuryvyylishikimaatti-3- fosfaatti syntaasi) aromaattisten aminohappojen, vitamiinien ja monien sekundäärimetaboliittien synteesiin. shikimaatti shikimaatti-3-fosfaatti Kasvin oma EPSPS 5-enolipuruvyyli shikimaatti-3-fosfaatti korismiinihappo prefeenihappo antraniilihappo fenyylialaniini tyrosiini tryptofaani

3 Glyfosaatti Glyfosaatti: kasvintorjuntaaine, joka kulkeutuu koko kasviin ja estää kasvin oman EPSPS-entsyymin toiminnan Biosynteesireitin loppuosakaan ei toimi kasvi lakastuu shikimaatti shikimaatti-3-fosfaatti Kasvin oma EPSPS glyfosaatti 5-enolipuruvyyli shikimaatti-3-fosfaatti korismiinihappo prefeenihappo antraniilihappo fenyylialaniini tyrosiini tryptofaani

4 RR-soija (40-3-2) RR-soijaan on siirretty CP4 Agrobakteerikannan mutatoitunut EPSPS entsyymi, joka ei ole herkkä glyfosaatille. Siirretty geeni ja kasvin oma geeni toimivat kasvissa yhtä aikaa, molempia proteiineja tuotetaan. Vaikka glyfosaatti estää kasvin oma EPSPS enstyymin toiminnan, siirretyn geenin tuottama EPSPS entsyymi toimii ja kasvi kestää glyfosaattia. shikimaatti shikimaatti-3-fosfaatti Kasvin oma EPSPS glyfosaatti 5-enolipuruvyyli shikimaatti-3-fosfaatti korismiinihappo prefeenihappo antraniilihappo fenyylialaniini tyrosiini tryptofaani Mutatoituneessa EPSPS entsyymissä on vain muutaman aminohapon muutos.

5 GM kasvit voidaan tunnistaa siirretyn DNA:n avulla selektiogeeni geeni, jolla saadaan aikaan haluttu ominaisuus Mutatoitunut kohta siirretyssä geenissä kasvi DNA P35S NPTII NOS-T P ctp2 EPSPS T kasvi DNA promoottori, laittaa geenin päälle terminaattori, ilmoittaa mihin geeni loppuu kullakin geeninsiirtotapahtumalla on spesifinen kohta kasvigenomissa, mihin siirretty geenikasetti on integroitunut siirretty geenikasetti 2-5 kb

6 GM analytiikka perustuu DNA:n monistamiseen Alukkeiden avulla määritetään DNA alue, joka monistetaan PCR:llä. PCR:ssä DNA monistuu eksponentiaalisesti ja monistuva DNA pystytään visualisoimaan fluoresoivien väriaineiden avulla. kasvi DNA P35S NPTII NOS-T P ctp2 EPSPS T kasvi DNA Referenssigeeni, kasvilaji Skriinauselementti Konstruktispesifinen tapahtumaspesifinen

7 Identifiointi skriinaustuloksen perusteella soijan GM tapahtumat skriinauselementit Vihreä: GM tapahtuma sisältää ko. GM elementin Oranssi: GM tapahtuma ei sisällä ko. GM elementtiä Jos useampi skriinauselementti on positiivinen, kaikki sen sisältävät GM tapahtumat on tarkistettava. Jos jokin GM tapahtumassa oleva skriinauselementti on negatiivinen, sitä ei tarvitse tarkistaa.

8 GM rehunäytteiden analysointi Näytteet ottaa Eviran kouluttama näytteenottaja. 50 tn rehua 2 x 4 kg näyte (osanäytteet rehuvirrasta) Välineet ja tilat puhdistetaan natriumhypokloriitilla tai DNA-exituksella. Koko laboratorioon saapunut näyte jauhetaan. Näyte supistetaan ja jaetaan A, B ja C laboratorionäytteeksi á 1 kg

9 GM rehunäytteiden analysointi 1-5 g laboratorionäytettä otetaan DNA eristykseen. Kaksi rinnakkaista eristystä. DNA ja PCR reaktion komponentit pipetoidaan PCR levylle. n. 100 ng DNA:ta / kaivo Näytteet ovat valmiita analysoitavaksi reaaliaikaisella PCR:llä.

10 GM näytteiden analysointi Reaaliaikainen PCRlaite. GM ainekset skriinataan, identifioidaan ja tarvittaessa kvantitoidaan.

11 Suhteellinen kvantitointi 100 % soijaa 0 % GM soijaa 100 % soijaa 10 % GM soijaa 90 % maissia 10 % soijaa 10 % GM soijaa

12 Suhteellinen kvantitointi 99 % maissia 1 % soijaa 100 % GM soijaa

13 Näytteessä useita GM tapahtumia: 100 % soijaa Näytteessä GM tapahtumat MON87701 ja MON89788 Analyysissä tulokseksi saadaan % % Yhteensä 14 %

14 GM risteytykset: 100 % soijaa risteytys, jossa on risteytetty MON87701 x MON89788 Analyysissä tulokseksi saadaan % % Yhteensä 14 % oikea GM pitoisuus 7 % Tulkittava 7 %?

15 GM risteytykset: 100 % soijaa risteytys, jossa on risteytetty MON87701 x MON89788 Analyysissä tulokseksi saadaan % % Yhteensä 17 % oikea GM pitoisuus 10 % Tulkittava 10 %?

16 GM pitoisuuden laskeminen GM soijanäytteessä Standardisuora GM tapahtuma näyte Tiedetään kuinka paljon DNA:ta standardisuoran näytteissä on. Thresholdin kohdalla katsotaan paljonko näytteessä on GM tapahtuman DNA:ta ja referenssigeenin DNA:ta (soijaa). Lasketaan Standardisuora soijan referenssi GM tapahtuman DNA:n määrä soijan DNA:n määrä X 100 % näyte

17 Merkintäraja 0,9 % ja mittausepävarmuus Mittausepävarmuus on yleensä n % GM analyyseissä Jotta merkintäraja ylittyy mittausepävarmuus huomioon ottaen, pitoisuuden oltava ainakin 1,26 % (0,9 % + 0,36 0,45).

18 Uuden polven GM kasvit Kasvin oma geeni mutatoidaan kohdennetusti. Kasviin ei jää jälkiä siirretystä geenistä, kasvi kestää glyfosaattia. Mutatoituneita kasvin omia geenejä on erittäin vaikea havaita DNA:n perusteella. EPSPS kasvi DNA shikimaatti shikimaatti-3-fosfaatti Kasvin oma EPSPS glyfosaatti 5-enolipuruvyyli shikimaatti-3-fosfaatti korismiinihappo prefeenihappo antraniilihappo fenyylialaniini tyrosiini tryptofaani