(12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B. Patentti myönnetty - Patent beviljats. Kv.lk.7 - Intk1.7

Transkriptio

1 (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT F (10) FI B SUOMI - FINLAND (FI) PATENTTI- JA REKISTERINALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (45) (51) (21) (22) (24) (41) Patentti myönnetty - Patent beviljats Kv.lk.7 - Intk1.7 A61K 39/29, 39/395, C12Q 1/70, C07K 7/10 Patenttihakemus - Patentansökning Hakemispäivä - Ansökningsdag Alkupäiva - Löpdag Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (86) Kv. hakemus - Int ansökan PCT/US88/04126 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P US P US P US P US P US P (73) Hakija - Innehavare 1 Chiron Corporation, Delaware, 4560 Horton Street, Emeryville, CA 94608, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksiä - Uppfinnare 1 Houghton,Michael, 53 Rosemead Court, Danville, CA 94526, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 2 Choo,Qui-Lim, 5700 Fern Street, EI Cerrito, CA 94530, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 3 Kuo,George, 1370 Sixth Avenue, San Francisco, CA 94122, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (74) Asiamies - Ombud: Ruska & Co Oy Runeberginkatu 5, Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning NANBV-polypeptidejä, Immunologisia määritysmenetelmiä Ja välineitä NANBV polypeptider, immunologiska bestämningsmetoder och utrustning (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer EP A (A61K 39/29), EP A (GO1N 33/576), EP A (C12N 15/00), USA (A61K 39/12), US A (A61K 39/29), WO A 82/00205 (GO1N 33/54), WO A 82/02774 (GO1N 33/54), WO A 82/03330 (A61K 39/29), WO A 87/05930 (C12N 5/00), Gastroenterology vol. 77 (1979) nro 5 p. A33, Naturwissenschaft vol. 73 (1986) nro 1 p (57) Tiivistelmä - Sammandrag Esitetään cdna-sekvenssien perhe, joka on peräisin hepatitis-c-viruksesta (HCV). Nämä sekvenssit koodaavat antigeenejä, jotka reagoivat immunologisesti vastaaineiden kanssa, jotka ovat läsnä yksitöissä, joilla on hepatitis, joka ei ole A- eikä 8-tyyppiä (NANBH), mutta jotka ovat yleisesti poissa yksilöistä, joilla on hepatitis-a-viruksen (HAV) tai hepatitis-b-viruksen (HBV) infektio ja joita ei myöskään ole vertailuyksilöissä. Näiden cdna-sekvenssien vertailu Genebank'in ja hepatitis-delta-viruksen (HDV) ja HBV:n kanssa osoittaa olennaisen homologian puutteen. cdna:han koodattujen aminohapposekvenssien vertailu Flavivirusten sekvenssien kanssa merkitsee, että HCV on Flavivirus tai Flavi-tyyppinen virus. HCV:n cdna-sekvenssit ovat hyödyllisiä polynukleotidikoettimien suunnittelussa ja sellaisten polypeptidien synteesissä, joita voidaan käyttää immunologisissa analyyseissä. Sekä polynukleotidikoettimet että polypeptidit voivat olla hyödyllisiä HCV:n aiheuttaman NANBH:n diagnosoinnissa ja veripankkierien ja luovuttajien seulonnassa HCV-infektion suhteen. Lisäksi nämä cdna-sekvenssit voivat olla hyödyllisiä i mmunogeenisten polypeptidien synteesissä, joita polypeptidejä voidaan käyttää rokotteissa HCV-infektion hoitamiseen, ennaltaehkäisyyn ja/tai terapiaan. cdna-sekvensseihin koodattuja polypeptidejä voidaan m yös käyttää synnyttämään vasta-aineita HCV-antigeejä vastaan ja HCV-antigeenejä vastaan suunnattujen vasta-aineiden puhdistamiseen. Nämä vasta-aineet voivat olla

2 1 hyödyllisiä immunologisissa analyyseissa NANBH:hon liittyvien vasta-aineiden osoittamiseksi yksilöisså ja veripankkiluovutuksissa. Edelleen rusitå vasta-aineita voidaan kilyttåå NANBH:n hoitamiseen yksilöisså. Keksinnön antamat reagenssit tekevat myös mahdolliseksi NANBH-aineiden eristdmisen ja näiden aineiden lisååmisen kudosviljelyjårjestelmisså. lisäksi ne antavat reagensseja, jotka ovat hyödyllisiä seulottaessa HCV:n viruksenvastaisia aineita kudosviljely- tai elainmallijarjestelmissa. 10E652 En cdna-sekvensfamilj presenteras, vilken härstammar från hepatitis-c-viruset (HCV). Dessa sekvenser ködar antigener, vilka reagerar immunologiskt med antikroppar som är närvarande i individer med hepatitis, som inte är av A- eller B-typ (NANBH), men som generellt inte förekommer i individer som har en infektion av hepatitis-a-virus (HAV) eller hepatitis-b-virus (HBV)', och vilka inte Keller finns i referensindivider. En jämförelse av dessa cdna-sekvenser med Genebanks hepatitis-delta-virus (HDV) och HBV visar en brist på väsentlig homologi. En jämförelse mellan cdna kodade aminoyresekvenser och Flavivirus sekvenser visar att HCV är Flavivirus eller ett virus av Flavi typ. HCV:s cdna-sekvenser är nyttiga vid planeringen av polynukleotidsonderare och vid syntes av sidana polypeptider som kan användas vid immunologiska analyser. Såväl polynukleotidsonderarna som polypeptiderna kan vara nyttiga vid diagnos av NANBH som förorsakats av HCV och vid granskning av blodbankspartier och blodgivare i fråga om HCV-infektion. Dessutom kan dessa cdnasekvenser vara nyttiga vid syntes av immunogena polypeptider, vilka kan användas vid vaccinering för behandling, preventivvård och/eller terapi av Polypeptider, som är kodade ser kan också användas för HCV-infektion. i cdna-sekvenatt framställa antikroppar mot HCV-antigener och för rengöring av antikroppar som riktas mot HCV-antigenerna. Dessa antikroppar kan vara nyttiga vid immunologisk analys i individer och i blod vid blodbanker för att påvisa förekomsten av antikroppar som binds till NANBH. Vidare kan dessa antikroppar användas för att behandla RANBH i individer. Reagenserna enligt uppfinningen möjliggör även en isolering av NANBH-ämnen och en tillsats av dessa ämnen till vävnadsodlingssystem. Dessutom ger de reagenser som är nyttiga vid granskning av ämnen som är riktade mot HCV virus i vävnadsodlingseller djurmodellssystem.

3 NANBV-polypeptidejä, immunologisia määritysmenetelmiå ja välineitä Keksintö koskee materiaaleja ja metodologiaa hepatitisvirustartunnan, joka ei ole tyyppiä A tai B (NANBV), levinneisyyden selvittämiseksi. Tarkemmin se koskee diagnosti- 5 sia proteiineja ja diagnostisia vasta-aineita NANB-hepatitiksen, s.o. hepatitis C-viruksen etiologista ainetta varten. Selitykseqsä viitataan qe.nraaviin julkaiquibin Barr et al. (1986), Biotechniques 4: Botstein (1979), Gene 8:17. Brinton, M.A. (1986), julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss Broach (1981) julkaisussa Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Vol.1, 15 s.445, Cold Spring Harbor Press. Broach et al. (1983), Meth. Enz. 101:307. Chang et al. (1977), Nature.198:1056. Chirgwin et al. (1979), Biochemistry 18:5294. Chomczynski and Sacchi (1987), Analytical Biochemistry 162: Clewell et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62:1159. Clewell (1972), J. Bacterio1.11.0:667. Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110. Cousens et al. (1987), Gene 61:265. De Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA Dreesman et al. (1985), J. Infect. Disease Feinstone, S.M. and Hoofnagle, J.H. (1984), New Engl. J. Med. 311:185. Fields & Knipe (1986), FUNDAMENTAL VIROLOGY (Raven Press, N.Y.) Fiers et al. (1978), Nature 221:113. Gerety, R.J. et al. julkaisussa VIRAL HEPATITIS AND LIVER DISEASE (Vyas, 30 B.N., Dienstag, J.L., and Hoofnagle, J.H., toim., Grune and Stratton, Inc., 1984) ss Goeddel et al. (1980), Nucleic Acids Res. 8:4057. Graham and Van der Eb (1978), Virology 52:546. Grunstein and Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: Grych et al. (1985), Nature 116:74. Gubler and Hoffman (1983), Gene 25:263. Hammerling et al. (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL

4 HYBRIDOMAS. Hess et al. (1968), J. Adv. Enzyme Reg. 2:149. Hinnen et al. (1978), Proc. Nati. Acad. Sci. 25:1929. Hitzeman et al. (1980), J. Biol. Chem Holland et al. (1978), Biochemistry 12:4900. Holland (1981), J. Biol. Chem. 256:1385. Houghton et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9:247. Hunyh, T.V. et al. (1985), julkaisussa DNA CLONING TECHNIQUES; A PRACTICAL APPROACH (D. Glover, toim., IRL Press, Oxford, U.K.), ss Immun. Rev. (1982) 62:185. Iwarson (1987), British Medical J Kenneth et al. (1980), MONOCLONAL ANTIBODIES. Laenunli (1970), Nature 22.7_, 680. Lee et al. (1988), Science Maniatis, T. et al. (1982), MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Mayer and Walker, toim. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London). Maxam et al. (1980), Methods in Enzymology 65: MacNamara et al. (1984), Science Messing et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9:309. Messing (1983), Methods in Enzymology 10.L: METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press). Michelle et al., Int. Symposium on Viral Hepatitis. 25 Monath (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss Nagahuma et al. (1984), Anal. Biochem. 141:74. Neurath et al. (1984), Science Nisonoff et al. (1981), Clin. Immunol. Immunopathol. 21: Overby, L.R. (1985), Curr. Hepatol. 5:49. Overby, L.R. (1986), Curr. Hepatol. 6:65. Overby, L.R. (1987), Curr. Hepatol. 7:35. Peleg (1969), Nature Pferrerkorn and Shapiro (1974), julkaisussa COMPREHENSIVE VIROLOGY, Vol.2 (Fraenkel-Conrat& Wagner, toim., Plenum, N.Y.) ss Prince, A.M. (1983), Annu. Rev. Microbiol. 37:217.

5 10E652 Rice et al. (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss Roehrig (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND 5 FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press). Sadler et al. (1980), Gene 8,279. Saiki et al. (1986), Nature Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: Schlesinger et al. (1986), J. Virol. 60:1153. Schreier, M., et al. (1980), HYBRIDOMA TECHNIQUES. Scopes (1984), PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND PRACTICE, SECOND EDITION (Springer-Verlag, N.Y.). Shimatake et al. (1981), Nature Steimer et al. (1986), J.Virol..58:9. Stollar (1980), julkaisussa THE TOGAVIRUSES (R.W. Schlesinger, toim., Academic Press, N.Y.), ss Taylor et al. (1976), Biochem. Biophys. Acta 442:324. Towbin et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 26: Tsu and Herzenberg (1980), julkaisussa SELECTED METHODS IMMUNOLOGY (W.H. Freeman and Co.) ss Vytdehaag et al. (1985), J. Immunol. 114:1225. Valenzuela, P., et al. (1982), Nature 298:344. Valenzuela, P., et al. (1984), julkaisussa HEPATITIS B (Millman, I., et al., toim., P1e- 25 num Press) ss Warner (1984), DNA 3:401. Wu and Grossman (1987), Methods in Enzymology, Vol. 154, RECOMBINANT DNA, Part E. Wu (1987), Methods in Enzymology, Vol. 155, RECOMBINANT DNA, osa F. 30 Zoller (1982), Nucleic Acids -Res. 10:6487. IN CELLULAR 35 Viitataan myös seuraaviin US-patentteihin: 4,341,761; 4,399,121;. 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632 ja 4,493,890. Hepatitis, joka ei ole tyyppiä A eikä B (NANBH) on tarttuva tauti tai tautiperhe, jonka uskotaan olevan viruksen aiheuttama ja joka on erotettavissa muista viruksen aiheutta-

6 mista maksasairauksien muodoista, mukaanlukien sen, jonka aiheuttavat tunnetut hepatitisvirukset, s.o. hepatitis-a-virus (HAV), hepatitis-b-virus (HBV) ja deltahepatitisvirus (HDV), samoin kuin cytomegaloviruksen (CMV) ja Epstein-Barr-viruksen (EBV) aiheuttamat hepatitikset. NANBH tunnistettiin ensin verensiirtopotilaissa. Tarttuminen 5 ihmisestä simpanssiin ja massatartunta simpanssien joukossa antoivat todisteita, että NANBH:n syy on siirtyvä infektioaiheuttaja tai -aiheuttajat. Kuitenkin NANBH:n aiheuttavaa siirtyvää aiheuttajaa ei ole vieläkään määritetty ja taudin aiheuttavien aineiden lukumäärä on tuntematon. 10 Epidemiologisista todisteista voidaan tehdä ehdotelmia, että voi olla kolmentyyppistä NANBH:a: vedessä syntynyt epideeminen tyyppi; vereen tai neulaan liittyvä tyyppi; ja satunnaisesti esiintyvä (yhteisön hankkima = community acquired) tyyppi. Kuitenkin niiden aineiden lukumäärä, jotka voivat aiheuttaa NANBH:n on tuntematon. 15 Kliininen NANBH:n diagnoosi ja tunnistus on tehty etupäässä sulkemalla pois muut virusmerkkiaineet. Niiden menetelmien joukossa, joita käytetään havaitsemaan oletettuja NANBV-antigeenejä ja vasta-aineita ovat agargeelidiffuusio, vastaimmunoeletroforeesi, immunofluoresenssimikroskopia, immunoelektronimikroskopia. radioimmunologinen analyysi ja entsyymiin kytketty immunosorbenttianalyysi. Kuiten- 20 kaan mikään näistä analyyseistä ei ole osoittautunut olevan riittävän herkkä, spesifinen ja toistettava käytettäväksi NANBH:n diagnostisena kokeena. Tähän mennessä ei ole ollut selvyyttä eikä sopimusta NANBH:n aiheuttajiin liittyvien antigeeni-vasta-ainejärjestelmien identtisyyden tai spesifisyyden suhteen. Tämä johtuu 25 ainakin osittain siitä, että henkilöillä on ennalta tai samanaikaisesti NANBV:n kanssa saatu HBV-tartunta ja liukoisten ja partikkelimuotoisten HBV:een liittyvien antigeenien tunnetusta monimutkaisuudesta ja myös HBV:n DNA:n integraatiosta maksasolujen genomiin. Lisäksi on mahdollisuus, että NANBH:n aiheuttaa useampi kuin yksi infektoiva aine, minkä lisäksi on mahdollista, että NANBH on diagnosoitu väärin. Edelleen 30 on epäselvää, mitä serologiset analyysit havaitsevat NANBH-potilaiden seerumista. On väitetty, että agargeelidiffuusio-ja vastaimmunoelektroforeesianalyysit havaitsevat autoimmuunivasteita tai epäspesifisiä proteiinien keskinäisiä reaktioita, joita esiintyy seeruminäytteiden välillä ja että ne eivät edusta spesifisiä NANBV-antigeeni-vastaainereaktioita. Immunofluoresenssi ja entsyymin kytketty immunosorbentti ja radioim- 35 munologiset analyysit näyttävät havaitsevan alhaisia reumatekijän kaltaisen materiaalin tasoja, jota on tavantakaa läsnä sellaisten potilaiden seerumissa, joilla on NANBH, samoin kuin myös potilaissa, joilla on muita maksasairauksia tai maksaan liittymättömiä

7 sairauksia. Jonkin verran havaittua reaktiivisuutta voi edustaa vasta-ainetta isännän määrittämille sytoplasmisille antigeeneille. 5 On olemassa lukumäärä NANBV-ehdokkaita. Katso esimerkiksi selontekoja Prince (1983), Feinstone ja Hoofnagle (1984) ja Overby (1985, 1986, 1987) ja Iwarsonin (1987) artikkelia. Kuitenkaan ei ole mitään todistetta, että mikään näistä ehdokkaista edustaisi NANBV:n etiologista aiheuttajaa. 10 Vaatimus herkistä, spesifisistä menetelmistä NANBV:n kantajien ja NANBV:n saastuttaman veren tai verituotteiden seulomiseksi tai tunnistamiseksi on huomattava. Verensiirron jälkeinen hepatitis (Post Transfusion Hepatitits PTH) esiintyy noin 10 %:lla verensiirron saaneista potilaista ja NANBH:n aiheuttamia näistä tapauksista on jopa 90 %. Pääongelma tässä taudissa on sen tavanomainen eteneminen kroonisiksi maksavaurioik- 15 si (25-55 %). Potilashuolto sekä NANBH:n tarttumisen estäminen veren tai verituotteiden tai läheisen henkilökohtaisen kontaktin välityksellä vaatii luotettavia diagnostisia ja ennustavia välineitä NANBV:hen liittyvien nuldeiinihappojen, antigeenien ja vasta-aineiden havaitse- 20 miseksi. Keksintö liittyy vastikään keksityn NANBH:n etiologisen aiheuttajan, hepatitis C- viruksen (HCV), eristämiseen ja kuvaamiseen. Tarkemmin keksintö antaa HCVgenomin osien cdna-kopioiden perheen. Nämä cdna-kopiot eristettiin tekniikalla, 25 joka sisälsi uuden vaiheen, jossa seulottiin ekspressiotuotteita cdna-kirjastoista, jotka oli luotu hiukkasmaisesta aiheuttajasta kudoksesta, joka oli tartutettu NANBV-potilaiden seerumilla sellaisten vastasyntetisoitujen antigeenien havaitsemiseksi, jotka ovat peräisin tähän asti eristämättömän tai kuvaamattoman virusaiheuttajan genomista ja sellaisten kloonien valitsemieksi, jotka tuottavat tuotteita, jotka reagoivat immunologi- 30 sesti vain tartutettujen yksilöiden seerumien kanssa, verrattuna tartuttamatomiin yksilöihin. Tutkimukset HCV:n genomin luonteesta käyttäen koettimia, jotka ovat peräisin HCV:n cdna:sta, ehdottavat, että HCV on Flavivirus tai Flavi-tyyppinen virus. 35 HCV:stä peräisin olevien cdna-sekvenssien osat ovat hyödyllisiä koettimia viruksen näytteissäolon diagnosoimiseksi ja luonnollisesti esiintyvien viruksen muunnoksien eristämiseksi. Nämä cdna:t tuovat myös saataville HCV-genomiin koodattujen HCV-

8 antigeenien polypeptidisekvenssit ja sallivat sellaisten polypeptidien tuottamisen, jotka ovat hyödyllisiä standardeina tai reagensseina diagnostisissa testeissä. Vasta-aineet, sekä polyklonaaliset että monoldonaaliset, jotka on kohdistettu HCV-epitooppeja vastaan, jotka sisältyvät näihin polypeptidisekvensseihin, ovat hyödyllisiä diagnostisia tes- 5 tejä varten, virustenvastaisien aineitten seulomiseen ja sellaisen NANBV-aiheuttajan eristämiseksi, josta nämä cdna:t ovat peräisin. Lisäksi käyttämällä näistä cdna:oista johdettuja koettimia, on mahdollista eristää ja sekventoida muita HCV-genomin osia, edistäen näin lisäkoettimien ja polypeptidien saamista, jotka ovat hyödyllisiä NANBH:n diagnoosissa. 10 Keksinnön kohteita ovat: polypeptidivalmiste puhdistetusta HCV:stä; puhdistettu HCVpolypeptidi; puhdistettu polypeptidi, joka käsittää epitoopin, joka on immunologisesti määritettävissä HCV:n sisältämällä epitoopilla. 15 Keksintöön sisältyviä seikkoja ovat yhdistelmä-hcv-polypeptidi; yhdistelmäpolypeptidi, joka muodostuu sekvenssistä, joka on peräisin HCV-genomista tai HCVcDNA:sta; yhdistelmäpolypeptidi, joka muodostuu HCV-epitoopista; ja fuusiopolypeptidin, joka muodostuu HCV-polypeptidistä. 20 Keksintöön sisältyvät myös monoklonaalinen vasta-aine, joka on suunnattu HCVepitooppia vastaan; ja puhdistettu polyldonaalisten vasta-aineitten valmiste, joka on suunnattu HCV-epitooppia vastaan. Ne keksinnön kohteet, jotka koskevat välinesarjoja, ovat seuraavia: näytteiden analy- 25 sointi sellaisten polynukleotidien läsnäolon osoittamiseksi, jotka ovat peräisin HCV:stä, joka käsittää polynukleotidikoettimen, joka sisältää noin 8:n tai lukuisampien nukleotidien HCV:n nukleotidisekvenssin sopivassa astiassa; näytteiden analysointi sellaisen HCV-antigeenin osoittamiseksi, joka on suunnattu havaittavaa HCV-antigeeniä vastaan, sopivassa astiassa; näytteiden analysointi sellaisten vasta-aineiden osoittamiseksi, jotka 30 on suunnattu HCV-antigeeniä vastaan, joka käsittää polypeptidin, joka sisältää HCVantigeenissä läsnäolevan HCV-epitoopin, sopivassa säiliössä. 35 jaan. Muita keksinnön seikkoja ovat: polypeptidi, joka muodostuu HCV-epitoopista kiinnittyneenä kiinteään kantaja; ja HCV-epitoopin vasta-aine kiinnittyneenä kiinteään kanta- Keksintö sisältää myös menetelmän HCV-nukleiinihappojen havaitsemiseksi näyttees-

9 ' sä, käsittäen sen, että annetaan näytteen nuldeiinihappojen reagoida HCVpolynukleotidia varten olevan koettimen kanssa olosuhteissa, jotka sallivat polynukleotididupleksin muodostumisen koettimen ja näytteestä tulevan HCV-nukleiinihapon välille; ja osoitetaan koettimen sisältävä polynukleotidi. Keksintöön sisältyy myös immunologisia analyysejä. Nämä sisältävät immunologisen analyysin HCV-antigeenin osoittamiseksi, käsittäen sen, että inkuboidaan näytettä, jonka epäillään sisältävän HCV-antigeeniä, koettimen kanssa, joka on suunnattu osoitettavaa HCV-antigeenia vastaan olosuhteissa, jotka sallivat antigeeni-vasta-ainekompleksin 10 muodostumisen; ja sen että osoitetaan koettimen vasta-aineen sisältävä antigeeni-vastaainekompleksi. Immunologinen analyysi HCV-antigeeniä vastaan suunnattujen vastaaineiden osoittamiseksi käsittää sen että inkuboidaan näytettä, jonka epäillään sisältävän anti-hcv-vasta-aineita yhdessä koetinpolypeptidin kanssa, joka sisältää HCV:n epitoopin, olosuhteissa, jotka sallivat vasta-aine-antigeenikompleksin muodostumisen; ja sen 15 että osoitetaan koetinantigeenin sisältävä vasta-aine-antigeenikompleksi. 20 Kuvio 1 esittää kloonissa olevan HCV:n cdna-insertin kaksoiskierteisen nukleotidisekvenssin ja siihen koodattin polypeptidin oletetun aminohapposekvenssin. Kuvio 2 esittää HCV:n cdna-sekvensien homologien päällekkäisyyttä klooneissa ,81, 1-2 ja 91. Kuvio 3 esittää päällekkäisistä klooneista 81, 1-2 ja 91 peäisin olevaa HCV:n cdna:n 25 yhdistelmäsekvenssiä ja siihen koodattua aminohapposekvenssiä. Kuvio 4 esittää HCV:n Idoonissa 81 olevan cdna-insertin kaksoiskierteellistä nukleotidisekvenssiä ja sinne koodatun polypeptidin oletettua aminohapposekvenssiä Kuvio 5 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 36, segmenttiä, joka menee pääl- lekkäin NANBV:n cdna:n kanssa kloonissa 81 ja Idooniin 36 koodattua polypeptidisekvenssiä. Kuvio 6 esittää yhdistettyä avointa lukurakennetta HCV:n cdna:oista klooneissa 36 ja ja siihen koodattua polypeptidiä. Kuvio 7 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 32, segmenttiä, joka menee pääl-

10 lekkäin kloonin 81 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä. 5 Kuvio 8 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 35, segmenttiä, joka menee päällekäin kloonin 36 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä. Kuvio 9 esittää HCV:n cdna:oiden yhdistettyä avointa lukurakennetta klooneissa 35, 36, 81 ja 32 ja siihen koodattua polypeptidiä. Kuvio 10 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissä 37b, segmenttiä, joka menee pääl- 10 lekkäin kloonin 35 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä. Kuvio 11 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissä 33b, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 32 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä. 15 Kuvio 12 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissä 40b, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 37b kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä. 20 Kuvio 13 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissä 25c, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33b kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä. Kuvio 14 esittää avoimen lukurakenteen, joka ulottuu HCV:n cdna:oiden kautta klooneissa 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b ja 25c, nukleotidisekvenssiä ja siihen koodattua polypeptidiä. 25 Kuvio 15 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissä 33c, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonien 40b ja 33c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. 30 Kuvio 16 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 8h, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 17 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 7e, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 8h kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 18 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 14c, segmenttiä, joka menee pääl- 35 lekkäin kloonin 25c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 19 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 8f, segmenttiä, joka menee pääl-

11 lekkäin kloonin 14c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. 5 Kuvio 20 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 33f, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 8f kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 21 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 33g, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33f kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 22 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 7f, segmenttiä, joka menee pääl- 10 lekkäin kloonin 7e kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 23 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 1 lb, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 7f kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. 15 Kuvio 24 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 14i, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin llb kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. 20 Kuvio 25 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 39c, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33g kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 26 esittää HCV:n yhdistelmä-cdna-sekvenssiä, joka on peräisin kohdakkain olevista cdna:oista klooneissa 14i, 1 lb, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f ja 33g; esitettynä on myös sieltä peräisin olevassa sekvenssissä olevaan laajennettuun avoimeen lukurakenteeseen koodatun polypeptidin aminohapposekvenssi. 25 Kuvio 27 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 12f, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 14i kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. 30 Kuvio 28 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 35f, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 39c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 29 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 19g, segmenttiä, joka menee päällekkäin klovnin 35f kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 30 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 26g, segmenttiä, joka menee pääl- 35 lekkäin kloonin 19g kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 31 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 15e, segmenttiä, joka menee pääl-

12 lekkäin kloonin 26g kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. 5 ja. Kuvio 32 esittää yhdistelmä-cdna:n sekvenssiä, joka on peräisin kohdakkain olevista klooneista 12f - 15e suunnassa 5' -3; se esittää myös ORF:ään koodattuja aminohappo- Kuvio 33 esittää valokuvaa fuusioproteiinin SOD-NANB5_,.., NANB:llä, HAV:llä ja HBV:llä infektoitujen simpanssien seerumin kanssa. Western-blotteja BB- 10 Kuvio 34 esittää valokuvaa fuusioproteiinin SOD-NANB5.1.1 Western-bloteista NANBV:llä, HAV:llä ja HBV:llä infektoitujen ihmisten ja kontrolli-ihmisten seerumin kanssa Kuvio 35 on kartta, joka esittää vektorin pab24 merkittävät piirteet. Kuvio 36 esittää fuusiopolypeptidin C100-3 karboksipään oletetusta aminohapposekvenssistä ja sitä koodaavaa nukleotidisekvenssiä. Kuvio 37A on valokuva coomassiesinisellä värjätystä polyakryyliamidigeelistä, joka identifioi hiivassa elcspressoitua C100-3:a. Kuvio 37B esittää C100-3:n Western-blottia NANBV:llä tartutetun ihmisen seerumin kanssa. Kuvio 38 esittää autoradiografin Northern-blotista RNA:lle, joka on eristetty BB- 25 NANBV-tartutetun simpanssin maksasta ja jossa koettimena on kloonin 81 BB- NANBV:n cdna. 30 Kuvio 39 esittää autoradiografin NANBV-nukleiinihaposta, jota on käsitelty ribonukleaasi A:lla tai deoksinukleaasi I:llä ja jossa koettimena on klooni 81:n NANBV:n cdna. Kuvio 40 esittää autoradiografin nuldeiinihapoista, jotka on uutettu NANBV-. partikkeleista, jotka on saatu infektoidusta plasmasta anti-nanb5.1.1:11a ja jossa koettimena on 32P-leimattu kloonin 81 NANBV:n cdna. 35 Kuvio 41 esittää autoradiografeja suodattimista, jotka sisältävät eristettyjä NANBVnuldeiinihappoja, joissa koettimena on 32P-leimattuja plus- ja - kierteisiä DNAkoettimia, jotka ovat peräisin kloonin 81 NANBV:n cdna:sta.

13 11 Kuvio 42 esittää HCV:n cdna:ssa koodattujen polypeptidien ja Dengue-flaviviruksen NS-proteiinin väliset homologit. 5 Kuvio 43 esittää histogrammin HCV-infektion jakaantumisesta satunnaisissa näytteissä määritettynä ELISA-seulonnalla. Kuvio 44 esittää histogrammin HCV-infektion jakaantumisesta satunnaisissa näytteissä käyttäen kahta immunoglobuliini-entsyymikonjugaatin konfiguraatiota ELISA-ana- 10 lyysissä. Kuvio 45 esittää primeriseoksen sekvenssejä, jotka ovat peräisin säilyvistä sekvensseistä flavivirulcsien NS1:ssä. 15 Kuvio 46 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa k9-1, segmenttiä, joka menee päällekkäin kuviossa 26 esitetyn cdna:n kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. 20 pot. Kuvio 47 esittää sekvenssiä yhdistelmä-cdna:ssa, joka on peräisin asettamalla kohdakkoin kloonit k9-1-15e suunnassa 5' - 3; se esittää myös ORF:ään koodatut aminoha- M äritelmät Termi "hepatitis-c-virus" on varattu alalla tähän asti tuntemattomalle NANBV:n etiolo- 25 giselle aiheuttajalle. Niinpä tässä käytettynä "hepatititis-c-virus" (HCV) viittaa NANBV:n syynä olevaan aiheuttajaan, johon aikaisemmin viitattiin NANBV:nä ja/tai BB-NANBV:nä. Termejä HCV, NANBV ja BB-NANBV käytetään tässä keskenään vaihdellen. Tämän terminologian jatkona kutsutaan HCV:n aiheuttamaa sairautta, jota aikaisemmin kutsuttiin NANB-hepatitikseksi (NANBH), hepatitis-c:ksi. Termejä 30 NANBH ja hepatitis-c käytetään tässä keskenään vaihdellen. Termi "HCV" merkitsee tässä käytettynä viruslajia, joka aiheuttaa NANBH:n ja siitä johdettuja heikennettyjä kantoja tai puutteellisia häiritseviä partikkeleita. Kuten esitetään myöhemmin, HCV-genomi muodostuu RNA:sta. Tiedetään, että viruksia sisältä- 35 väliä RNA:lla on suhteellisen korkea spontaanien mutaatioiden nopeus, s.o. on raportoitu suuruusluokkaa nukleotidia kohti olevista nopeuksista (Fields & Knipe (1986)). Siksi alla kuvatun HCV-lajin joukossa on monia kantoja. Tässä kuvatut koos-

14 tumukset ja menetelmät tekevät mahdolliseksi eri sukulaiskantojen lisääntymisen, määrittämisen, osoittamisen ja eristämisen. Edelleen ne myös sallivat diagnostisten välineiden valmistamisen eri kantoja varten ja niillä on käyttöä seulontamenetelmissä antiviraalisia aineita varten farmakologiseen käyttöön siinä, että ne estävät HCV:n replikaati- 5 on. Tässä annettu tieto, vaikkakin se on peräisin yhdestä HCV-kannasta, johon tästä lähtien viitataan nimellä CDC/HCV1, on riittävä virustaksonomeille salliakseen muidenkin kantojen identifioinnin, jotka ovat lajin sisällä. Kuten tässä kuvataan, olemme keksineet, 10 että HCV on Flavivirus tai Flavi-tyyppinen virus. Flaviviruksen morfologia ja koostumus ovat tunnettuja ja niistä keskustellaan Brintonin (1986) julkaisussa. Yleisesti morfologian suhteen, Flavivirukset sisältävät keskeisen ydinkapsidin, jota ympäröi kaksikerroksinen lipidi. Virionit ovat pallomaisia ja niiden halkaisija on noin nm. Niiden ytimet ovat noin nm halkaisijaltaan. Pitkin virionikuoren ulkopintaa on ulok- 15 keita, jotka ovat noin 5-10 nm pitkiä ja niiden päässä olevat nupit ovat noin 2 nm halkaisijaltaan. HCV koodaa epitooppia, joka on immunologisesti identifioitavissa sen epitoopin kanssa HCV-genomissa, josta tässä kuvatut cdna:t ovat peräisin; mielellään epitooppi on 20 koodattu tässä kuvatussa cdna:ssa. Epitooppi on vain HCV:ssa esiintyvä, kun sitä verrataan muihin tunnettuihin Flaviviruksiin. Epitoopin ainutkertaisuus voidaan määrittää sen immunologisella reaktiivisuudella HCV:n kanssa ja immunologisen reaktivisuuden puuttumisena muiden Flaviviruslajien kanssa. Menetelmät immunologisen reaktiivisuuden määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla, esimerkiksi radioimmunologinen analyysi, 25 ELISA-analyysi, hemoagglutinaatio ja tässä annetaan lukuisia esimerkkejä sopivista tekniikoista analyysejä varten. Edellisen lisäksi voidaan käyttää seuraavia parametrejä, joko yksin tai yhdistelmänä, kannan identifioirniseksi HCV:ksi. Koska HCV-kannat ovat kehityksensä suhteen suku- 30 laisia, odotetaan että genomien kokonaishomologia nukleotiditasolla on noin 40 % tai enemmän, mieluummin noin 60 % tai enemmän ja vielä mieluummin noin 80 % tai enemmän; ja lisäksi että niissä on vastaavia viereisiä ainakin noin 13 nukleotidin sekvenssejä. Oletetun HCV-kannan genomisekvenssin ja CDC/CH1 HCV:n cdnasekvenssin välinen vastaavuus voidaan määrittää alalla tunnetuilla tekniikoilla. Esimer- 35 kiksi ne voidaan määrittää vertaamalla suoraan oletetun HCV:n polynukleotidin sekvenssitietoa ja tässä kuvattuja HCV:n cdna-sekvenssejä. Esimerkiksi myös ne voidaan määrittää hybridisoimalla polynukleotideja olosuhteissa, jotka muodostavat stabiileja

15 duplekseja homologisten alueiden välille (esimerkiksi niiden alueiden, joita käytettäisiin ennen S,-pätkimistä), mitä seuraa pätkiminen yksisäikeisillä erityisillä nukleaaseilla. mitä seuraa päticittyjen fragmenttien koon määritys. 5 HCV-kantojen kehitykseen liittyvän suhteen takia voidaan oletetut HCV-kannat tunnistaa niiden polypeptiditasolla vallitsevan homologiansa avulla. Yleisesti HCV-kannat ovat enemmän kuin noin 40 % homologisia, mieluummin enemmän kuin noin 60 % homologisia ja vielä mieluummin enemmän kuin 80 % homologisia polypeptiditasolla. Tekniikat aminohapposekvenssien homologian määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla. 10 Esimerkiksi aminohapposekvenssi voidaan määrittää suoraan ja sitä voidaan verrata tässä annettuihin sekvensseihin. Myös esimerkiksi oletetun HCV:n genomimateriaalin nukleotidisekvenssi voidaan määrittää (tavallisesti cdna-välituotteen kautta); siinä koodattu aminohapposekvenssi voidaan määrittää ja vastaavia alueita voidaan verrata. 15 Tässä käytettynä polynukleotidi, joka "on peräisin" annetusta sekvenssistä, esimerkiksi HCV:n cdna, erityisesti kuvioissa 1-32 esimerkkeinä annetut, tai HCV-genomista johdettu, viittaa polynukleotidisekvenssiin, joka muodostuu arviolta noin 6 nukleotidin sekvenssistä, joka on mieluummin ainakin noin 8 nukleotidin, vielä mieluummin ainakin noin nuldeotidin ja vieläkin mieluummin vastaavasti ainakin noin nuk- 20 leotidin pituinen,s.o. homologinen tai komplementaarinen annetun nukleotidisekvenssin alueen kanssa. Mieluummin alueen sekvenssi, josta polynuldeotidi on peräisin, on homologinen tai komplementaarinen sekvenssille, joka on ainutkertainen HCV-genomille. Olipa sekvenssi ainutkertainen HCV-genomille tai ei, se voidaan määrittää tekniikoilla, jotka ovat alan ammattilaiselle tunnettuja. Esimerkiksi sekvenssiä voidaan verrata tieto- 25 pankkien, esimerkiksi Genebankrin sekvensseihin sen määrittämiseksi, onko se läsnä infektoitumattomassa isännässä tai muussa organismissa. Sekvenssiä voidaan myös verrata muiden virusaineiden tunnettuihin sekvensseihin, sisältäen ne aineet, jotka ovat tunnettuja hepatitiksen aiheuttajia, esimerkiksi HAV, HBV ja HDV ja muihin Flaviviridae-perheen jäseniin. Vastaavuus tai vastaamattomuus johdetun sekvenssin ja muiden 30 sekvenssien välillä voidaan määrittää myös hydridisaation avulla sopivissa tiukoissa olosuhteissa. Hybridisaatiotekniikat nukleiinihapposekvenssien komplementaarisuuden määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla ja niistä keskustellaan myöhemmin. Katso myös esimerkiksi julkaisua Maniatis et al. (1982). Lisäksi hybridisaatiolla muodostuneiden dupleksipolynukleotidien sopimattomuus voidaan määrittää tunnetuilla tekniikoilla, 35 sisältäen esimerkiksi pätkimisen nukleaasilla, kuten S1:11ä, joka spesifisesti katkoo yksisäikeisiä alueita polynuldeotideissa. Alueet, joista tyypillisiä DNA-sekvenssejä voidaan "johtaa", sisältävät, mutteivat ne ole niihin rajoitettuja, esimerkiksi alueet, jotka

16 koodaavat erityisiä epitooppeja ja lisäksi ei-transkriptoituja ja/tai ei-transloituja alueita. Johdettu polynuldeotidi ei ole välttämättä fysikaalisesti peräisin esitetystä nukleotidisekvenssistä, mutta se voidaan luoda millä tahansa tavalla, sisältäen esimerkiksi kemial- 5 lisen synteesin tai DNA:n replikoirnisen tai käänteisen transkription tai transkription, jotka perustuvat siihen tietoon, jonka antaa emässekvenssi alueilla, joista polynukleotidi on peräisin. Lisäksi niiden alueiden yhdistelmiä, jotka vastaavat annetun sekvenssin alueita, voidaan muokata tavoilla, joiden tiedetään alalla vastaavan aiottua käyttöä. 10 Samoin polypeptidi- tai aminohapposekvenssi, joka on peräisin annetusta nukleiinihapposekvenssistä, esimerkiksi kuvioiden 1-32 sekvensseistä, tai HCV-genomista, viittaa polypeptidiin, jossa on aminohapposekvenssi, joka on identtinen sen polypeptidin aminohapposekvenssin kanssa, joka on koodattu sekvenssiin tai sen osaan, jossa osa käsittää ainakin 3-5 aminohappoa ja mieluummin ainakin 8-10 aminohappoa ja vielä mie- 15 luummin ainakin aminohappoa tai joka on immunologisesti tunnistettavissa sekvenssiin koodatun polypeptidin avulla. Yhdistelmä- tai johdettu polypeptidi ei ole välttämättä transloitu annetusta nukleiinihapposekvenssistä, esimerkiksi kuvioiden 1-26 sekvensseistä tai HCV-genomista; se voi 20 olla luotu millä tahansa tavalla, sisältäen esimerkiksi kemiallisen synteesin tai yhdistelmäekspressiojärjestelmän ekspression tai eristämisen mutatoituneesta HCV:stä. Termi "yhdistelmäpolynukleotidi" käytettynä tässä merkitsee polynukleotidia, joka on peräisin genomista, cdna:sta, se on semiynteettistä tai synteettistä alkuperää, joka al- 25 kuperänsä tai manipulaationsa takia: (1) ei liity kaikkiin niihin polynukleotideihin tai niiden osaan, joihin se liittyy luonnossa tai kirjaston muodossa; ja/tai (2) on kytketty polynukleotidiin, joka on muu kuin se, johon se on kytketty luonnossa. Termi "polynukleotidi" tässä käytettynä viittaa minkä tahansa pituisten nukleotidien, 30 joko ribonukleotidien tai deoksiribonukleotidien, polymeeriseen muotoon. Tämä termi viittaa vain molekyylin ensisijaiseen rakenteeseen. Täten tämä termi sisältää kaksi- ja yksisäikeistä DNA:ta ja lisäksi kaksi- ja yksisäikeistä RNA:ta. Se sisältää myös modifioituja, esimerkiksi metyloimalla ja/tai kapseloimalla ja modifioimattomia polynukleotidin muotoja. 35 Tässä käytettynä termi "HCV, joka sisältää sekvenssin, joka vastaa cdna:ta" merkitsee, että HCV sisältää polynukleotidisekvenssin, joka on homologinen tai komple-

17 15 mentaarinen sekvenssille annetussa DNA:ssa; homologia-asteen tai komplementaarisuusasteen ollessa suurin piirtein 50 % tai enemmän, on mieluummin ainakin noin 70 % ja vielä mieluummin se on ainakin noin 90 %. Sekvenssit, jotka vastaavat toisiaan ovat ainakin noin 70 nukleotidia ja vielä mieluummin ainakin noin 90 nukleotidia pit- 5 kiä. HCV-sekvenssin ja cdna:n välinen vastaavuus voidaan määrittää tekniikoilla, jotka ovat alalla tunnettuja, sisältäen esimerkiksi sekventoidun materiaalin suoran vertailun cdna:t kuvattuna tai hybridisaation ja pilkkomisen yksisäikeisillä nukleaaseilla, mitä seuraa pilkottujen fragmenttien koon määrittäminen. 10 Termi "puhdistettu viruspolynukleotidista" viittaa HCV-genomiin tai sen fragmenttiin, joka on olennaisen puhdas, s.o. se sisältää vähemmän kuin noin 50 %, mieluummin vähemmän kuin noin 70 % ja vielä mieluummin vähemmän kuin noin 90 % polypeptidejä, joihin viruspolynuldeotidi luonnollisesti liittyy. Tekniikat viruspolynukleotidien puhdistamiseksi viruspartikkeleista ovat tunnettuja alalla ja sisältävät esimerkiksi partikklein 15 katkaisun kaotrooppisella aineella ja polynuideotidien ja polypeptidien erottamisen joninvaihtokromatografian, affiniteettikromatografian ja sedimentoimisen avulla tiheyden mukaan. 25 Termi "puhdistettu viruspolypeptidi" viittaa HCV-polypeptidiin tai sen fragmenttiin, 20 joka on olennaisen vapaa, s.o. se siältää vähemmän kuin noin 50 %, mieluummin vähemmän kuin noin 70 % ja vielä mieluummin vähemmän kuin noin 90 % solukomponentteja, joihin viruspolypeptidi luonnollisesti liittyy. Tekniikat viruspolypeptidien puhdistamiseksi ovat alalla tunnettuja ja näiden tekniikoiden esimerkeistä keskustellaan alla. "Yhdistelmäisäntäsolut", isäntäsolut", "solut", "solulinjat", "soluviljelmät" ja muut sellaiset termit, jotka merkitsevät mikro-organismeja tai korkeampia eukarioottisolulinjoja, joita viljellään yksisoluisina k,konaisuuksina viittaavat soluihin, joita voidaan käyttää tai on voitu käyttää yhdistelmävektorin tai muun siirto-dna:n vastaanottajana ja jotka 30 sisältävät sen alkuperäisen solun perimän, johon siirros on tehty. Ymmärretään, että yksittäisen emäsolun perimä ei välttämättä ole täysin identtinen morfologialtaan tai genomiltaan tai ole täysi DNA-komplementti alkuperäisenä vanhempana onnettomuuden seurauksena tapahtuneen tai tarkoitetun mutaation seurauksena. Emäsolun perimä, mikä on riittävän samanlainen asiaan kuuluvalta ominaisuudeltaan, kuten haluttua peptidiä 35 koodaavan nuldeotidisekvenssin läsnäölon suhteen, määritettävän emäsolun kanssa, sisältyy tähän määritelmään aiottuun perimään ja ylläolevat termit kattavat ne.

18 "Replikoni" (replicon) on mikä tahansa geneettinen elementti, esimerkiksi plasmidi, kromosomi, virus, joka käyttäytyy autonomisena polynukleotidin replikaation yksikkönä solun sisällä; s.o. se pystyy replikoitumaan oman kontrollinsa alaisena. 5 "Vektori" on replikoni, johon on kiinnittynyt toinen polynukleotidisegmentti tuodakseen mukaan kiinnittyneen segmentin replikaation ja/tai ekspression. "Säätösekvenssi" viittaa polynukleotidisekvensseihin, jotka ovat välttämättömiä niiden koodaussekvenssien, joihin ne ovat sitoutuneet, ekspression aikaansaamiseen. Sellaisten 10 säätösekvenssien luonne eroaa isäntäorganismin mukaan; prokariooteissa sellaiset säätösekvenssit sisältävät yleisesti promoottorin, ribosomin sidoskohdan ja terminaattoreita; eukariooteissa sellaiset säätösekvenssit sisältävät yleisesti promoottoreita, terminaattoreita ja joissakin tapauksissa vahvistajia. Termi "säätösekvenssit" on aiottu sisältämään minimissään kaikki komponentit, joiden läsnäolo on välttämätöntä ekspressiota 15 varten ja ne voivat myös sisältää lisäkomponentteja, joiden läsnäolo on edullista, esimerkiksi johtosekvenssejä. "Toiminnallisesti kytketty" viittaa rinnakkainasetteluun, jossa niin kuvatut komponentit ovat sellaisessa suhteessa, joka sallii niiden toiminnan aiotulla tavalla. Säätösekvenssi, 20 joka on "toiminnallisesti kytketty" koodaussekvenssiin, on sidottu sellaisella tavalla, että koodaussekvenssin ekspressio saadaan aikaan olosuhteissa, jotka ovat yhteensopivia säätösekvenssien kanssa. "Avoin lukurakenne" (Open reading frame ORF) on polynukleotidisekvenssin alue, joka 25 koodaa polypeptidiä; tämä alue voi edustaa koodaussekvenssin osaa tai kokonaista koodaussekvenssiä. "Koodaussekvesnssi" on polynukleotidisekvenssi, joka on transkriptoitu mrna:han ja/tai transloitu polypeptidiin, kun se on pantu sopivien säätävien sekvenssien kontrol- 30 liin. Koodaussekvenssin rajat määrittävät translaation aloittava kodoni 5'-päässä ja translaation lopettava kodoni 3'-päässä. Koodaussekvenssi voi sisältää, muttei se ole rajoitettu niihin, mrna:n, cdna:n ja yhdistelmäpolynukleotidisekvenssejä. "Immunologisesti tunnistettavissa jollakin/jonakin" viittaa sellaisten epitooppien ja po- 35 lypeptidien läsnäoloon, jotka ovat myös läsnä ja ovat ainutkertaisia annetuille polypeptideille, tavallisesti HCV-proteiineille. Immunologisen identiteetin voi määrittää vastaaineen sitoutuminen ja/tai kilpailu sitoutumisessa; nämä tekniikat ovat tunnettuja alan

19 17 5 keskitason ammattilaiselle ja niitä kuvataan myös alla. Epitoopin ainutkertaisuus voidaan myös määrittää tietokonehaulla tunnetuissa tietopankeissa, esimerkiksi Genebankssa, epitooppia koodaavien polynukleotidisekvenssien löytämiseksi ja vertaamalla aminohapposekvenssiä muihin tunnettuihin proteiineihin. Tässä käytettynä "epitooppi" viittaa polypeptidin antigeeniseen polypeptidin determinanttiin; epitooppi voisi käsittää kolme aminohappoa epitoopille ainutkertaisessa avaruuskonformaatiossa, yleisesti epitooppi käsittää ainakin viisi sellaista aminohappoa ja tavallisemmin se käsittää ainakin 8-10 sellaista aminohappoa. Aminohappojen avaruus- 10 konformaation määrittämismenetelmät ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi röntgenkristallografian ja kaksiulotteisen ydinmagneettisen resonanssin Polypeptidi on "irrununologisesti reaktiivinen" vasta-aineen kanssa, kun se sitoutuu vasta-aineeseen siten, että se tunnistaa tietyn polypeptidin sisältämän epitoopin. Immunolo- 15 gisen reaktiivisuuden voi määrittää vasta-aineen sitoutuminen, erityisemmin vastaaineen sitoutumisen kinetiikka ja/tai kilpailu sitoutumisessa käyttäen kilpailijoina tunnettuja polypeptidejä, jotka sisältävät epitoopin, jota vastaan vasta-aine on suunnattu. Tekniikat sen määrittämiseksi onko polypeptidi immunologisesti reaktiivinen vastaaineen kanssa vai ei, ovat alalla tunnettuja. Tässä käytettynä termi "HCV-epitoopin sisältävä immunogeeninen polypeptidi" sisältää luonnollisesti esiintyviä HCV-polypeptidejä tai niiden fragmentteja ja myös polypeptidejä, jotka on valmistettu muilla tavoin, esimerkiksi kemiallisella synteesillä tai eks- ' "pressoimalla polypeptidi yhdistelmäorganismissa. Termi "polypeptidi" viittaa aminohappojen molekyyliketjuun, eikä viittaa tuotteen erityiseen pituuteen; täten peptidit, oligopeptidit ja proteiinit sisältyvät polypeptidin määritelmään. Tämä termi ei myöskään viittaa polypeptidien ekspression jälkeisiin muunnoksiin, esimerkiksi glykosylaatioihin, asetylaatioihin, fosforylaatioihin ja sen kaltaisiin. "Transformaatio" tässä käytettynä viittaa ulkopuolisen polynuideotidin panemiseen isäntäsoluun, riippumatta panemiseen käytetystä menetelmästä, esimerkiksi suora otto, transduktio tai f-liitto. Ulkoinen polynukleotidi voidaan pitää integroimattomana vektorina, esimerkiksi plasmidina tai vaihtoehtoisesti se voidaan integroida isäntägenomiin. "Yksilö" tässä käytettynä viittaa selkärankaisiin, erityisesti imettäväislajin jäseniin ja sisältää, muttei ole niihin rajoitettu, kotieläimet, urheilueläimet, kädelliset ja ihmiset.

20 Tässä käytettynä nuldeiinihapon "plussäie" sisältää sekvensin, joka koodaa polypeptidiä. "Miinussäie" sisältää sekvenssin, joka on plussäikeelle komplementaarinen. 5 Tässä käytettynä viruksen "positiivisen säikeen genomi" on sellainen, jossa genomi, joko RNA tai DNA, on yksisäikeinen ja joka koodaa viruspolypeptidejä. Esimerkkejä positiivisen säikeen RNA-viruksista ovat Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae. Picornaviridae, ja Caliciviridae. Mukaan sisältyvät myös Flaviviridae, joka aikaisemmin luokiteltiin kuulumaan lajiin Togaviridae. Katso Fields & Knipe (1986). 10 Tässä käytettynä " vasta-aineen sisältävä ruumiin osa" viittaa yksilön ruumiin osaanjoka on kyseessä olevien vasta-aineiden lähde. Vasta-aineita sisältävät ruumiin osat ovat tunnettuja alalla ja sisältävät esimerkiksi plasman, seerumin, selkäydinnesteen, imunesteen, hengitysteiden, ruuansulatuskanavan ja sukupuoli-virtsakanavan ulko-osat, 15 kyyneleet, syljen, maidon, veren valkosolut ja myeloomat. Tässä käytettynä "puhdistettu HCV" viittaa HCV-valmisteeseen, joka on eristetty soluosasista, joihin virus tavallisesti liittyy ja muista virustyypeistä, jotka voivat olla läsnä infektoituneessa kudoksessa. Tekniikat virusten eristämiseksi ovat tunnettuja alan am- 20 mattilaisille ja sisältävät esimerkiksi sentrifugoinnin ja affiniteettikromatografian; menetelmästä puhdistetun HCV:n valmistamiseksi keskustellaan alla. II TC Ple qi nn rin kuvaus 25 Tämän keksinnön käytännön suorituksessa käytetään, ellei toisin ole mainittu, molekyylibiologian, mikrobiologian, yhdistelmä-dna-tekniikan ja immunologian tavanomaisia tekniikoita, jotka ovat alalla käytössä. Sellaisia tekniikoita selvitetään täysin kirjallisuudessa. Katso esimerkiksi seuraavia: Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, VOLUMES I 30 AND II (D.N. Glover toim. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait toim. 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames & S.J. Higgins toim. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney toim. 1986); IMMOBOLIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B.Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); sarja, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic 35 Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller ja M.P.Calos toim. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu ja Grossman, ja vastaavasti Wu, toim.), Mayer ja Walker,

21 toim. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academis Press, Lontoo), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Toinen painos (Springer-Verlag, N.Y.), ja HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUMES I-IV (D.M.Weir ja 5 C.C. Blacicwell toim. 1986). Kaikki patentit, patenttihakemukset ja julkaisut, jotka tässä on mainittu, sekä yllä että alla, liitetään tähän mukaan käsitelväksi viitejulkaisuina. 10 Tämän keksinnön hyödylliset materiaalit ja menetelmät tekee mahdolliseksi läheisesti homologisten nukleotidisekvenssien, jotka on eristetty cdna-kirjastosta, joka on peräisin HCV-infelctoituneen simpanssin plasmassa olevista nukleiinihapposekvensseistä, aikaansaaminen. Tämä nuldeotidisekvenssien perhe ei ole peräisin ihmisestä tai simpanssista, koska se ei hybridisoidu infektoitumattomista yksilöistä peräisin olevan ihmi- 15 sen eikä simpanssin genomin DNA:n kanssa, koska sekvenssien tämän perheen nukleotidit ovat läsnä vain simpanssien maksassa ja plasmassa HCV-infektion myötä ja koska sekvenssi ei ole läsnä Genebank'issa. Lisäksi sekvenssien perhe ei osoita mitään merkittävää homologiaa HBV-genomiin sisältyvien sekvenssien kanssa. 20 Yhden perheen jäsenen sekvenssissä, joka jäsen sisältyy klooniin 5-1-1, on jatkuva avoin lukualue (ORF), joka koodaa arviolta 50 aminohapon polypeptidiä. HCV-infektoituneen ihmisen seerumi sisältää vasta-aineita, jotka sitoutuvat tähän polypeptidiin, kun taas infektoittunattomien ihmisten seerumi ei sisällä tämän polypeptidin vastaaineita. Lopulta infektoittunattomien simpanssien seerumi ei sisällä tämän polypeptidin 25 vasta-aineita, vasta-aineet syntyvät simpansseihin seuraten akuuttia NANBH-infektiota. Edelleen tämän polypeptidin vasta-aineita ei havaita simpansseissa tai ihmisissä, joilla on HAV- tai HBV-infektio. Näillä perusteilla sekvenssi on cdna virussekvenssille, jossa virus aiheuttaa NANBH:n tai liittyy NANBH:hon; tämä cdna-sekvenssi esitetään kuviossa 1. Kuten keskustellaan seuraavassa, kloonin cdna-sekvenssi eroaa tois- 30 ten eristettyjen cdna:oiden sekvensseistä siinä, että se sisältää 28 ylimääräistä emäsparia. Muiden tunnistettujen cdna-perheen jäsenien yhdistelmä, jotka jäsenet eristettiin käyttäen koettimena synteettistä sekvenssiä, joka oli samanlainen kuin kloonissa oleva 35 cdna:n fragmentti, esitetään kuviossa 3. cdna-perheen jäsen, joka eristettiin käyttäen synteettistä sekvenssiä, joka on peräisin kloonin 81 cdna:sta, esitetään kuviossa 5 ja tämän sekvenssin yhdistelmä kloonin 81 sekvenssin kanssa esitetään kuviossa 6. Muita

22 cdna-perheen jäseniä, mukaanlukien ne, jotka ovat klooneissa 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f ja 33g, 39c, 35f, 19g, 26g ja 15e, kuvataan osassa IV.A.. Näissä klooneissa olevien cdna:aiden yhdistelmää kuvataan osassa IV.A.19 ja se esitetään kuviossa 32. cdna:jen yhdistelmä osoittaa, että se sisäl- 5 tää yhden jatkuvan ORF:n ja täten se koodaa polyproteiinia. Tämä tieto on yhtäpitävä sen ehdotuksen kanssa, josta keskustellaan seuraavassa, että HCV on flavivirus tai flavityyppinen virus. Vain tämän kuvioissa 1-32 esitetyn cdna-perheen saatavuus sallii sellaisten DNA- 10 koettimien ja polypeptidien rakentamisen, jotka ovat hyödyllisiä HCV-infektion seurauksena syntyneen NANBH:n diagnosoimisessa ja seulottaessa verenluovuttajia ja myös luovutettua verta ja verituotteita infektion suhteen. Esimerkiksi sekvensseistä on mahdollista syntetisoida DNA-oligomeereja, joissa on noin 8-10 nukleotidia tai suurempia, jotka ovat hyödyllisiä hybridisaatiokoettimina virusgenomin osoittamiseksi esimerkiksi 15 sellaisten kohteiden seerumissa, joiden epäillään kantavan virusta tai luovutetun veren seulomiseksi viruksen läsnäolon varalta. cdna-sekvenssien perhe sallii myös HCVspesifisten polypeptidien suunnittelemisen ja tuottamisen, jotka polypeptidit ovat hyödyllisiä diagnostisina reagensseina NANBH:n aikana syntyvien vasta-aineiden läsnäolon toteamiseksi. cdna:sta peräisin olevien puhdistettujen polypeptidien vasta-aineita 20 voidaan myös käyttää virusantigeenien osoittamiseksi infektoituneissa yksilöissä ja veressä. Lisäksi cdna-sekvenssien perhe tekee mahdolliseksi HCV-genomin lisäkuvaamisen. Näistä sekvensseistä peräisin olevia polynukleotidikoettimia voidaan käyttää seulomaan 25 cdna-kirjastoja sellaisten lisä-cdna-sekvenssien varalta, jotka menevät päällekkäin niiden kanssa, joita vuorostaan voidaan käyttää päällekkäin menevien sekvenssien lisän saamiseen. Ellei genomi ole segmentoitu, eikä segmenteillä ole yhteisiä sekvenssejä, tätä tekniikkaa voidaan käyttää koko genomin sekvenssin saamiseksi. Kuitenkin jos genomi on segmentoitu, muita genomin segmenttejä voidaan saada toistamalla lambda- 30 gt 1 1-serologinen seulontamenettely, jota käytetään tässä kuvattujen cdna-kloonien eristämiseksi tai vaihtoehtoisesti eristämällä genomi puhdistetuista HCV-partikkeleista. cdna-sekvenssien perhe ja polypeptidit, jotka ovat peräisin näistä sekvensseistä ja myös vasta-aineet, jotka on suunnattu näitä polypeptidejä vastaan, ovat myös hyödylli- 35 siä BB-NANBV-aineiden eristämisessä ja tunnistamisessa. Esimerkiksi vasta-aineita, jotka ovat suunnattuja HCV-epitooppeja vastaan, jotka sisältyvät polypeptideihin, jotka ovat peräisin cdna:sta, voidaan käyttää menetelmissä, jotka perustuvat affiniteettik-

23 1U I J romatografiaan viruksen eristämiseksi. Vaihtoehtoisesti vasta-aineita voidaan käyttää tunnistamaan viruspartikkeleita, jotka on eristetty muilla tekniikoilla. Virusantigeenit ja genomimateriaali eristetyissä viruspartikkeleissa voidaan sitten edelleen määrittää Tieto, joka saadaan sekventoimalla HCV-genomeita edelleen, samoin kuin myös HCVantigeenejä edelleen karakterisoimalla ja genomia karakterisoimalla tekee mahdolliseksi lisäkoettimien ja polypeptidien ja vasta-aineiden suunnittelun ja synteesin, joita aineita voidaan käyttää HCV:n aiheuttaman NANBH:n diagnoosiin, estämiseen ja hoitoon ja infektoituneen veren ja vereen liittyvien tuotteiden seulomiseen. HCV-koettimien saatavuus, sisältäen antigeenit ja vasta-aineet ja polynukleotidit, jotka ovat peräisin genomista, josta cdna-perhe on peräisin, sallii myös kudosten viljelyjärjestelmien kehittämisen, jotka järjestelmät ovat suuresti käytössä HCV:n biologiaa selvitettäessä. Tämä vuorostaan voi johtaa uusien hoito-ohjeiden kehittymiseen, jotka 15 perustuvat antiviraalisiin yhdisteisiin, jotka etupäässä estävät HCV:n replikaation tai sen tarttumisen Menetelmä, jota käytetään NANBH:n etiologisen aiheuttajan tunnistamiseen ja eristämiseen, on uusi ja se voi olla käyttökelpoinen tätä ennen karakterisoimattomien aineiden, jotka sisältävät genomin, tunnistamiseen ja/tai eristämiseen, ja jotka liittyvät lukuisiin tauteihin, mukaan lukien ne, jotka aiheutuvat viruksista, viroideista, bakteereista, sienistä ja loisista. Tässä menetelmässä luotiin cdna-kirjasto nukleiinihapoista, jotka olivat läsnä infektoituneen yksilön infektoituneessa kudoksessa. Kirjasto luotiin vektoriin, joka salli sellaisten polypeptidien ekspression, jotka olivat koodattuna cdna:ssa. Isäntäsolujen klooneja, jotka SiSälsivät vektorin, joka ekspressoi immunologisesti reaktiivisen etiologisen aiheuttajan polypeptidin fragmenttia, valittiin kirjaston ekspressiotuotteiden immunologisella seulonnalla vasta-aineen sisältävän ruumiin komponentin kanssa toisesta yksilöstä, joka oli aikaisemmin infektoitu oletetulla aiheuttajalla. Immunologisen seulontatekniikan vaiheet käsittivät cdna:n sisältävien vektoreiden saattamisen reagoimaan vasta-aineen sisältävän, toisen infektoidun yksilön ruumiin komponentin kanssa ja antigeeni-vasta-ainekompleksin syntymisen osoittamisen ekspressiotuotteiden ja toisen infektoidun yksilön vasta-aineiden välille. Eristetyt kloonit seulotaan edelleen immunologisesti saattamalla niiden ekspressiotuotteet reagoimaan vastaaineen sisältävän, oletetulla aiheuttajana infektoitujen toisten yksilöiden ruumiin komponenttien kanssa ja vertailuyksilöiden kanssa, joita yksilöitä ei ole infektoitu oletetulla aiheuttajana ja osoittamalla antigeeni-vasta-ainekompleksien muodostuminen infektoiduista yksilöistä olevien vasta-aineiden kanssa; ja eristetään cdna:n sisältävät vekto-

24 rit, jotka koodaavat polypeptidejä, jotka reagoivat irrununologisesti vasta-aineiden kanssa, jotka ovat peräisin infektoiduista yksilöistä ja yksilöistä, joiden epäillään olevan aiheuttajan infektoimia, mutta jotka eivät reagoi kontrolliyksilöiden kanssa. Infektoitujen yksilöiden, joita käytetään cdna-kirjaston rakentamiseen ja immunologiseen seulon- 5 taan, ei tarvitse olla samaa lajia. Tämän menetelmän tuloksena eristetyt cdna:t ja niiden ekspressiotuotteet ja ekspressiotuotteita vastaan suunnatut vasta-aineet, ovat hyödyllisiä etiologisen aiheuttajan tunnistamisessa ja/tai löytämisessä. Kuten kuvataan yksityiskohtaisemmin alla, tätä menetelmää on käytetty menestyksellisesti eristämään HCV-genomista peräisin olevan cdna-kirjaston eristämiseen. II A rdna CPkvPnccin valmictaminpn 15 Varastoitua seerumia simpanssista, jolla oli krooninen HCV-infektio ja mikä sisälsi korkean virustiitterin, s.o. ainakin 106 simpanssin infektioannosta/ml (CID/ml), käytettiin viruspartikkeleiden eristämiseen; näistä partikkeleista eristettyjä nukleiinihappoja käytettiin mallina rakennettaessa cdna-kirjastoa virusgenomille. Menetelmistä oletettujen HCV-partikkeleiden eristämiseksi ja cdna-kirjaston rakentamiseksi lambda- 20 gtll:een keskustellaan osassa IV.A.1. Lambda-gtl 1 on vektori, joka on kehitetty erityisesti ekspressoimaan soluun liitettyjä cdna:ja fuusiopolypetideinä beta-galaktosidaasin kanssa ja seulomaan suuria joukkoja yhdistelmäfaageja erityisellä antiseerumilla, joka syntyy annettua antigeeniä vastaan. Vektoriin lambda-gtl 1 tehtyä cdna-kirjastoa, joka oli luotu cdna-varastosta, joka sisälsi arviolta 200 emäsparin keskimääräisen kokoista 25 cdna:ta, seulottiin koodattujen epitooppien suhteen, jotka voisivat sitoutua spesifisesti seerumiin, joka on peräisin potilaista, joilla oli aikaisemmin ollut NANB-hepatitis. Huynh, T.V. et al. (1985). Seulottiin arviolta 106 faagia ja viisi positiivista faagia tunnistettiin, puhdistettiin ja sitten testattiin spesifisyyden suhteen sitoutua eri ihmisistä ja simpansseista, jotka olivat aikaisemmin infektoituneet HCV-aiheuttajalla, peräisin olevaan 30 seerumiin. Yksi faageista, 5-1-1, sitoutui viiteen kahdeksasta kokeillusta ihmisseerumista. Tämä sitoutuminen tapahtui selektiivisesti sellaiseen seerumiin, joka oli otettu potilaista, joilla oli ollut aikaisemmin NANB-hepatitisinfektio, sillä seitsemän normaalin verenluovuttajan seerumit eivät osoittaneet sellaista sitoutumista. 35 Yhdistelmäfaagissa olevan cdna:n sekvenssi määritettiin ja se nähdään kuviossa 1. Tämän kloonatun cdna:n koodaama polypeptidi, joka on samalla translaatioalueella kuin fuusiopolypeptidin N-pään betagalaktosidaasipuolisko, esitetään nukleotidise-

25 kvenssin yläpuolella. Tämä translaatio-orf koodaa sen vuoksi epitooppia, jonka tunnistaa spesifisesti niiden potilaiden seerumi, joilla on NANB-hepatitisinfektioita. cdna:n saatavuus yhdistelmäfaagissa on sallinut eristää muikain klooneja, jotka 5 sisältävät cdna:n lisäsegmenttejä ja/tai vaihtoehtoisia segmenttejä virusgenomiin. Lambda-gtll:ssä oleva cdna-kirjasto, jota kuvattiin yllä, seulottiin käyttäen synteettistä polynuldeotidia, joka oli peräisin kloonatun 5-1-1:n cdna:n sekvenssistä. Tämä seulonta antoi tuloksena kolme muuta kloonia, joiden tunnistettiin olevan 81, 1-2 ja 91; näiden kloonien sisältämät cdna:t sekventoitiin. Katso osia IV.A.3. ja IV.A.4. Neljän 10 itsenäisen kloonin väliset homfflogiat esitetään kuviossa 2, jossa homologiat on merkitty pystyviivoilla. Nukleotidisekvenssit, jotka ovat läsnä ainutkertaisesti klooneissa 5-1-1, 81 ja 91, on merkitty pienillä kirjaimilla. Yhdistelmäfaageissa klooneissa 5-1-1, 81, 1-2 ja 91 läsnä olevat kloonatut cdna:t ovat 15 hyvin homologisia ja eroavat vain kahdella alueella. Ensiksi nukleotidi numero 67 kloonissa 1-2 on tymidiini, kun taas kolme muuta kloonia sisältävät tässä asemassa sytidiinijäännöksen. Tämä korvaus ei kuitenkaan muuta koodatun aminohapon luonnetta. Toinen ero kloonien välillä on, että klooni sisältää 28 emäsparia 5'-päässä, jotka 20 parit eivät ole läsnä muissa Idooneissa. Ylimääräinen sekvenssi voi olla 5'-päätä kloonaava tekotuote; 5'-päätä kloonaavia tekotuotteita huomataan usein cdna-menetelmien tuotteissa. HCV:n cdna:n synteettisiä selcvenssejä, jotka olivat peräisin 5'-alueelta ja 3'-alueelta, 25 käytettiin seulomaan ja eristämään lambda-gt 1 1:ssä olevia NANBV:n cdna-kirjaston cdna:ta, jotka menivät päällekkäin kloonin 81 cdna:n kanssa (Osa IV.A.5.). Tuloksena olevien cdna:jen sekvenssit, jotka ovat kloonissa 36 ja vastaavasti kloonissa 32, esitetään kuviossa 5 ja kuviossa Samoin synteettistä polynukleotidia, joka perustui kloonin 36 5'-alueeseen, käytettiin seulomaan ja eristämään lambda-gtl 1 :ssä olevan NANBV:n cdna-kirjaston cdna:oja, jotka menivät päällekkäin kloonin 36 cdna:n kanssa (osa IV.A.8:). Yhdistelmäfaagin sisältävän cdna:n puhdistettu klooni, joka hybridisoitui synteettiseen polynukleotidikoettimeen, nimettiin klooniksi 33 ja tämän kloonin sisältämä NANBV:n cdna- 35 sekvenssi esitetään kuviossa 8. Käyttäen tekniikkaa eristää päällekkäin meneviä cdna-sekvenssejä on saatu lisäse-

26 kvenssejä HCV:n cdna:sta ylävirtaan ja alavirtaan. Näiden kloonien eristämistä kuvataan alla osassa N.A. Eristettyihin klooneihin koodattujen HCV:n cdna:ojen nukleotidisekvenssien analyysi 5 osoittaa, että yhdistelmä-cdna sisältää yhden pitkän, jatkuvan ORF:n. Kuvio 26 esittää näistä klooneista peräisin olevan yhdistelmä-cdna:n sekvenssin yhdessä siihen koodatun oletetun HCV-polypeptidin kanssa. Menetelmän kuvaus cdna-sekvenssien saamiseksi on enimmäkseen historiallisesti 10 mielenkiintoista. Tuloksena olevat sekvenssit (ja niiden komplementit) annetaan tässä ja sekvenssit tai niiden osat voitaisiin valmistaa käyttäen synteettisiä menetelmiä tai synteettisten menetelmien yhdistelmiä saaden osittaisia sekvenssejä käyttäen menetelmiä, jotka ovat samanlaisia kuin ne joita kuvataan tässä. Lambda-gtl 1-kannat, jotka on replikoitu HCV:n cdna-kirjastosta ja klooneista 5-1-1, 81, 1-2 ja 91, on talletettu Bu- 15 dapest Treaty'n mukaisesti American Type Culture Collection'iin (ATCC), osoitteessa Parklawn Dr., Rockville, Maryland ja niille on annettu seuraavat talletusnumerot. T ambria-v I 1 ATCC No Tai letlicpaivä 20 HCV:n cdna-kirjasto klooni klooni klooni ilooni Kun tätä vastaava hakemus on mennyt patentiksi USA:ssa, kaikki rajoitukset näiden tallenteiden saatavuuden suhteen tullaan poistamaan peruuttamattomasti; ja p»,sy mainittuihin tallenteisiin on mahdollinen yllämainitun US-hakemuksen käsittelyn aikana sille, jonka "Commissioner" siihen vakuuttaa säännösten 37 CFR 1.14 ja 35 USC nojalla. Lisäksi mainittuja tallenteita ylläpidetään kolmenkymmenen vuoden ajan talletuspäivästä lukien tai viidn vuoden ajan siitä, kun joku on viimeksi tallenteita kysellyt; tai US-patentin voimassaoloajan, mikä tahansa edellämainituista aikarajoista onkin pitempi. Nämä tallenteet ja tässä mainitut muut talletetut materiaalit ovat tarkoitetut ainoastaan mukavuutta varten, eikä niitä vaadita tämän keksinnön käytäntöön sovel- 35 tamisessa tässä annetun kuvauksen valossa. Kaikessa talletetussa materiaalissa olevat HCV:n cdna-sekvenssit liitetään tähän viittauksena.

27 Yllä oleva kuvaus genomin "kävelystä" eristämällä päällekkäin menevät cdnasekvenssit HCV:n lambda-gtl 1-kirjastosta aikaansaa yhden menetelmän, jolla voidaan eristää cdna:t, jotka vastaavat koko HCV-genomia. Kuitenkin, kun tässä annettu tieto on hallussa, muut menetelmät näiden cdna:ojen eristämiseksi ovat ilmeisiä alan am- 5 mattilaiselle. Muutamia näistä menetelmistä kuvataan osassa IV.A. alla. II B Vinmpolypeptidien ja -fragmprittien valmiqtuis cdna-sekvenssien saatavuus, joko niiden, jotka on eristetty käyttäen kuvioiden cdna-sekvenssejä ja myös näissä kuvioissa esitettyjen cdna-sekvenssien, sallii sellaisten ekspressiovektoreiden rakentamisen, jotka koodaavat jompaan kumpaan säikeeseen koodatun polypeptidin antigeenisesti aktiivisia alueita. Nämä antigeenisesti aktiiviset alueet voidaan johtaa päällys- tai kuoriantigeeneistä tai ydinantigeeneistä, sisältäen esimerkiksi polynukleotidia sitovat proteiinit, polynuideotidipolymeraasit ja muut vi- 15 rusproteiinit, joita vaaditaan viruspartikkelin replikaatiota ja/tai kokoonpanoa varten. Fragmentit, jotka koodaavat haluttua polypeptidiä, johdetaan cdna-klooneista käyttäen tavanomaista restriktiopilkkomista tai synteettisillä menetelmillä ja ne liitetään vektoreihin, jotka voivat esimerkiksi sisältää osia fuusiosekvensseistä, kuten betagalaktosidansista tai superoksididisniutaasista (SOD), mieluummin SOD:sta. Menetelmiä ja 20 vektoreita, jotka ovat hyödyllisiä sellaisten polypeptidien tuottamiseksi, jotka sisältävät SOD:n futtsiosekvenssejä, kuvataan EP-julkaisussa numero , joka on julkaistu lokakuun 1 päivänä, Vektoreita, jotka koodaavat SOD:n fuusiopolypeptidejä ja HCV-polypeptidejä, s.o. NANB5.1.1, NANB81, ja C100-3, joka on koodattu HCV:n cdna:ojen yhdistelmässä, kuvataan osissa IV.B.1., IV.B.2. ja vastaavasti IV.B.4.. Mikä 25 tahansa HCV:n cdna:n osa, joka sisältää avoimen lukualueen, kummassa tahansa säikeessä, voidaan saada yhdistelmäpolypeptidinä, kuten maturaattina tai fuusioproteiinina; vaihtoehtoisesti cdna:han koodattu polypeptidi voidaan saada aikaan kemiallisella synteesillä. 30 Haluttua polypeptidiä koodaava DNA, joko fuusioidussa tai maturoidussa muodossa ja sisältäen signaalisekvenssin salliakseen erityksen tai ollen sisältämättä, voidaan liittää ekspressiovektoreihin, jotka ovat sopivia mitä tahansa sopivia isäntiä varten. Sekä eukariootti- että prokariootti-isäntäjärjestelmiä käytetään nykyään muodostettaessa yhdistelmäpolypeptidejä ja tiivistelmä muutamista yleisemmin käytetyistä säätöjärjestelmistä 35 ja isäntäsolulinjoista on annettu osassa III.A. alla. Polypeptidi eristetään sitten hajotetuista soluista tai viljelyväliaineesta ja puhdistetaan siinä määrin kuin tarvitaan sen aiottua käyttöä varten. Puhdistus voidaan tehdä tekniikoilla, jotka ovat alalla tunnettuja, esi-

28 26 ' merkiksi suolafraktioinnilla, ioninvaihtohartseilla kromatografoimalla, affiniteettikromatografialla, linkoamalla ja sen kaltaisilla. Katso esimerkiksi: Methods in Enzymology lukuisia proteiinien puhdistusmenetelmiä varten. Sellaisia polypeptidejä voidaan käyttää diagnostisina välineinä. Näitä polypeptidejä vastaan syntyneitä vasta-aineita voidaan 5 myös käyttää diagnostiikassa. Lisäksi, kuten keskustellaan osassa II.J. alla, näiden polypeptidien vasta-aineet ovat hyödyllisiä HCV-partikkeleiden eristämisessä ja tunnistamisessa. HCV-antigeenejä voidaan eristää myös HCV-virioneista. Virioneja voidaan kasvattaa HCV-infektoiduissa soluissa kudosviljelmässä tai infektoidussa isännässä. II C Antigpenictpn polyppptitlier valmistaminen ja konjiigaatio kantaian kana Polypeptidin antigeeninen alue on yleensä suhteellisen pieni - tyypillisesti pituudeltaan aminohappoa tai vähemmän. Niinkin vähästä kuin 5 aminohaposta koostuvat fragmentit voivat karakterisoida antigeenisen alueen. Nämä segmentit voivat vastata HCV-antigeenin alueita. Niinpä, käyttäen HCV:n cdna:oita pohjana, DNA:ja koodaavia HCV-polypeptidien lyhyitä segmenttejä voidaan ekspressoida yhdistelmänä joko fuusioproteiineina tai eristettyinä polypeptideinä. Lisäksi lyhyitä aminohap- 20 posekvenssejä voidaan saada sopivasti kemiallisella synteesillä. Esimerkiksi missä syntetisoitu polypeptidi on muotoiltu oikein saadakseen aikaan oikean epitoopin, mutta on liian pieni ollakseen immunogeeninen, polypeptidi voidaan liittää sopivaan kantajaan. Lukuisia tekniikoita sellaisen liitoksen saamiseksi on tunnettu alalla, mukaanlukien di- 25 suffidiliitoksien muodostamisen käyttäen N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyylitio)- propionaattia (SPDP) ja sukkinimidyyli 4-(N-maleiini-imidometyyli)sykloheksaani- 1 - karboksylaattia (SMCC), joita saadaan Pierce Company'sta, Rockford, Illinois (jos peptidissä ei ole sulfhydryyliryhmää, se voidaan varustaa lisäämällä kysteiinijäännös). Nämä reagenssit luovat disuffidiliitoksen itsensä ja peptidin kysteiinijäännöksen välille 30 yhdessä proteiinissa ja amidiliitoksen lysiinin epsilonaminon kautta tai muun vapaan, toisessa ryhmässä olevan aminoryhmän kautta. Tunnetaan lukuisia sellaisia disulfidi/amidin muodostavia aineita. Katso esimerkiksi Immun. Rev. (1982) 62:185. Muut kaksitoimiset kytkentäaineet muodostavat pikemminkin tioeetteri- kuin disulficlikytkentöjä. Monet näistä tioeettereitä muodostavista aineista ovat kaupallisesti saatavia ja si- 35 sältävät 6-maleiini-imidokaproiinihapon, 2-bromietikkahapon, 2-jodietikkahapon, 4-(Nmaleiini-imidometyyli)syldoheksaani- 1 -karboksyylihapon ja sellaisten reaktiiviset esterit. Karboksyyliryhmät voidaan aktivoida yhdistämällä ne sukkinimidin tai 1-hydrok-

29 syyli-2-nitro-4-sulfonihapon natriumsuolan kanssa. Edellisen listan ei ole tarkoitettu olevan tyhjentävä ja nimettyjen yhdisteiden muunnoksia voidaan vapaasti käyttää. Voidaan käyttää mitä tahansa kantajaa, joka ei itse aiheuta isännälle haitallisten vastaai- 5 neiden tuotantoa. Sopivat kantajat ovat tyypillisesti suuria, hitaasti metaboloituvia makromolekyylejä, kuten proteiineja; polysakkarideja, kuten lateksilla funktionalisoitua sefaroosia, agaroosia, selluloosaa, selluloosapalloja ja sen kaltaisia; polymeerisiä aminohappoja, kuten polyglutaamihappo, polylysiini ja sen kaltaiset; aminohappokopolymeerejä; ja inaktiivisia viruspartikkeleita, katso esimerkiksi osaa II.D. Erityisen 10 hyödyllisiä proteiinikantajia ovat seerumialbumiinit, "keyhole limpet"-hemosyaniini, immunoglobuliinimolekyylit, tyroglobuliini, ovalbumiini, jäykkäkouristustoksoidi, ja muut proteiinit, jotka ovat hyvin tunnettuja alan ammattilaiselle. 15 II D Hrv-i-pitnnpppja sisältävien hybridip2rtikkeli-irrimunogeenien valmistaminen HCV:n epitooppien immunogeenisyyttä voidaan myös vahvistaa valmistamalla ne imettäväis- tai hiivajärjestelmässä, jotka on fuusioitu tai asennettu siten, että niissä on partikkeleita muodostavia proteiineja, kuten esimerkiksi se, joka liittyy hepatitis-b:n pintaantigeeniin. Rakenteet, joissa NANBV-epitooppi on liitetty suoraan partikkeleita muo- 20 dostavaa proteiinia koodaaviin sekvensseihin, tuottavat hybridejä, jotka ovat immunogeenisiä HCV-epitoopin suhteen. Lisäksi kaikki valmistetut vektorit sisältävät HBV:Ile spesifisiä epitooppeja, joissa on vaihteleva määrä immunogeenisyyttä, kuten esimerkiksi pre-s-peptidi (pre surface protein). Täten partikkeleita muodostavista proteiineista rakennetut partikkelit, jotka proteiinit sisältävät HCV-sekvenssejä, ovat im- 25 munogeenisiä HCV:n ja HBV:n suhteen. Hepatitiksen pinta-antigeenien (HBSAg) on osoitettu muodostuvan ja liittyvän S cerevitiae n partikkeleihin (Valenzuela et al. (1982)) ja myös esimerkiksi imettäväissoluihin (Valenzuela, P., et al. (1984)). Sellaisten partikkeleiden muodostumisen on osoitettu 30 vahvistavan monomeerialayksikön immunogeenisyyttä. Rakenteet voivat myös sisältää hepatitiksen pinta-antigeenin immunodominantin epitoopin, joka käsittää ennen pintaa (pre-s) olevan alueen 55 aminohappoa. Neurath et al. (1984). Ennen pintaa olevia hepatitiksen pinta-antigeenipartikkeita, jotka ovat ekspressoitavissa hiivassa, esitetään EPjulkaisussa 174,444, joka on julkaistu ; hybridejä, jotka sisältävät heterologi- 35 sia virussekvenssejä hiivaekspressiota varten, on esitetty EP-julkaisussa 175,261, joka on julkaistu Molemmat julkaisut ovat tämän julkaisun hakijan nimissä ja niihin viitataan tässä. Rakenteet voivat olla ekspressoituja imettäväissoluissa, kuten kii-

30 nalaisen hamsterin munararjasoluissa (CHO) käyttäen SV40-dihydrofolaatti-redulctaasivektoria (Michelle et al. (1984)). Lisäksi osia partikkeleita muodostavaa proteiinia koodaavasta sekvenssistä voidaan 5 vaihtaa kodoneihin, jotka koodaavat HCV-epitooppia. Tässä vaihdossa alueet, joita ei vaadita välittämään yksiköiden yhdistämistä immunogeenisien partikkeleiden muodostamiseksi hiivoissa tai imettäväisissä, voidaan poistaa välttäen täten ylimääräisten HBVantigeenipaikkojen kilpailu HCV-epitoopin kanssa. 10 II.E. Poistettu II.F. Poistettu 15 II G Vasta-aineiden valmistaminen ww-epitooppeja vastaan Immunogeenisiä polypeptidejä, jotka on valmistettu yllä kuvatusti, käytetään tuottamaan vasta-aineita, sekä polyklonaalisia että monoklonaalisia. Jos halutaan polyklonaalisia vasta-aineita, valittu imettäväinen (esimerkiksi hiiri, kani, vuohi, hevonen jne.) immunoidaan immunogeenisellä polypeptidillä, joka kantaa HCV-epitooppeja. Seeru- 20 mia immunoidusta eläimestä kerätään ja sitä käsitellään tunnetuilla menettelytavoilla. 25 Jos seerumi, joka sisältää polyldonaalisia vasta-aineita HCV-epitoopille, sisältää vastaaineita muille antigeeneille, polyklonaaliset vasta-aineet voidaan puhdistaa immunoaffiniteettikromatografialla. Tekniikat polyklonaalisen antiseerumin tuottamiseksi ja käsittelemiseksi ovat alalla tunnettuja, katso esimerkiksi Mayer ja Walker (1987). Vaihtoehtoisesti polylclonaaliset vasta-aineet voidaan eristää imettäväisestä, joka on aikaisemmin infektoitu HCV:llä. Esimerkki HCV-epitooppien vasta-aineiden puhdistusmenetelmästä infektoidun yksilön seerumista, perustuen affiniteettikromatografiaan ja käyttäen SOD:n fuusiopolypeptidiä ja polypeptidiä, joka on koodattu 30 kloonin cdna:ssa, on esitetty osassa V.E. Monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on suunnattu HCV-epitooppeja vastaan, voi myös tuottaa helposti alan ammattimies. Yleiset menetelmät monoklonaalisten vasta-aineiden tekemiseksi hybridoomien kautta ovat hyvin tunnettuja. Kuolemattomia vasta-aineita 35 tuottavia solulinjoja voidaan luoda solufuusiolla ja myös muilla tekniikoilla, kuten suoralla B-lymfosyyttien trasformaatiolla onkogeenisellä DNA:lla tai Epstein-Barrviruksen avulla tehtävänä transfektiolla. Katso esimerkiksi M.Schreier et al. (1980);

31 Hammerling et al. (1981); Kennett et al. (1980); katso myös US-patentteja numerot 4,371,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444, 887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632 ja 4,493,890. HCV-epitooppeja vastaan tuotettujen monoldonaalisten vasta-aineiden sarjoja voidaan seuloa eri ominaisuuksien suhteen; s.o. isotyypin, epitoopin affiniteetin jne. 5 suhteen. 10 Vasta-aineet, sekä monoklonaaliset että polyldonaaliset, jotka ovat suunnattuja HCVepitooppeja vastaan, ovat erityisen hyödyllisiä. Monoldonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää erityisesti synnyttämään anti-idiotyypin vasta-aineita. Anti-idiotyypin vasta-aineet ovat immunoglobuliineja, joissa on "sisäinen kuva" infektoivan aineen, jota vastaan suojaa halutaan, antigeenistä. Katso esimerkiksi Nisonoff, A., et al. (1981) ja Dreesman et al. (1985). 15 Tekniikat anti-idiotyypin vasta-aineiden synnyttämiseksi ovat alalla tunnettuja. Katso esimerkiksi Grzych (1985), MacNamara et al. (1984), ja Uytdehaag et al. (1985). Nämä anti-idiotyypin vasta-aineet voivat olla myös hyödyllisiä NANBH:n hoidossa ja myös HCV-antigeenien immunogeenisten alueiden selventämisessä. 20 II H Dia ringtket nlig.rnikleotidikoettimet ja vklinesariat I Käyttäen eristettyjä HCV:n cdna:ojen esitettyjä osia, mukaanlukien ne, jotka on esitetty kuvioissa 1-32, pohjana, voidaan valmistaa oligomeerejä, joissa on noin 8 nukleotidia tai enemmän, joko pätkimällä tai synteettisesti, jotka oligomeerit hybridisoituvat HCV- 25 genomin kanssa ja ovat hyödyllisiä virusaineiden tunnistamisessa, virusgenomien lisäkarakterisoinnissa ja myös virusten havaitsemisessa sairaissa yksilöissä. HCVpolynukleotidejä varten oleviinkoettimien (joko luonnollisten tai johdettujen) pituudet ovat sellaisia, että ne sallivat ainutkertaisten virussekvenssien osoittamisen hybridisaation avulla. Kun 6-8 nuld-eotidia voi olla toimiva pituus, pidetään nukle- 30 otidin sekvenssejä parempana ja noin 20 nukleotidia näyttää olevan optimi. Mieluummin nämä sekvenssit ovat peräisin alueilta, joissa ei ole heterogeenisyyttä. Nämä koettimet voidaan valmistaa käyttäen rutiinimenetelmiä, sisältäen automatisoidut oligonuldeotidin synteettiset menetelmät. Hyödyllisten koettimien joukossa ovat esimerkiksi klooni ja muut tässä esitetyt kloonit ja myös eri oligomeerit, jotka ovat hyödylli- 35 siä cdna-kirjastoja tutkittaessa, ja joita on kuvattu alla. Minkä tahansa HCV-genomin ainutkertaisen osan komplementti on myös tyydyttävä. Käytettäväksi koettimina on täydellinen komplementaarisuus toivottavaa, vaikka se voi olla tarpeetonta, kun frag-

32 mentin pituus kasvaa. Sellaisten koettimien käyttämiseksi diagnostiikassa, biologista analysoitavaa näytettä, kuten verta tai seerumia, käsitellään haluttaessa sen sisältämien nuldeiinihappojen uut- 5 tamiseksi. Näytteestä tuloksena olevat nukleiinihapot voidaan alistaa geelielektroforeesuin tai johonkin muuhun koon mukaan erottelevaan tekniikkaan; vaihtoehtoisesti nukleiinihapponäyte voidaan pisteblotata ilman kokoerottelua. Koettimet leimataan sitten. Sopivat leimat ja koettimien leimausmenetelmät ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi radioaktiiviset leimat, jotka on liitetty nicktranslaation tai kinaasion avulla, 10 biotiinin, fluoresoivat koettimet ja kemiluminisoivat koettimet. Näytteestä uutettuja muldeiinihappoja käsitellään sitten leimatulla koettimella sopivan tiukoissa hybridisaatio-olosuhteissa. Koettimet voidaan tehdä täysin komplementaarisilcsi HCV-genomille. Siksi hyvin tiukat 15 olosuhteet ovat toivottavia väärien positiivisten estämiseksi. Kuitenkin hyvin tiukkoja olosuhteita tulisi käyttää vain, jos koettimet ovat komplementaarisia sellaiselle virusgenomin alueelle, jossa ei ole heterogeenisyyttä. Hybridisaation tiukkuuden määrittävät lukuisat hybridisaation aikaiset ja pesumenettelyn aikaiset tekijät, mukaanlukien lämpötila, ionivahvuus, ajan pituus ja formamidin pitoisuus. Näitä tekijöitä on hahmotellut 20 esimerkiksi Maniatis, T. (1982). Yleisesti on odotettavissa, että HCV-genomia on läsnä infektoituneiden uksilöiden seerumissa suhteellisen alhaisina tasoina, s.o. tasolla noin ' sekvenssiä ml:aa kohti. Tämä taso voi vaatia, että hybridisaatioanalyysissä käytetään amplifikaatiotekniikkaa. 25 Sellaiset tekniikat ovat alalla tunnettuja. Esimerkiksi Enzo Biochemical Corporation'in "Bio-Bridge"-järjestelmä käyttää terminaalista deoksinuldeotiditransferaasia modifioimattoman 3'-poly-dT-häntien lisäämiseksi DNA-koettimeen. Poly dt-häntäinen koetin hybridisoidaan kohdenukleotidisekvenssiin ja sitten biotiinimodifioituun poly-a:han. PCT-hakemus 84/03250 ja EP-julkaisu kuvaavat DNA-hybridisaatioanalyysiä, 30 jossa: (1) analyytti lämpökäsitellään yksisäikeiseksi DNA-koettimeksi, joka on komplementaarinen entsyymileimatulle olinukleotidille; ja (2) tuloksena oleva hännällinen dupleksi hybridisoidaan entsyymileimattuun oligonukleotidiin. EP-julkaisu kuvaa DNA-hybridisaatioanalyysiä, jossa analyytti-dna saatetaan kosketuksiin koettimen kanssa, jolla on häntä, kuten poly- dt-häntä, amplifikaatiosäie, jossa on sekvenssi, joka 35 hybridisoituu koettimen häntään, kuten poly-a-sekvenssi, ja joka voi sitoa useita leimattuja säikeitä. Erityisen haluttava tekniikka voi ensin käsittää seerumissa kohteena olevien HCV-sekvenssien amplifikaation noin kertaiseksi, s.o. noin 106 sekvens-

33 siin/ml. Tämä voidaan tehdä esimerkiksi tekniikalla, jonka esitti Saiki et al. (1986). Ampiifioidut sekvenssit voidaan sitten osoittaa käyttäen hybridisaatioanalyysiä, jota on kuvattu vireillä olevassa US-hakemuksessa, joka jätettiin , asiamiehen numero , ja joka on saman haltijan nimissä kuin tämäkin keksintö ja johon 5 viitataan tässä. Tämä hybridisaatioanalyysi, jonka tulisi havaita sekvenssit tasolla 106/ml, käyttää nukleiinihappomultimeerejä, jotka sitoutuvat yksisäikeiseen analyyttinuldeiinihappoon ja jotka sitoutuvat myös moniin yksisäikeisiin leimattuihin oligonukleotideihin. Sopivaa liuosmuotoista sandwich-analyysiä, jota voidaan käyttää leimattujen polynuideotidikoettimien kanssa ja menetelmiä koettimien valmistamiseksi on kuvattu EP-julkaisussa 225,807, joka on julkaistu , jonka hakija on sama kuin tämän keksinnön hakija ja johon tässä viitataan. Koettimet voidaan pakata diagnostisiksi välinesarjoiksi. Diagnostiset välinesarjat sisältävät koetin-dna:n, joka voi olla leimattu; vaihtoehtoisesti koetin-dna voi olla lei- 15 maamaton ja leimaamistarvikkeet voivat sisältyä välinesarjaan. Välinesarja voi myös sisältää muita sopivasti pakattuja reagensseja ja materiaaleja, joita tarvitaan tiettyä hybridisaatiotoimintatapaa varten, esimerkiksi standardeja ja myös ohjeet kokeen suorittamiseksi. 20 II.I. Immunnloginen analyysi ja diagnnstiset välireqarjat Sekä polypeptidit, jotka reagoivat immunologisesti HCV-vasta-aineita sisältävän seerumin kanssa, esimerkiksi ne, jotka ovat peräisin osassa IV.A. kuvatuista klooneista tai jotka ovat niissä koodattuja ja niiden kompositiot (ks. osa IV.A.) ja vasta-aineet, 25 jotka ovat syntyneet näissä polypeptideissä olevia HCV-spesifisiä epitooppeja vastaan, ks. esimerkiksi osa IV.E., ovat hyödyllisiä immunologisissa analyyseissä HCV-vastaaineiden läsnäolon osoittamiseksi tai viruksen ja/tai rirusantigeenien osoittamiseksi biologisissa näytteissä, sisältäen esimerkiksi veri- ja seeruminäytteet. Immunologisten analyysien suunnittelu on suuren vaihtelun kohde ja näitä tunnetaan alalla lukuisia. 30 Esimerkiksi immunologinen analyysi voi käyttää yhtä virusantigeeniä, esimerkiksi polypeptidiä, joka on peräisin mistä tahansa kloonista, joka sisältää HCV:n cdna:ta, jota kuvataan osassa IV.A. tai yhdistelmä-cdna:oista, jotka ovat peräisin näissä klooneissa olevasta cdna:sta tai HCV-genomista, josta näiden kloonien cdna on peräisin; vaihtoehtoisesti immunologinen analyysi voi käyttää virusantigeenien 35 yhdistelmää, jotka antigeenit ovat peräisin näistä lähteistä. Se voi käyttää esimerkiksi monoklonaalista vasta-ainetta, joka on suunnattu virusepitooppeja vastaan, monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmää, joka on suunnattu yhtä virusantigeeniä vastaan,

34 monoldonaalisia vasta-aineita, jotka ovat suunnatut erilaisia virusantigeenejä vastaan, polyklonaalisia vasta-aineita, jotka on suunnattu samaa virusantigeeniä vastaan tai polyklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat suunnattuja eri virusantigeenejä vastaan. Toimintatavat voivat perustua esimerkiksi kilpailuun, tai suoraan reaktioon tai 5 sandwich-tyyppiseen analyysiin. Toimintatavat voivat myös käyttää esimerkiksi kiinteitä kantajia tai ne voivat käyttää immunosaostusta. Useimmat analyysit käsittävät leimatun vasta-aineen tai polypeptidin käytön; leimat voivat olla esimerkiksi fluoresoivia, kemiluminisoivia, radioaktiivisia tai värillisiä molekyylejä. Analyysit, jotka vahvistavat koettimelta tulevat signaalit, ovat myös tunnettuja; joista esimerkkejä ovat 10 analyysit, jotka käyttävät biotiinia ja avidiinia ja entsyymileimattuja ja entsyymivälitteisiä immunologisia analyysejä, kuten ELISA-analyysiä. Flavivirusmalli HCV:tä varten sallii ennustamiset koskien diagnostisten epitooppien todennäköistä sijaintia virionin rakenteellisia proteiineja varten. C-, pre-m-, M- ja E- 15 alueet sisältävät kaikki todennäköisesti merkittävän voimakkaita epitooppeja virusantigeenien osoittamiseksi ja erityisesti diagnoosia varten. Samoin odotetaan eirakenneproteiinien alueiden sisältävän tärkeitä diagnostisia epitooppeja (esimerkiksi NSS, joka koodaa oletettua polymeraasia; ja NS1, joka koodaa oletettua komplemennia sitovaa antigeeniä). Yhdistelmäpolypeptidit tai viruspolypeptidit, jotka sisältävät 20 epitooppeja näiltä erityisiltä alueilta, voivat olla hyödyllisiä virusvasta-aineiden osoittamiseksi sairaista verenluovuttajista ja sairaista potilaista. Lisäksi vasta-aineita, jotka ovat suunnatut E- ja/tai M-proteiineja vastaan, voidaan käyttää immunologisissa analyyseissä virusantigeenien osoittamiseksi potilaissa, joilla 25 on HCV:n aiheuttama NANBH ja sairaissa verenluovuttajissa. Vielä nämä vasta-aineet ovat äärimmäisen hyödyllisiä akuutin vaiheen luovuttajien ja potilaiden havaitsemisessa. Välinesarjat, jotka ovat sopivia immunologisia diagnooseja varten ja jotka sisältävät 30 sopivasti leimattuja reagensseja, ovat rakennetut pakkaamalla sopivat materiaalit mukaanlukien keksinnön polypeptidit, jotka sisältävät HCV-epitooppeja tai HCVepitooppeja vastaan suunnattuja vasta-aineita sopivissa astioissa yhdessä niiden muiden reagenssien ja materiaalien kanssa, joita vaaditaan analyysin suorittamiseksi ja myös sopivat analyysiohjeet. 35 II J - jntka peräisinvimsgenomin$dna:sta

35 HCV:n cdna-sekvenssitietoa klooneissa, joita kuvataan osassa IV.A., kuten on esitetty kuvioissa 1-32, voidaan käyttää saamaan lisää tietoa HCV-genomin sekvenssistä ja tunnistamaan ja eristämään HCV-aine ja täten se auttaa karakterisoinnissaan sisältäen 5 genomin luonteen, viruspartikkelin rakenteen ja niiden antigeenien luonteen, joista se 10 koostuu. Tämä tieto vuorostaan voi johtaa lisämäärään polynukleotidikoettimia, polypeptidejä, jotka ovat peräisin HCV-genomista ja vasta-aineita HCV-epitooppeja vastaan, jotka voisivat olla hyödyllisiä HCV:n aiheuttaman NANBH:n diagnoosissa ja/tai hoidossa. Yllämainittujen kloonien cdna-sekvenssitieto on hyödyllinen suunniteltaessa koettimia lisä-cdna-sekvenssien erottamiseksi, jotka ovat peräisin HCV-genomien vielä tunnistamattomilta alueilta, joista genomeista cdna:t osasssa IV.A. kuvatuissa klooneissa ovat peräisin. Esimerkilcsi leimattuja koettimia, jotka sisältävät noin 8 tai 15 enemmän nukleotidin sekvenssin ja mieluummin 20 tai enenmmän nukleotidin sekvenssin, jotka nuideotidit ovat peräisin alueilta, jotka ovat lähellä kuvioissa 1, 3, 6, 9, 14 ja 32 esitettyjen HCV:n cdna-sekvenssien perheen 5'-päätä tai 3'-päätä, voidaan käyttää eristämään päällekkäin meneviä cdna-sekvenssejä HCV:n cdna-kirjastoista. Näitä sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin yllämainituissa klooneissa olevien 20 cdna:ojen kanssa, mutta jotka myös sisältävät sekvenssejä, jotka ovat peräisin genomin alueilta, joista cdna yllämainituissa klooneissa ei ole peräisin, voidaan sitten käyttää koettimien syntetisoimiseen muiden päällekkäin menevien fragmenttien tunnistamiseen, jotka fragmentit eivät välttämättä mene päällekkäin osassa IV.A. kuvattujen kloonien cdna:ojen kanssa. Ellei HCV-genomi ole segmentoitu ja segmenteillä 25 ei ole yhteisia sekvenssejä, on mahdollista sekventoida koko virusgenomit käyttäen virusgenomista johdettujen päällekkäin menevien cdna:ojen eristystekniikkaa. Vaikkakin on epätodennäköistä, jos genomi on segmentoitu genomi, jossa ei ole yhteisiä sekvenssejä, genomin sekvenssi voidaan määrittää seulomalla serologisesti lambda-gtll:ssä olevia HCV:n cdna-kirjastoja, kuten käytettiin kloonin eristämiseen, sekventoimalla cdna-eristeitä ja käyttämällä eristettyjä cdna:oja päällekkäin menevien fragmenttien eristämiseen käyttäen tekniikkaa, jota kuvattiin osassa IV.A. kuvattujen kloonien eristämiseen ja sekventointiin. Vaihtoehtoisesti genomisegmenttien karakterisointi voitaisiin tehdä virusgenomeista, jotka on eristetty puhdistetuista HCV-partikkeleista. Menetelmiä HCV-partikkeleiden puhdistamiseksi ja 35 niiden osoittamiseksi puhdistusmenettelyn aikana kuvataan tässä alla. Menettelyt polynukleotidigenomien eristämiseksi viruspartikkelista ovat tunnettuja alalla ja eräs käyttökelpoinen menetelmä on esitetty Esimerkissä IV.A.1. Eristetyt genomisegmentit

36 voitaisiin sitten kloonata ja sekventoida. Täten tässä annetun tiedon nojalla on mahdollista kloonata ja sekventoida HCV-genomeita niiden luonteesta riippumatta. Menetelmät cdna-kirjastojen luomiseksi ovat alalla tunnettuja ja niistä keskustellaan 5 ylempänä ja alempana; menetelmästä HCV:n cdna-kirjaston luomiseksi lambda-gtl 1- vektoriin, keskustellaan alla osassa N.A. Kuitenkin cdna-kirjastoja, jotka ovat käyttökelpoisia nukleiinihappokoettimilla seulomiseen, voidaan myös rakentaa muilla alalla tunnetuilla vektoreilla, esimerkiksi lambda-gt10:11ä (Huynh et al. (1985)). HCV:stä peräisin oleva cdna, jonka kuvioiden 1-32 cdna:sta ja näistä cdna:sta 10 johdetuista polynukleotideista syntetisoiduista koettimista peräisin olevat koettimet havaitsevat, voidaan eristää kloonista katkomalla eristetty polynukleotidi sopivilla restriktioentsyymeillä ja sekventoimalla. Katso esimerkiksi osista IV.A.3. ja IV.A.4. tekniikoita, joita käytetään sen HCV:n cdna:n eristämiseen ja sekventointiin, mikä menee päällekkäin kloonin HCV:n cdna:n kanssa, osista IV.A.5. -IV.A.7. sen 15 HCV:n cdna:n eristystä ja sekventointia, mikä menee päällekkäin kloonin 81 cdna:n kanssa ja osista IV.A.8. ja IV.A.9. sen kloonin eristämistä ja sekventoimista, mikä menee päällekkäin toisen kloonin kanssa (klooni 36), mikä menee päällekkäin kloonin 81 kanssa. 20 Näistä päällekkäin menevistä HCV:n cdna:sta johdettu sekvenssitieto on hyödyllinen määritettäessä homologia- ja heterogeenisyysalueita virusgenomeissa, jotka voisivat merkitä genomin erilaisen kannan läsnäoloa ja/tai viallisten partikkeleiden populaatioiden läsnäoloa. Hybridisaatiokoettimien suunnittelulle on myös hyödyllistä havaita HCV ja HCV-antigeenit tai HCV-nukleiinihapot biologisissa näytteissä ja 25 HCV:n eristämisen aikana (mistä keskustellaan alla), käyttäen osassa II.G. kuvattua tekniikkaa. Vielä päällekkäin meneviä cdna:oita voidaan käyttää luomaan ekspressiovektoreita polypeptideille, jotka ovat peräisin HCV-genomeista, jotka myös koodaavat polypeptidejä, jotka on koodattu ldooneissa 5-1-1, 36, 81 ja 1-2 ja muissa osassa IV.A. kuvatuissa klooneissa. Tekniikat näiden polypeptidien, jotka sisältävät 30 HCV-epitooppeja, ja sellaisten vasta-aineiden luomiseksi, jotka ovat suunnatut niihin sisältyviä HCV-epitooppeja vastaan ja myös niiden käytöt ovat analogisia niille, joita kuvattiin polypeptidejä varten, jotka ovat peräisin NANBV:n cdna-sekvensseistä, jotka sisältyivät klooneihin 5-1-1, 32, 35, 36, 1-2, 81 ja 91, joista on keskusteltu yllä ja alla. 35 cdna-sekvenssien perheeseen, jotka sekvenssit sisältyvät klooneihin 5-1-1, 32, 35, 36, 81, 91, 1-2 ja muihin osassa IV.A. kuvattuihin klooneihin, koodattuna on antigeenejä,

37 jotka sisältävät epitooppeja, jotka näyttävät olevan ainutkertaisia HCV:lle; s.o. vastaaineet, jotka ovat suunnatut näitä antigeenejä vastaan ovat poissa yksilöistä, joilla on HAV- tai HBV-tartunta ja yksilöistä, joilla ei ole HCV-tartuntaa (ks. osassa IV.B. esitettyä serologista tietoa). Lisäksi näiden cdna:ojen sekvenssitiedon vertailu HAV:n, 5 HBV:n, HDV:n ja Genebank'in genomisekvenssien kanssa osoittaa, että näiden cdna:ojen ja noiden lähteiden polynukleotidisekvenssien välillä vallitsee minimaalinen homologia. Täten vasta-aineita, jotka ovat suunnatut niitä antigeenejä vastaan, jotka ovat koodatut näiden kloonien cdna:ssa, voidaan käyttää BB-NANBV-partikkeleiden tunnistamiseen, jotka ovat eristettyjä sairaista yksilöistä. Lisäksi ne ovat myös hyödyl- 10 lisiä NANBH:n aiheuttajien eristätnisessä. HCV-partikkelit voidaan eristää seerumista, joka on peräisin yksilöistä, joilla on BB- NANBV-tartunta tai soluviljelrnistä, millä tahansa alalla tunnetulla menetelmällä, sisältäen esimerkiksi tekniikat, jotka perustuvat koon valintaan, kuten saostamis- tai 15 poissulkemismenetelmät tai tekniikat, jotka perustuvat tiheyteen, kuten ultralinkous tiheysgradienteissa tai saostus aineilla, kuten polyetyleeniglykoli tai kromatografia lukuisilla materiaaleilla, kuten anionin- tai kationinvaihtomateriaaleilla ja materiaaleilla, jotka sitoutuvat hydrofobisuuden takia ja myös affiniteteettipylväillä. Eristystä suoritettaessa voidaan HCV:n läsnäolo havaita uutetun genomin hybridisaatioanalyy- 20 sillä käyttäen koettimia, jotka ovat peräisin yllä kuvatuista HCV:n cdna:oista tai immunologisella analyysillä (ks. osa II.I.) käyttäen koettimina vasta-aineita, jotka ovat suunnatut niitä HCV-antigeenejä vastaan, jotka ovat koodattuja kuvioissa 1-32 esitettyjen cdna-sekvenssien perheessä ja jotka ovat myös suunnattuja niitä HCV-. antigeenejä vastaan, jotka ovat koodattuja yllä keskustelluissa päällekkäin menevissä 25 HCV:n cdna-sekvensseissä. Vasta-aineet voivat olla monoldonaalisia tai polyklonaalisia ja voi olla toivottavaa puhdistaa vasta-aineet ennen niiden käyttöä immunologisessa analyysissä. Puhdistusmenettelyä polyldonaalisia vasta-aineita varten, jotka ovat suunnattuja sellaisia antigeenejä vastaan, jotka on koodattu kloonissa 5-1-1, kuvataan osassa IV.E; analogisia puhdistusmenettelyjä voidaan käyttää sellaisia vasta- 30 aineita varten, jotka ovat suunnattuja muita HCV-antigeenejä vastaan. Vasta-aineet, jotka ovat suunnattuja HCV-antigeenejä vastaan, jotka ovat koodattuja kuvioissa 1-32 esitettyjen cdna:ojen perheessä ja myös niitä vastaan, jotka ovat koodattuja päällekkäin menevissä HCV:n cdna:oissa, jotka ovat kiinnitettyjä 35 kiinteisiin kantajiin, ovat hyödyllisiä HCV:n eristämiseksi immunoaffiniteettikromatografialla. Tekniikat immunoaffiniteettikromatografiaa varten ovat alalla tunnettuja ja sisältävät tekniikat vasta-aineiden kiinnittämiseksi kiinteisiin kantajiin niin, että ne sai-

38 36 lyttävät immunoselektiivisen aktiivisuutensa; tekniikat voivat olla niitä, joissa vastaaineet adsorboidaan kantajaan (ks. esimerkiksi Kurstak julkaisussa ENZYME IMMUNODIAGNOSIS, sivut 31-37), ja myös niitä, joissa vasta-aineet ovat kantajaan kovalenttisesti kiinnitettyjä. Yleisesti tekniikat ovat samanlaisia kuin ne, joita käytetään 5 antigeenien kovalenttiseksi kiinnittämiseksi kiinteään kantajaan ja joita kuvataan yleisesti osassa II.C.; kuitenkin kaksitoimisiin kytkentäaineisiin voidaan sisällyttää väliryhmiä niin, että vasta-aineen antigeenin sitoutumispaikka jää saataville. Puhdistusmenettelyn aikana HCV:n läsnäolo voidaan havaita ja/tai todentaa 10 nuldeiinihappohybridisaation avulla, käyttäen koettimina polynuideotideja, jotka ovat peräisin kuvioissa 1-32 esitettyjen HCV:n cdna-sekvenssien perheestä ja myös päällekkäin menevistä HCV:n cdna-sekvensseistä, joita on kuvattu yllä. Tässä tapauksessa fraktioita käsitellään olosuhteissa, jotka aiheuttaisivat viruspartikkeleidn katkeamisen, esimerkiksi pesuaineilla kelatoivien aineiden läsnäollessa ja virusnukle- 15 iinihapon läsnäolo määritetään hybridisaatiotekniikoilla, joita kuvataan osassa II.H. Lisävahvistusta sille, että eristetyt partikkelit ovat aineita, jotka indusoivat HCV:a, voidaan saada infektoimalla simpansseja eristetyillä viruspartikiceleilla, mitä seuraa sen määrittäminen, seuraako tartuttamista NANBH:n oireita vai ei. 20 Viruspartikkelit puhdistetuista valmisteista voidaan sitten karakterisoida edelleen. Genominukleiinihappo on puhdistettu. Perustuen sen herkkyyteen ribonukleaasille, muttei ribonukleaasi I:lle, havaitaan, että virus muodostuu RNA-genomista. Katso esimerkki IV.C.2. alla. Säikeettömyys ja ympyränmuotoisuus tai se, ettei se ole ympyränmuotoinen, voidaan määrittää alalla tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen 25 esimerkiksi sen tekemisen näkyväksi elektronimikroskoopin avulla, sen jakaantumisen tiheysgradientteihin ja sen saostumisominaisuudet. Siepatun HCV-genomin hybridisaatioon HCV:n cdna:ojen negatiivisiin säikeisiin perustuen käy ilmi, että HCV voi muodostua positiivisista säikeistä koostuvasta RNA-genomista (ks. osa IV.H.1). Tekniikoita, kuten tässä esitettyjä, kuvataan esimerkiksi julkaisussa 30 METHODS IN ENZYMOLOGY. Lisäksi puhdistettu nukleiinihappo voidaan kloonata ja sekventoida tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen käänteistranskription, koska genomimateriaali on RNA:ta. Katso esimerkiksi Maniatis (1982) ja Glover (1985). Käyttäen viruspartikkeleista peräisin olevaa nukleiinihappoa on mahdollista sekventoida koko genomi riippumatta siitä onko se segmentoitu vai ei. 35 Yhdistettyjen kloonien 14i-39c (ks. kuvio 26) jatkuvaan lukualueeseen (ORF) koodattujen polypeptidien homologian tutkiminen osoittaa, että HCV-polypeptidi

39 37 sisältää homologia-alueita flaviviruksien säilyneiden alueiden vastaavien proteiinien kanssa. Esimerkki tästä on kuvattu osassa IV.H.3. Tällä löydöksellä on monta tärkeää seuraamusta. Ensiksi tämä todiste, yhdessä niiden tuloksien kanssa, jotka osoittavat, että HCV sisältää positiivisesti säikeisen genomin, jonka koko on noin nuideotidia, 5 on yhtäpitävä sen ehdotuksen kanssa, että HCV on flavivirus tai flavityyppinen virus. Yleisesti flaviviruksien virioneissa ja niiden genomeissa on suhteellisen yhtäpitävä rakenne ja järjestys, jotka ovat tunnettuja. Katso Rice et al. (1986) ja Brinton, M.A. (1988). Täten polypeptidejä C, pre-m/m ja E koodaavat rakenteelliset geenit voidaan paikallistaa kloonista 14i ylävirtaan olevan genomin 5'-päähän. Lisäksi käyttäen 10 vertailua muihin flaviviruksiin, voidaan tehdä ennusteita näitä proteiineja koodaavien sekvenssien tarkasta paikasta. Niiden sekvenssien eristäminen, jotka ovat ylävirtaan päin klovnin 14i sekvensseistä, voidaan täydentää lukuisilla tavoilla, jotka tässä annetun tiedon kanssa olisivat ilmeisiä 15 alan ammattilaiselle. Esimerkiksi genomin "kävelytys"-tekniikkaa voidaan käyttää eristämään muita sekvenssejä, jotka ovat 5'-asemassa kloonin 14i sekvensseihin nähden, mutta jotka menevät päällekkäin tuon kloonin kanssa; tämä vuorostaan johtaa lisäsekvenssien eristämiseen. Tätä tekniikkaa on havainnollistettu kunnolla alla osassa IV.A.. On esimerkiksi myös tunnettua; että flaviviruksissa on säilyviä epitooppeja ja säilyvien 20 nukleiinihapposekvenssien alueita. Polynukleotideja, jotka sisältävät säilyviä sekvenssejä, voidaan käyttää koettimina, jotka sitovat HCV-genomin sallien täten sen eristämisen. Lisäksi näitä säilyviä sekvenssejä, yhdessä niiden kanssa, jotka ovat peräisin kuviossa 22 esitetyistä HCV:n cdna:oista, voidaan käyttää primereiden suunnitteluun, käytettäväksi järjestelmissä, jotka amplifioivat niitä genomisekvenssejä, jotka 25 sijaitsevat ylävirtaan kloonin 14i sekvensseistä, käyttäen polymeraasi-ketjureaktioteknologiaa. Esimerkki tästä on kuvattu alla. HCV:n rakenne voidan myös määrittää ja sen komponentit eristää. Morfologia ja koko voidaan määrittää esimerkiksi elektronimikroskoopilla. Tiettyjen 30 viruspolypeptidiantigeenien, kuten päällys- tai kuoriantigeenien tai sisäisten antigeenien, kuten nukleiinihappoa sitovat proteiinit, ydinantigeenit ja polynukleotidipolymeraasit, tunnistus ja sijainti voidaan määrittää esimerkiksi määrittämällä, ovatko antigeenit läsnä pääviruskomponentteina vai vähemmistökomponentteina ja myös käyttämällä vasta-aineita, jotka ovat suunnattuja erityisiä antigeenejä vastaan, 35 jotka ovat koodattuja eristetyissä cdna:oissa koettimina. II.K. Sninviljelyjärjectelmät ja pläinmnitijärjpstelmät Hcv-replikaatiotR varten

40 Ehdotus, että HCV on flavivirus tai flavityyppinen virus, antaa myös tietoa HCV:n kasvatusmenetelmistä. Termi "flavityyppinen" merkitsee, että viruksessa on merkittävä määrä homologiaa flaviviruksien tunnettujen säilyvien alueiden kanssa ja että suurin osa genomista on yksinkertaista avointa lukualuetta (ORF). Menetelmät flaviviruksien vilje- 5 lemiseksi ovat tunnettuja alan ammattilaisille (katso esimerkiksi katsauksia Brinton (1986) ja Stollar, V. (1980)). Yleisesti sopivat solut tai solulinjat HCV:n viljelemiseksi voivat sisältää ne, joiden tiedetään tukevan Flavivirulcsien replikaatiota, esimerkiksi seuraavat: apinan munuaissolulinjat (esim. MK2, VERO); sian munuaissolulinjat (esim. PS); nuoren hamsterin munuaissolulinjat (esim. BHK); hiiren makrofaagisolulinjat 10 (esim. P388D1, MK1, Mml); ihmisen makrofaagisolulinjat (esim. U-937); ihmisen perifeerisen veren leukosyytit; ihmisen kiinnittyvät monosyytit; hepatosyytit tai hepatosyyttisolulinjat (esim. HUH7, HEPG2); sikiöt tai sikiösolut (esim. kananpojan sikiön fibroblastit); tai solulinjat, jotka ovat peräisin selkärangattomista, mieluummin hyönteisistä (esim. drosophila-solulinjat), tai vielä mieluummin niveljalkaisista, esimer- 15 kiksi moskiiton solulinjat (esim. A. Albopictus, Aedes aegypti, Cutex tritaeniorhynchus) tai punkin solulinjoista (esim. RML-14 Dermacentor parumapertus). On mahdollista, että primäärisiä hepatosyyttejä voidaan viljellä ja sitten tartuttaa HCV:llä; tai vaihtoehtoisesti hepatosyyttiviljelmät voisivat olla peräisin sairaiden yksi- 20 Töiden (esim. ihmisten tai simpanssien) maksoista. Jälkimmäinen tapaus on esimerkki solusta, joka on infektoitu in uima ja siirretään sitten in viina Lisäksi voidaan käyttää erilaisia menetelmiä solujen säilyttämiseksi hengissä hepatosyyttiviljelmistä peräisin olevien solulinjojen saamiseksi. Esimerkiksi primäärisiä maksaviljelmiä (ennen ja jälkeen hepatosyyttisolujen rikastamisen) voidaan fuusioida eri soluihin stabiilisuuden 25 ylläpitämiseksi. Esimerkiksi viljelmiä voidaan infektoida myös transformoivilla viruksilla tai transfektoida transformoivilla geeneillä pysyvien tai puolipysyvien solulinjojen luomiseksi. Lisäksi esimerkiksi maksaviljelmien soluja voidaan fuusioida pysyviin solulinjoihin (esim. HepG2). Solufuusiomenetelmät ovat alalla tunnettuja, esimerkiksi fuusioaineiden, kuten polyetyleeniglykolin, Sendai-viruksen ja Epstein- 30 Barr-viruksen käyttö on tunnettua. Kuten keskusteltiin yllä, HCV on Flavivirus tai Flavityyppinen virus. Siksi on luultavaa, että solulinjojen HCV-infektio voidaan suorittaa tekniikoilla, jotka ovat alalla tunnettuja solujen infektoimiseksi Flaviviruksilla. Nämä sisältävät esimerkiksi solujen inkuboinnin 35 virusvalmisteen kanssa olosuhteissa, jotka sallivat viruksen siirtymisen soluun. Lisäksi voi olla mahdollista saada virustuotantoa transfektoimalla solut eristetyillä viruspolynuideotideilla. On tunnettua, että Togaviruksien ja Flaviviruksien RNA:t ovat

41 39 infektoivia lukuisissa selkärankaisten solulinjoissa (Pfefferkorn ja Shapiro (1974)), ja moskiiton solulinjassa (Peleg (1969)). Menetelmät kudosviljelmän solujen transfektoimiseksi RNA-duplekseilla, positiivisen kierteen RNA:oilla ja DNA:oilla (sisältäen cdna:t) ovat tunnettuja alalla ja sisältävät esimerkiksi tekniikat, jotka 5 käyttävät elektroporaatiota ja saostusta DEAE-dekstraanilla tai kalsiumfosfaatilla. 10 Runsas HCV:n RNA:n lähde voidaan saada suorittamalla in mitta transkriptio HCV:n cdna:lle, joka vastaa koko genomia. Transfektion tällä materiaalilla tai kloonatulla HCV:n cdna:lla tulisi antaa tuloksena viruksen replikaatio ja viruksen in mitta lisääntyminen. Viljeltyjen solujen lisäksi voidaan käyttää eläinmallijärjestelmiä viruksien replikaatioon; eläinjärjestelmät, joissa käytetään Flaviviruksia, ovat alan ammattilaisille tunnettuja (katso esimerkiksi Monath'in (1986) katsausta). Täten HCV-replikaatio voi tapahtua, ei vain simpansseism, mutta myös esimerkiksi silkkiapinoissa ja imevissä 15 hiirissä. II L T-TCV ta vastaan qminnattnien aritivirasilistpri aineiden seulonta Soluviljelmä- ja eläinmallijärjelmien saatavuus HCV:tä varten tekee myös 20 mahdolliseksi HCV:n replikaation estävien viruksenvastaisten aineiden seulonnan ja erityisesti sellaisten aineiden seulonnan, jotka etupäässä sallivat solujen kasvun ja monistumisen, mutta estävät virusten replikaation. Nämä seulontamenetelmät ovat tunnettuja alan ammattilaisille. Yleisesti virusten vastaisia aineita testataan lukuisilla pitoisuuksilla niiden tehon suhteen estää viruksen replikaatio solunviljelyjärjestelmissä, 25 jotka tukevat viruksen replikaatiota ja sitten viruspatogeenin infektiivisyyden eston suhteen (ja alhaisen tason myrkyllisyyden suhteen) eläinmallijärjestelmässä. Nämä menetelmät ja koostumukset, jotka tässä annetaan HCV-antigeenien ja HCVpolynukleotidien havaitsemiseksi, ovat hyödyllisiä virusten vastaisten aineiden 30 seulonnassa siinä, että antavat vaihtoehdon ja ehkä herkemmän välineen aineen tehon havaisemiseen virusreplikaation suhteen, kuin soluplalckianalyysi tai ID50-analyysi. Esimerkiksi tässä kuvattuja FICV-polynukleotidikoettimia voidaan käyttää soluviljelmässä tuotetun virusnuldeiinihapon määrän selvittämisessä. Tämä voitaisiin tehdä esimerkiksi infektoitujen solunukleiinihappojen hybridisaation tai kompetitiohybri- 35 disaation avulla leimaten HCV-polynuldeotidikoettimen kanssa. Esimerkiksi myös anti- HCV-vasta-aineita voidaan käyttää soluviljelmässä olevien HCV-antigeenien tunnistamiseen ja niiden määrän selvittämiseen käyttäen tässä kuvattuja immunologisia

42 40 analyysejä. Lisäksi, koska voi olla toivottavaa selvittää HCV-antigeenien määrä infektoidussa soluviljelmässä kompetitioanalyysillä, tässä kuvattuihin HCV:n cdna:oihin koodatut polypeptidit ovat hyödyllisiä näissä kompetitioanalyyseissä. Yleisesti yhdistelmä-hcv-polypeptidi, joka on peräisin HCV:n cdna:sta, voisi olla 5 leimattu ja tämän leimatun polypeptidin sitoutumisen estoa HCV-polypeptidiin soluviljelmäjärjestelmässä tuotetun antigeenin takia, tarkkailtaisiin. Lisäksi nämä tekniikat ovat erityisen hyödyllisiä tapauksissa, joissa HCV voi kyetä replikoitumaan solulinjassa aiheuttamatta solukuolemaa. 10 II.M T-IeikennettyjPn HCV-kantnjen valmistaminen Edellisen lisäksi, käyttäen kudosviljelyjärjestelmiä ja/tai eläinmallijärjestelmiä, voi olla mahdollista eristää heikennettyjä HCV-kantoja. Nämä kannat olisivat sopivia virusantigeenien eristämistä varten. Heikennetyt kannat ovat eristettävissä käytyään 15 monia kertoja soluviljelmässä ja/tai eläinmallissa. Heikentyneen kannan havaitseminen infektoidussa solussa tai yksilössä voidaan saada aikaan alalla twmetuilla tekniikoilla ja voisi sisältää esimerkiksi vasta-aineiden käytön yhtä tai useampaa epitooppia vastaan. joka on koodattu HCV:ssa, koettimena tai sellaisen polynukleotidin käytön, joka sisältää HCV-sekvenssin, jossa on ainakin noin 8 nukleotidia, koettimena. Vaihtoeh- 20 toisesti tai sen lisäksi heikentynyt kanta voidaan rakentaa käyttäen tässä annettua HCV:n genomitietoa ja käyttäen yhdistelmätekniikkaa. Yleisesti voitaisiin yrittää poistaa sellainen genomin alue, joka koodaa esimerkiksi polypeptidiä, joka liittyy patogeenisyyteen, mutta joka sallii virusreplikaation. Lisäksi genomin rakenne voisi sallia sellaisen epitoopin ekspression, joka synnyttää neutraloivia vasta-aineita HCV:11e. 25 Muutettua genomia voitaisiin sitten käyttää transformoimaan soluja, jotka sallivat replikaation ja soluja, jotka on kasvatettu olosuhteissa, jotka sallivat virusreplikaation. Heikentyneet HCV-kannat ovat hyödyllisiä virusantigeenien kaupallisen tuotannon lähteinä, koska näiden viruksien käsittely vaatisi vähemmän ankaria suojaustoimenpiteitä työntekijöille, jotka toimivat virustuotannossa ja/tai 30 virustuotteiden tuotannossa. III Yleisiä menetelmiä Yleiset tekniikat, joita käytetään genomin uuttamiseen viruksesta, cdna-kirjaston 35 valmistamiseen ja testaamiseen, kloonien sekventoimiseen, ekspressiovektoreiden rakentamiseen, solujen transformoimiseen, immunologisten analyysien, kuten radioimmunologiset analyysit ja ELISA-analyysit, suorittamiseen, solujen

43 10E kasvattamiseen viljelmässä ja sen kaltaisiin, ovat alalla tunnettuja ja laboratoriokäsikirjoja, jotka kuvaavat näitä tekniikoita, on saatavana. Kuitenkin yleisenä ohjeena seuraava asettaa esiin muutamia lähteitä, jotka ovat nykyään saatavilla sellaisia menettelyjä varten ja materiataletararten, jotka ovat hyödyllisiä niiden suorittamiseksi. hännät ja ekcprpccinn cafitöspkven5sit Sekä prokariootti- että eulcariootti-isäntäsoluja voidaan käyttää haluttujen koodaussekvenssien ekspressiota varten, kun käytetään sopivia säätösekvenssejä. jotka 10 ovat yhteensopivia aiotun isännän kanssa. Prokariootti-isäntien joukosta käytetään useimmiten E. Coli'a. Ekspression säätösekvenssit prokarioottisoluja varten sisältävät promoottoreita, jotka sisältävät mahdollisesti operaattoriosia, ja ribosomin sitoutumispaikkoja. Siirtovektorit, jotka ovat yhteensopivia prokariootti-isäntien kanssa, ovat yleensä peräisin esimerkiksi pbr322:sta, plasmidista, joka sisältää operoneja, jotka 15 anatavat ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssin ja erilaisia puc-vektoreita, jotka myös sisältävät sekvenssejä, jotka antavat antibioottiresistenssimarkkereita. Näitä markkereita voidaan käyttää saamaan onnistuneita transformantteja valinnan kautta. Yleisesti käytetyt prokarioottisäätösekvenssit sisältävät betalaktamaasi- (penisillinaasi) ja laktoosipromoottorijärjestelmiä (Chang et al. (1977)), tryptofaanipromoottorijärjestelmän 20 (trp)(goeddel et al. (1980)) ja lambdajohdetun PL-promoottorin ja N-geenin ribosomin sitoutumispaikan (Shimatake et al. (1981)) ja hybridin tac-promoottorin (De Boer et al. (1983)), joka on peräisin trp-ja lac-uv5-promoottoreiden sekvensseistä. Edelläolevat järjestelmät ovat erityisen yhteensopivia E. Coli:n kanssa; haluttaessa voidaan käyttää muita prokariootti-isäntiä, kuten Bacillus- tai Pseudomonas-kantoja voidaan käyttää 25 vastaavien säätösekvenssien kanssa. Eukariootti-isännät sisältävät hiiva- ja nisäkässolut viljelyjärjestelmissä Sarrharnmyees Cereviqine ja garrharnmyneg carlshergensis ovat yleisimmin käytettyjä hiivaisäntiä ja ne ovat mukavia sieni-isäntiä. Hiivaan sopivat vektorit omaavat markkereita, jotka sallivat 30 onnistuneiden transformanttien valinnan anatamalla prototrofian auksotrooppisille mutanteille tai resistenssin raskaine metalleille villityyppisillä kannoilla. Hiivojen kanssa yhteensopivat vektorit voivat käyttää 2 p.m:n replikaatioalkua (Broach et al. (1983)), CEN3:n ja ARS1:n yhdistelmää tai muita välineitä replikaation varmistamiseksi, kuten sekvenssejä, jotka aikaansaavat sopivan fragmentin liittymisen 35 isäntäsolun genomiin. Säätösekvenssit hiivavektoreita varten ovat tunnettuja alalla ja sisältävät promoottoreita glykolyyttisten entsyymien synteesiä varten (Hess et al. (1968); Holland et al. (1978)), sisältäen promoottorin 3-fosfoglyseraattikinaasia varten

44 42 (Hitzeman (1980)). Terminaattoreita voidaan myös sisällyttää, kuten niitä, jotka ovat peräisin enolaasigeenistä (Holland (1981)). Erityisen hyödyllisiä säätöjärjestelmiä ovat ne, jotka käsittävät glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasipromoottorin (GAPDH) tai alkoholidehydrogenaasin (ADH) säädettävän promoottorin, terminaattoreita, jotka ovat 5 peräisin myös GAPDH:sta ja jos halutaan eritystä, johtosekvenssit hiivan alfatekijästä. Lisäksi transkriptiota säätävä alue ja transkription aloittava alue, jotka ovat toiminnallisesti liitettyjä toisiinsa, voivat olla sellaisia, että ne eivät luonnostaan liity villityyppisiin organismeihin. Näitä järjestelmiä kuvataan yksityiskohtaisesti EPjulkaisuissa 120,551, julkaistu ; 116,201, julkaistu ja 164,556, jul- 10 kaistu , jotka ovat kaikki tämän keksinnön hakijan omistuksessa ja joihin tässä viitataan. Imettäväissolulinjat, jotka ovat saatavissa isäntinä ekspressiota varten, ovat tunnettuja alalla ja sisältävät monia elossa pidettyjä solulinjoja, jotka ovat saatavilla American 15 Type Culture Collection'ista (ATCC), sisältäen HeLa-solut, kiinalaisen hamsterin munasarjasolut (CHO), hamsterinpoikasen munuaissolut (BHK) ja lukuisia muita solulinjoja. Alalla tunnetaan myös sopivia promoottoreita imettäväissoluja varten ja ne sisältävät viruspromoottoreita, kuten ne jotka ovat peräisin Ihmisapinaviruksesta 40 (SV40)(Fiers (1978)), Rous'n sarkoomaviruksesta (RSV), adenoviruksesta (ADV) ja 20 härän papilloomaviruksesta (BPV). Imettäväissolut voivat myös vaatia terminaattorisekvenssejä ja poly-a-additiosekvenssejä; vahvistussekvenssejä, jotka lisäävät ekspressiota voidaan myös sisällyttää ja sekvenssit, jotka aiheuttavat geenin amplifikaation, voivat olla myös haluttavia. Nämä sekvenssit ovat alalla tunnettuja. Imettäväissoluissa tapahtuvaa replikaatiota varten sopivat vektorit voivat sisältää 25 virusreplikoneja tai sekvenssejä, jotka varmistavat sopivien NANBV-epitooppeja koodaavien sekvenssien integraation isäntägenomiin. III B Tr2 ns.fnrrnaatint 30 Transformaatio voidaan suorittaa millä tahansa tunnetulla menetelmällä polynukleotidien viemiseksi isäntäsoluun, sisältäen esimerkiksi polynukleotidin pakkaamisen virukseen ja isäntäsolun muuntamisen viruksella tai polynukleotidin suoralla otolla. Käytetty transformaatiomenettely riippuu trasformoitavasta isännästä. Esimerkiksi E. Coli-isäntäsolujen transformaatiosta BB-NANBV-sekvenssejä sisäl- 35 tävällä lambda-gtll-vektorilla keskustellaan esimerkkiosassa alla. Bakteeritransformaatio suoralla otolla yleensä käyttää käsittelyä kalsium- tai rubidiumkloridilla (Cohen (1972); Maniatis (1982)). Hiivatransformaatio suoralla otolla voidaan suorit-

45 43 taa käyttäen Hinnen et al. (1978) menetelmää. Imettäväistransformaatio suoralla otolla voidaan suorittaa käyttäen kalsiumfosfaattisaostusta, jonka ovat esittäneet Graham ja Van der Eb (1978) tai sen erilaisia tunnettuja muunnoksia. 5 III C Vektnrin rakentaminen 15 Vektorin rakentaminen käyttää tekniikoita, jotka ovat alalla tunnettuja. Paikkaspesifinen DNA-lohkaisu suoritetaan käsittelemällä sopivilla restriktioentsyymeillä olosuhteissa, jotka on yleensä määritellyt näiden kaupallisesti saatavien entsyymien valmistaja. o Yleensä noin 1µg plasmidia tai DNA-sekvenssiä lohkaistaan 1 yksiköllä entsyymiä noin 20 µ1:n puskuriliuoksessa inkuboimalla 1-2 tuntia 37 C lämpötilassa. Restriktioentsyymillä inkuboinnin jälkeen proteiini poistetaan fenoli/kloroformiuutoksella ja DNA palautetaan saostamalla etanolilla. Lohjenneet fragmentit voidaan erottaa käyttäen polyakryyliamidi- tai agaroosigeelielektroforeesitekniikoita niiden yleisten menettelytapojen mukaan, jotka löydetään julkaisusta Methods in Enzymology (1980) 65: Tarttuvapäisiä lohlcaisufragmentteja voidaan typistää päästään käyttäen E.Coli'n DNApolymeraasi I:tä /Klenow) sopivien deoksinukleotiditrifosfaattien (dntp) ollessa läsnä seoksessa. Käsittelyä S 1 -nukleaasilla voidaan myös käyttää, mistä tulee tulokseksi minkä tahansa yksisäikeisen DNA-osan hydrolyysi Liittämiset suoritetaan käyttäen standardeja puskuri- ja lämpötilaolosuhteita käyttäen T4-DNA-ligaasia ja ATP:tä; tarttuvapäiset liittämiset vaativat vähemmän ATP:tä ja vähemmän ligaasia kuin tylppäpäiset liitokset. Kun vektorifragmentteja käytetään osana liitosseosta, vektorifragmenttäkäsitellään usein bakteerisella alkaalifosfataasilla (BAP) tai vasikan suolen alkaalifosfataasilla 5'-fosfaatin poistamiseksi ja täten vektorin uudelleen liittymisen estämiseksi; vaihtoehtoisesti haluamattomien fragmenttien restriktioentsyymikatkominen voidaan suorittaa liittymisen estämiseksi. Liittymisseokset transformoidaan sopiviin kloonausisäntiin, kuten E.Coli'in ja onnistuneet transformantit valitaan esimerkiksi antibioottiresistenssin perusteella ja ne seulotaan oikean rakenteen löytämiseksi. 35

46 44 III D T-Tailnthijpn TNIX-cekvenssien rakentip Synteettisiä oligonuldeotideja voidaan valmistaa käyttäen automatisoituja oligonukleotidisyntetisoijia, kuten Warner (1984) kuvaa. Haluttaessa synteettiset säikeet 5 voidaan leimata fosfori-32:11a käsittelemällä polynuldeotidikinaasilla 32P-ATP:n läsnäollessa käyttäen standardeja reaktio-olosuhteita. DNA-sekvenssejä, mukaanlukien ne, jotka on eristetty cdna-kirjastoista, voidaan muokata tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen esimerkiksi paikkasuunnatun mutagenoillnin, 10 jota on kuvannut Zoller (1982). Lyhyesti muokattava DNA pakataan faagiin yksisäikeisenä sekvenssinä ja se muutetaan kaksisäikeiseksi DNA:ksi DNApolymeraasilla käyttäen primerinä synteettistä oligonukleotidia, joka on komplementaarinen DNA:n muokattavalle osalle ja jossa on haluttu modifikaatio sisältyvänä omaan sekvenssiinsä. Tuloksena oleva kaksisäikeinen DNA transformoi- 15 daan faagiin, joka kantaa isäntäbakteeria. Transformoidun bakteerin viljelmät, jotka sisältävät faagin kunkin säikeen replilcaatioita, pinnoitetaan agarilla plakkien saamiseksi. Teoreettisesti 50 % uusista plakeista sisältää faagin, jossa on mutaattisekvenssi ja jäljellä olevassa 50 %:ssa on alkuperäinen sekvenssi. Plakkien replikaatit hybridisoidaan leimattuihin synteettisiin koettimiin lämpötiloissa ja olosuhteissa, jotka sallivat 20 hybridisaation oikean säikeen kanssa, mutta ei modifioimattoman sekvenssin kanssa. Sekvenssit, jotka on tunnistettu hybridisaation avulla, palautetaan ja kloonataan. III E J-lybridignatin knpttimpn IcAnSQR 25 DNA-kirjastoja voidaan seuloa koettimilla käyttäen Grunsteinin ja Hognessin (1975) menetelmää. Lyhyesti tässä menettelyssä tutkittava DNA immobilisoidaan nitroselluloosafilttereille, denaturoidaan ja esihybridisoidaan puskurin kanssa, joka sisältää 0-50 formamidia, 0,75 M NaCl:a, 75 mm Na-sitraattia, 0,02 %(w/v) häränseerumialbumiinia, polyvinyylipyrrolidonia ja Fricoll'ia kutakin, 50 mm Na-fosfaattia (ph 6,5), 0,1 30 % SDS:a ja 100 p.g/m1 kantajadenaturoitua DNA:ta. Formamidin prosenttimäärä puskurissa ja myös esihybridisaatio- ja sen jälkeisen hybridisaatiovaiheiden aika- ja lämpötilaolosuhteet riippuvat vaadittavasta ankaruudesta. Oligomeerikoettimia, jotka vaativat alhaisemman ankarat olosuhteet, käytetään yleisesti alhaisten formamidimäärien, alhaisempien lämpötilojen ja pitempien hybridisaatioaikojen kanssa. Koettimet, 35 jotka sisältävät enemmän kuin 30 tai 40 nukleotidia, kuten ne, jotka ovat peräisin cdna:sta tai genomisekvensseistä käyttävät yleensä korkeampia lämpötiloja, esim. noin C ja korkeaa formamidipitoisuutta, esim. 50 %. Seuraten esihybridisaatiota

47 '-32P-leimattu oligonukleotidikoetin lisätään puskuriin ja filttereitä inkuboidaan tässä seoksessa hybridisaatio-olosuhteissa. Pesun jälkeen käsitellyt filtterit autoradiografoidaan hybridisoidun koettimen paikan osoittamiseksi; DNA:ta vastaavissa paikoissa alkuperäisillä agarlevyillä käytetään halutun DNA:n lähteenä. II F R akentppn ja geleventnimispn tntepnnäyttäminell Rutiineja vektorirakenteita varten liitosseokset transformoidaan E.Coli-kantaan HB101 tai muuhun sopivaan isäntään ja onnistuneet transformantit valitaan antibioottiresistens- 10 sin tai muiden markkereiden avulla. Sitten valmistetaan plasmideja transformanteista Clewell et al. (1969) esittämän menetelmän mukaisesti, tavallisesti seuraten klooriamfenikoliamplifikaatiota (Clewell (1972)). DNA eristetään ja analysoidaan tavallisesti restriktioentsyymianalyysin ja/tai sekventoimisen avulla. Sekventoiminen voidaan tehdä dideoksimenetelmällä, jonka on esittänyt Sanger et al. (1977) ja jota on edelleen 15 kuvannut Messing et al. (1981) tai menetelmällä, jonka on kuvannut Maxam et al. (1980). Ongelmat, jotka liittyivät nauhojen kokoonpuristumiseen, mitä huomataan joskus GC-rikkailla alueilla, voitettiin käyttämällä T-deatsoguanosiinia Barr et al. (1986) mukaisesti. 20 III G FritqyyminliittÄvÄ immunnsorbentti analyysi Entsyyminliittävää immunosorbenttia analyysiä (ELISA) voidaan käyttää mittaamaan joko antigeeni- tai vasta-ainepitoisuuksia. Tämä menetelmä riippuu entsyymin liittymisestä joko antigeeniin tai vasta-aineeseen ja se käyttää sidotun entsyymin 25 aktiivisuutta kvantitatiivisena leimana. Vasta-aineen mittaamiseksi tunnettu antigeeni kiinnitetään kiinteään faasiin (esim. mikrolevyyn tai muovikuppiin), sitä inkuboidaan tutkittavan seerumin laimennoksilla, pestään, inkuboidaan entsyymillä leimatun anti-immunoglobuliinin kanssa ja pestään taas. Leimaukseen sopivat entsyymit ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi piparjuuriperoksidaasin. Kiinteään faasin sidottu 30 entsyymiaktiivisuus mitataan lisäämällä spesifistä substraattia ja määrittämällä tuotteen muodostuminen tai substraatin käyttö kolorimetrisesti. Sidottu entsyymiaktiivisuus on suora sidotun vasta-aineen määrän funktio. Antigeenin mittaamiseksi kiinnitetään tunnettu spesifinen vasta-aine kiinteään faasiin, 35 lisätään tutkittava materiaali, joka sisältää antigeenin, inkuboinnin jälkeen kiinteä faasi pestään ja lisätään toinen entsyymileimattu vasta-aine. Pesun jälkeen lisätään substraatti

48 46 ja entsyymiaktiivisuus arvioidaan kolorimetrisesti ja se suhteutetaan antigeenipitoisuuteen. W FcimprIrit 5 Alla on kuvattu tämän keksinnön esimerkkejä, jotka on annettu vain kuvaamistarkoituksessa, eikä rajoittamaan tämän keksinnön piiriä. Tämän selvityksen valossa lukuisat suoritusmuodot vaatimusten suojapiirissä ovat ilmeisiä alan keskitason ammattimiehille. Esitettyjä menettelytapoja, esimerkiksi osassa IV.A. olevia, voidaan 10 haluttaessa toistaa, muttei siihen ole tarvetta, koska saatavailla on tekniikoita haluttujen nukleotidisekvenssien rakentamiseksi perustuen keksinnön antamaan tietoon. Ekspressio on valaistu esimerkein E.Coli'ssa; kuitenkin muitakin järjestelmiä on saatavilla, kuten on täydellisemmin kuvattu osassa III.A. Voidaan tuottaa myös lisäepitooppeja, jotka ovat peräisin genomirakenteesta ja niitä voidaan käyttää vasta-aineiden 15 synnyttämiseen, kuten on esitetty alla. IV A Jf'V rt cfn4 a valmistuc, eristys ja qelevpntoiminen. 20 IV.A CV n r1")/\ta n valmictils NANB-aiheuttajan lähde oli plasmavarasto, joka oli peräisin simpanssista, jolla oli krooninen NANBH. Simpanssi oli kokeellisesti tartutettu toisen simpanssin verellä. jolla simpanssilla oli krooninen NANBH, joka oli tulos HCV-infektiosta ihmisen varastoidun seerumin tekijä-8-rikasteen kontaminoituneesta erästä. Simpanssin plasman 25 varasto tehtiin yhdistämällä monia yksittäisiä plasmaeriä, jotka sisälsivät korkeita 30 alaniiniaminotransferaasiaktiivisuuden tasoja; tämä aktiivisuus on tulos HCV-infektion aiheuttamasta maksavauriosta. Koska 1 ml laimennosta 104 tästä varastoidusta seerumista annettuna suonensisäisesti aiheutti NANBH:n toisessa simpanssissa, sen CID oli ainakin 106/ml, s.o. sen infektiotiitteri oli korkea. Luotiin cdna-kirjasto korkean tiitterin plasmavarastosta seuraavasti. Ensiksi eristettiin viruspartikkelit plasmasta; 90 ml:n erä laimennettiin 310 ml:11a liuosta, joka sisälsi 50 mm Tris-HC1, ph 8,0, 1 mm EDTA, 100 mm NaCI. Haluamaton aines poistettiin linkoamalla 20 minuuttia nopeudella x g 20 C lämpötilassa. Tuloksena olevassa 35 nesteessä olevat viruspartikkelit pelletoitiin linkoamalla Beckman SW28-roottorissa kierr/min 5 tuntia 20 C:ssa. Virusgenomin vapauttamiseksi partiklclelit rikottiin suspendoimalla pelletit 15 ml:aan liuosta, joka sisälsi 1 % natriumdodekyylisulfaattia

49 47 (SDS), 10 mm EDTA, 10 mm Tris-HC1, ph 7,5, ja myös 2 mg/ml proteinaasi k:ta, mitä seurasi 90 minuutin inkubaatio 45 C:ssa. Nuldeiinihapot eristettiin lisäämällä 0,8 1.tg MS2-bakteriofaagi-RNA:ta kantajana ja uuttamalla seosta neljä kertaa 1:1-seoksella fenolia ja kloroformia (fenoli oli kyllästetty 0,5 M Tris-HC1:11ä, ph 7,5, 0,1 % (v/v) 5 betamerkaptoetanoli, 0,1 % (w/v) hydroksilcinoloni, niitä seurasi uuttaminen kaksi kertaa kloroformilla. Vesifaasi konsentroitiin 1-butanolin kanssa ennen saostamista 2,5 kertaisella tilavuudella absoluuttista etanolia yli yön -20 C:ssa. Nukleiinihappo palautettiin linkoamalla Beckman SW41-roottorissa kierr/min 90 minuutin ajan 4 C:ssa ja se liuotettiin veteen, jota oli käsitelty 0,05 % (v/v) dietyylipyrokarbonaatilla 10 ja autoklaavilcäsiteltiin. Ylläolevalla menettelyllä saatu nukleiinihappo (<2 p.g) denaturoitiin 17,5 mm CH3HgOH:lla; cdna syntetisoitiin käyttäen tätä denaturoitua nukleiinihappoa mallineena ja se kloonattiin EcoRl-kohtaan faagissa lambda-gt 1 1 käyttäen menetelmiä, 15 jotka on kuvannut Huynh (1985), paitsi että satunnaisprimerit korvasivat oligo(dt)-12-18:n ensimmäisen cdna-iderteen synteesin aikana käänteistranskriptaasilla (Taylor et al. (1976)). Tuloksena olevat kaksoiskierteelliset cdna:t fraktioitiin koon mukaan Sepharose CL-4B-kolonnissa; keslcikooltaan noin 400, 300, 200 ja 100 emäsparia oleva eluoitu materiaali varastoihin cdna-varastoihin 1, 2, 3 ja vastaavasti 4. Lambda-gt11-20 cdna-kirjasto luotiin varaston 3 cdna:sta. Varastosta 3 luotu lambda-gtl 1-cDNA-kirjasto seulottiin sellaisten epitooppien suhteen, jotka voisivat sitoutua spesifisesti seerumiin, joka on peräisin potilaasta, jolla oli aikaisemmin ollut NANBH. Noin 106 faagia seulottiin potilasseerumilla käyttäen Huynh 25 et al. (1985) menetelmiä, lukuunottamatta sitä, että sidottu ihmisen vasta-aine osoitettiin lampaan anti-ihmis-ig-antiseerumilla, joka oli radioleimattu '251:lla. Viisi positiivista faagia tunnistettiin ja puhdistettiin. Nämä viisi positiivista faagia tutkittiin sitten spesifisyyden suhteen sitoutua kahdeksan eri ihmisen, joilla oli aikaisemmin ollut NANBH, seerumiin käyttäen samaa menetelmää. Neljä faageista koodasi polypeptidiä, joka reagoi 30 immunologisesti vain yhden ihmisseerumin kanssa, s.o. sen yhden kanssa, jota käytettiin faagikirjaston alkuseulontaan. Viides faagi (5-1-1) koodasi polypeptidiä, joka reagoi immunologisesti viiden kanssa kahdeksasta tutkitusta seerumista. Lisäksi tämä polypeptidi ei reagoinut immunologisesti seitsemän normaalin verenluovuttajan seerumien kanssa. Siksi näyttää siltä, että klooni koodaa polypeptidiä, jonka spesifisesti 35 tunnistaa immunologisesti NANB-potilaiden seerumi.

50 48 IV.A.2. T-ICV n enna-qekvenssft yhdistplrnm'aag*cq2 jotka on knnriattn PM CPICl/PTICCiirt -1 ja po4peptidisekvenssit. Yhdistelmäfaagissa oleva cdna sekventoitiin Sanger'in et al. (1977) 5 menetelmällä. Olennaista oli, että cdna poistettiin EcoRI:lla ja eristettiin koon mukaan 10 fraktioimalla käyttäen geelielektroforeesia. EcoRI-restriktiofragmentit alildoonattiin M13-vektoreihin mpl8 ja mp19 (Messing (1983)) ja ne sekventoitiin käyttäen dideoksiketjun Sanger'in et al. (1977) terminaatiomenetelmää. Saatu sekvenssi on esitetty kuviossa 1. Kuviossa 1 koodattu polypeptidi, joka on koodattu HCV:n cdna:ssa, on sama translaatioalue kuin N-pään betagalaktosidaasipuolisko, johon se on fuusioitu. Kuten esitetään osassa IV.A :n translaation avoin lukualue (ORF) koodaa epitooppeja. jotka sellaisten potilaiden ja simpanssien seerumi, joilla on NANBH-infektio, 15 spesifisesti tunnistaa. IV A 3 IICV:n_cDNA:nja_lclooninid.Lcl/s.I.A:n_päällekkäistenasieneristäminen HCV:n cdna:n ja kloonin cdna:n päällekkäisyys saatiin seulomalla samaa 20 lambda-gt 1 1-kirjastoa, joka luotiin osassa IV.A.1. kuvatusti, synteettisellä polynukleotidilla, joka oli peräisin HCV:n cdna:n sekvenssistä klooneissa 5-1-1, kuten esitetään kuviossa 1. Seulomiseen käytetyn polynukleotidin sekvenssi oli: 5'-TCC CTT GCT CGA TGT ACG GTA AGT GCT GAG AGC ACT CTT CCA 25 TCT CAT CGA ACT CTC GGT AGA GGA CTT CCC TGT CAG GT-3'. Lambda-gt11-kirjasto seulottiin tällä koettimella käyttäen menetelmää, jonka on kuvannut Huynh (1985). Arviolta yksi kloonista hybridisoitui koettimen kanssa. Kolme kloonia, jotka sisälsivät cdna:oita, jotka hybridisoituivat synteettisen koettimen 30 kanssa, on numeroitu 81, 1-2 ja 91. IV.A.4. noklentirlicekvencsit 35 Klooneissa 81, 1-2 ja 91 olevien kolmen cdna:n nukleotidisekvenssit määritettiin olennaisesti osan IV.A.2. tavalla. Näiden kloonien sekvenssit suhteessa HCV:n cdnasekvenssiin faagissa on esitetty kuviossa 2, joka esittää säikeen, joka koodaa

51 49 - havaittua HCV-epitooppia ja missä nukleotidisekvensseissä olevat homologiat on merkitty sekvenssien välisillä pystyviivoilla. Kloonatun HCV:n cdna:iden sekvenssit ovat erittäin homologisia päällekkäin 5 menevillä elueilla (ks. kuvio 2). Kuitenkin eroja on kahdella alueella. Nukleotidi 67 kloonissa 1-2 on tymidiini, kun taas kolme muuta kloonia sisältävät sytidiinijäännöksen tässä asemassa. On huomattava, kuitenkin, että sama aminohappo on koodattu, kun joko C tai T on tässä asemassa. 10 Toinen ero on, että klooni sisältää 28 emäsparia, joita ei ole kolmessa muussa kloonissa. Nämä emäsparit esiintyvät 5-1-1:n cdna-sekvenssin alussa ja niitä merkitään pienillä kirjaimilla. Perustuen radioimmunologisen analyysin tietoihin on mahdollista, että HCV-epitooppi voi olla koodattuna tähän 28 emäsparin alueeseen :n 28 emäsparin puuttuminen klooneista 81, 2-1 ja 91 voi tarkoittaa, että näiden kloonien cdna on peräisin viallisista HCV-genomeista; vaihtoehtoisesti 28 emäsparin alue voisi olla päätetekotuote ldoonissa Pienten kirjaimien sekvenssit kloonien 81 ja 91 nuldeotidisekvensseissä merkitsevät 20 yksinkertaisesti sitä, että näitä sekvenssejä ei ole löydetty muista cdna:ista, koska cdna:ita, jotka menevät päällekkäin näiden alueiden kanssa, ei ollut vielä eristetty. HCV:n cdna-sekvenssiyhdistelmä, joka oli peräisin kloonien 5-1-1, 81, 1-2 ja 91 päällekkäin menevistä cdna:ista, on esitetty kuviossa 3. Kuitenkin tässä kuviossa on 25 jätetty esittämättä kloonin ainutkertaiset 28 emäsparia. Kuvio esittää myös sen polypeptidin sekvenssin, joka onkoodattu HCV:n cdna-yhdistelmän ORF:ään. 30 IV A 5 HCV n ri")na iden ja kloonirl 81 cdna n päällekkäin menevien solin eristäminen HCV:n cdna-sekvenssien, jotka ovat ylävirtaan päin kloonin 81 cdna:sta ja menevät päällekkäin sen kanssa, eristäminen suoritettiin seuraavasti. Lambda-gtl 1-kirjasto, joka oli valmistettu, kuten kuvattiin osassa IV.A.1., seulottiin hydridisoimalla synteettisellä polynuldeotidikoettimella, joka oli homologinen ldoonin 81 5'-pään kanssa. Kloonin sekvenssi on esitetty kuviossa 4. Seulomiseen käytetyn synteettisen polynukleotidin sekvenssi oli:

52 50 5' CTG TCA GGT ATG ATT GCC GGC 1TC CCG GAC 3'. Menetelmät olivat olennaisesti samat kuin ne, jotka Huynh (1985) oli kuvannut, paitsi että kirjastofiltterit pestiin kahdesti ankarissa olosuhteissa. s.o. pesut suoritettiin 5 x 5 SSC, 0,1 % SDS 55 C kukin 30 minuuttia. Arviolta :sta kloonista hybridisoitui koettimen kanssa. Positiivinen yhdistelmäfaagi, joka sisälsi cdna:ta, joka hybridisoitui sekvenssin kanssa, eristettiin ja puhdistettiin. Tämä faagi on numeroitu klooniksi 36. Alavirtaan päin olevat cdna-sekvenssit, jotka menevät päällekkäin kloonin 81 cdna:n karboksyylipäisien sekvenssien kanssa, eristettiin käyttäen menettelytapaa, joka oli 10 samanlainen kuin se, joka käytettiin ylävirtaan olevien cdna-sekvenssien eristämiseen, paitsi että valmistettiin synteettinen oligonuldeotidikoetin, joka oli homologinen kloonin 81 3'-pään sekvenssin kanssa. Seulomiseen käytetyn synteettisen polynukleotidin sekvenssi oli: 15 5' TTT GGC TAG TGG TTA GTG GGC TGG TGA CAG 3'. Positiivinen yhdistelmäfaagi, joka sisälsi cdna:ta, joka hybridisoitui jälkimmäisen sekvenssin kanssa, eristettiin ja puhdistettiin ja se on numeroitu Idooniksi IV A 6 PCV n rt)na n nukleotidisekvenssi kinnniccn 16 cdna:n nukleotidisekvenssi kloonissa 36 määritettiin olennaisesti samoin kuin on kuvattu osassa IV.A.2. Tämän cdna:n kaksisäikeinen sekvenssi, sen kloonin 81 HCV:n cdna:n kanssa päällekkäinen alue ja ORF:n koodaama polypeptidi on esitetty 25 kuviossa 5. Kloonin 36 ORF on samassa translaatioalueessa kuin klooniin 81 koodattu HCVantigeeni. Täten, yhdistelmänä, kloonien 36 ja 81 ORF:t koodaavat polypeptidiä, joka edustaa osaa suuresta HCV-antigeenistä. Tämän oletetun HCV-polypeptidin sekvenssi 30 ja sitä koodaava kaksisäikeinen DNA-sekvenssi, joka on peräisin kloonien 36 ja 81 HCV:n cdna:iden yhdistetyistä ORF:istä, on esitetty kuviossa 6. IV A 7 fcv n cdna n nuldeotidisekvpmcit kinnnice.a 35 cdna:n nukleotidisekvenssi kloonissa 32 määritettiin olennaisesti kuten kuvattiin osassa IV.A.2. kloonin sekvenssiä varten. Sekvenssitieto merkitsi, että kloonin 32 yhdistelmäfaagin cdna oli peräisin kahdesta eri lähteestä. cdna:n yksi fragmentti

53 10E muodostui 418 nukleotidista, jotka olivat peräisin HCV-genomista; toinen fragmentti muodostui 172 nukleotidista, jotka olivat peräisin bakteriofaagin MS2 genomista, jota oli käytetty kantajana plasman lambda-gt11-cdna-idrjaston valmistuksessa. 5 Kloonin 32 cdna:n sekvenssi vastasi kuviossa 7 esitetyn HCV-genomin sekvenssiä. Se sekvenssialue, joka menee päällekkäin kloonin 81 kanssa ja ORF:n koodaama polypeptidi on myös esitety kuviossa. Tämä sekvenssi sisältää yhden jatkuvan ORF:n, joka on samalla translaatioalueella kuin klovnin 81 koodaama HCV-antigeeni. 10 IV.A.8. HCV n ctlna n ja klonnin 36 cnna n pämieuckin_ mpne_vän_ahleen. eriqtäminpil, HCV:n cdna-sekvenssien, jotka olivat ylävirtaan kloonin 36 cdna-sekvenssistä ja menivät päällekkäin sen kanssa, eristäminen suoritettiin kuten kuvattiin osassa IV.A kloonin 81 cdna:n sekvenssin kanssa päällekkäin menevän sekvenssin yhteydessä, paitsi että synteettinen polynukleotidi perustui kloonin 36 5'-alueeseen. Seulontaan käytetyn synteettisen polynuideotidin sekvenssi oli: 20 5' AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG CTC AAG CCC 3'. Arviolta :sta kloonista hybridisoitui koettimen kanssa. Eristetty, puhdistettu yhdistelmäfaagin klooni, joka sisälsi cdna:ta, joka hybridisoitui tähän sekvenssiin. nimettiin klooniksi IV A 9 T-TC`V n tfna n nnicleotidiqek-vpncgi kinnniqca 3 30 cdna:n nukleotidisekvenssi kloonissa 35 määritettiin olennaisesti samoin kuin kuvattiin osassa IV.A.2. Sekvenssi, sen päällekkäin menevä alue kloonin 36 cdna:n sekvenssin kanssa ja siihen koodattu oletettu polypeptidi ovat esitetyt kuviossa 8. Klooni 35 sisältää ilmeisesti yksinkertaisen jatkuvan ORF:n, joka koodaa polypeptidiä samassa translaatioalueessa kuin se, jota koodaavat kloonit 36, 81 ja 32. Kuvio 9 esittää pitkän jatkuvan ORF:n sekvenssin, joka ulottuu kloonien 35, 36, läpi siihen koodattua oletettua HCV-polypeptidiä pitkin. Tämä yhdistetty sekvenssi on vahvistettu 35 käyttäen muita riippumattomia cdna-klooneja, jotka ovat peräisin samasta lambdagt11-kirjastosta.

54 52 IV.A.10 LICIL:nrIINA:n4akloonin35 äälleideäistea_osien eristäminen HCV:n cdna-sekvenssien, jotka ovat ylävirtaan kloonin 35 cdna:sta ja menevät päällekkäin sen kanssa, eristäminen suoritettiin kuten on kuvattu osassa IV.A.8. niitä 5 sekvenssejä varten, jotka menevät päällekkäin kloonin 36 cdna:n kanssa, paitsi että synteettinen polynukleotidi perustui kloonin 35 5'-alueeseen. Seulontaan käytetyn synteettisen polynukleotidin sekvenssi oli: ' CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT 3'. Arviolta 1 klooni 50000:sta hybridisoitui koettimen kanssa. Eristetty, puhdistettu yhdistelmäfaagin klovni, joka sisälsi cdna:ta, joka hybridisoitui tähän sekvenssiin, nimettiin klooniksi 37b. IV.A.11 PrV ri nnklpntidicpkvpncqi lelnnniqca 17b cdna:n nuldeotidisekvenssi kloonissa 37b määritettiin olennaisesti kuten osassa IV.A.2. Sekvenssi, sen päällekkäin menevä alue kloonin 35 cdna:n kanssa ja siihen koodattu oletettu polypeptidi ovat esitetyt kuviossa Kloonin 35 5'-pään nukleotidi on T, kun taas vastaava nukleotidi kloonissa 37b on A. cdna:t kolmesta muusta riippumattomasta kloonista, jotka eristettiin kloonin 37b eristämismenettelyn aikana, jota kuvattiin osassa IV.A.10., on myös sekventoitu. Näistä klooneista olevat cdna:t sisältävät myös A:n tässä asemassa. Täten 5'-pään T kloonissa '35 voi olla kloonausmenettelystä syntynyt tekotuote. On tunnettua, että tekotuotteita 25 syntyy usein cdna-molekyylien 5'-päissä. 30 Klooni 37b sisältää ilmeisesti yhden jatkuvan ORF:n, joka koodaa polypeptidiä, joka on jatko sille polypeptidille, joka on koodattu siihen ORF:ään, joka ulottuu päällekäin menevien kloonien 35, 36, 81 ja 32 läpi. IV.A.12. HCV:n cdna:n ja kloonin cnnkripffikiiekkäisten osien eristäminen Kloonista 32 alavirtaan päin olevan HCV:n cdna:n eristäminen suoritettiin seuraavasti. Ensiksi klooni cla eristettiin käyttäen synteettistä hybridisaatiokoetinta, joka perustui 35 kloonin 32 HCV:n cdna:n nuldeotidisekvenssiin. Menetelmä oli olennaisesti sama kuin kuvattiin osassa IV.A.5., paitsi että synteettisen koettimen sekvenssi oli:

55 53 5' AGT GCA GTG GAT GAA CCG GCT GAT AGC CTT 3'. 5 Käyttäen kloonista cla saatua nukleotidisekvenssiä, syntetisoitiin toinen synteettinen nukleotidi, jonka sekvenssi oli: 5' TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3'. Lambda-gt 1 1-kirjaston seulominen käyttäen ldoonista cla peräisin olevaa sekvenssiä koettimena antoi arviolta 1 positiivisen osuman 50000:sta.Tristetty, puhdistettu klooni, 10 joka hybridisoitui tämän koettimen kanssa, nimettiin klooniksi 33b. IV.A.13 T-1Cv -rk cnna'n rillkleotidigekvedqsi kloonissa 13h cdna:n nukleotidisekvenssi kloonissa 33b määritettiin olennaisesti kuten on kuvattu 15 osassa IV.A.2. Sekvenssi, sen kloonin 32 cdna:n kanssa päällekkäin menevä alue ja siihen koodattu oletettu polypeptidi ovat esitetyt kuviossa 11. Klooni 33b sisältää ilmeisesti yhden jatkuvan ORF:n, joka on pidentymä päällekkäin menevien kloonien 37b, 35, 36, 81 ja 32 ORF:11e. Klooniin 33b koodattu polypeptidi on 20 samassa translaatioalueessa kuin se, mikä on koodattu näiden päällekkäin menevien kloonien pidennettyyn ORF:ään IV.A.14 HCY_:nrDNA:idenjaticamene3ätpäällekkäinJdamnini7bcDNA:n-kanssaja klannin 11b crina n kancsa er-itkminen HCV:n cdna:iden, jotka menevät päällekkäin kloonien 37b ja 33b cdna:iden kanssa, eristämiseksi käytettiin seuraavia synteettisiä oligonukleotidikoettimia, jotka ovat peräisin kloonien cdna:ista, seulomaan lambda-gt11-kirjastoa käyttäen olennaisesti samaa menetelmää kuin kuvattiin osassa IV.A.3. Käytetyt koettimet olivat: 5' CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT C 3' ja 5' TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3' 35 havaitsemaan sellaisia HCV:n cdna-sekvenssejä sisältäviä pesäkkeitä, jotka sekvenssit menevät päällekkäin kloonin 37b ja vastaavati 33b sekvenssien kanssa. Arviolta 1 pesäke 50000:sta havaittiin kullakin koettimella. Klooni, joka sisälsi cdna:ta, joka oli

56 54 ylävirtaan päin klovnin 37b cdna:sta ja meni päällekkäin sen kanssa, nimettiin klooniksi 40b. Klooni, joka sisälsi cdna:ta alavirtaan kloonin 33b cdna:sta ja meni päällekkäin sen kanssa, nimettiin klooniksi 25c. 5 W.A.15 HCV n rfln4 n nnklpntirlicelrvericcit kloopicsa 40b ja IdoonissR?5c Kloonissa 40b ja kloonissa 25c olevat cdna:iden nukleotidisekvenssit määritettiin olennaisesti kuten kuvattiin osassa IV.A.2. 40b:n ja 25c:n sekvenssit, niiden päällekkäin menevät alueet kloonien 37b ja 33b cdna:iden kanssa ja niihin koodatut oletetut 10 polypeptidit on esitetty kuviossa 12 (Ilooni 40b) ja kuviossa 13 (klooni 25c). Kloonin 40b 5'-pään nukleotidi on G. Kuitenkin myös viiden muun riippumattoman. klovnin, jotka eristettiin menettelyn aikana, jossa klooni 40b eristettiin, kuten on kuvattu osassa IV.A.14, cdna:t on myös sekventoitu. Näiden kloonien cdna:t 15 sisältävät myös T:n tässä asemassa. Täten G voi edustaa kloonaustekotuotetta (ks. keskustelua osassa IV.A.11). Kloonin 25c 5'-pää on ACT, mutta tämän alueen sekvenssi kloonissa cla (sekvenssiä ei ole esitetty) ja kloonissa 33b on TCA. Tämä ero voi myös edustaa Idoonaustekotuotetta, kuten voivat 28 ylimääräistä 5'-pään nukleotidia kloonissa Kumpikin klooneista 40b ja 25c ilmeisesti sisältää ORF:n, joka on aikaisemmin sekventoitujen kloonien jatkuvan ORF:n pidentymä. Kloonien 40b, 37b, 35, 36, 81, b ja 25c kautta ulottuvan ORF:n nukleotidisekvenssi ja siihen koodattu oletettu polypeptidi ovat esitetyt kuviossa 14. Kuviossa on todennäköiset tekotuotteet poistettu 25 sekvenssistä ja sen sijaan monien päällekkäin menevien kloonien vastaavat sekvenssit alueilla, jotka eivät ole 5'-päässä, on esitetty. IV.A.16. Yhdistelmä-HCV n CENA'n valmistaminen kloorkipn 16, 81 ja 1? cnna irta 30 Yhdistelmä-HCV:n cdna, C100, rakennettiin seuraavasti. Ensiksi kloonien 36, 81 ja 32 cdna:t pilkottiin EcoRI:lla. Kustakin kloonista tuleva cdna:n EcoRI-fragmentti kloonattiin yksilöllisesti vektorin pgem3-sininen (Promega Biotec) EcoRIkohtaan.Tuloksena olevat yhdistelmävektorit, jotka sisälsivät kloonien 36, 81 ja 32 cdna:t, nimettiin pgem3-sininen/36:ksi, pgem3-sininen/81:ksi ja vastaavasti 35 pgem3-sininen/32:ksi. Sopivasti orientoitunut yhdistelmä pgem3-sininen/81 pilkottiin Nael:llä ja Narl:llä ja suuri (2850 emäsparia) fragmentti puhdistettiin ja liitettiin pieneen (-570 emäsparia) NaeI/NarI-puhdistettuun pgem3-sininen/36-.

57 55 restriktiofragmenttiin. Tätä kloonien 36 ja 81 cdna:iden yhdistelmää käytettiin toisen pgem3-sininen-vektorin luomiseen, joka sisälsi jatkuvan HCV:n ORF:n näiden kloonien kanssa päällekkäin menevässä cdna:ssa. Tämä uusi piasmidi pilkottiin sitten Pvull:lla ja EcoRI:lla noin 680 emäsparin fragmentin vapauttamiseksi, mikä sitten 5 kiinnitettiin pieneen (580 emäsparia) Pvull/EcoRI-fragmenttiin, joka oli eristetty sopivasti orientoituneesta pgem3-sininen/32-plasmidista ja kloonien 36, 81 ja 32 yhdistelmä-cdna kiinnitettiin EcoR1:11a linearisoituun vektoriin ps0dcfl, jota kuvataan osassa IV.B.1, ja jota käytettiin kloonin ekspressoimiseen bakteereissa. Valittiin yhdistelmät, jotka sisälsivät yhdistelmä-hcv:n cdna:n emäsparin 10 EcoRI-fragmentin ja plasmidien cdna pilkottiin EcoRI.11a ja puhdistettiin. IV.A.17 Kloonien 141., 111, 7f, 7e, 8h, 13c, 14c, 8f, 33f, 13g ja 19e eristärninian ja piirien T-NCV n cfna ii1en rinklentirliqelevencqit 15 Kloonien 14i, 1 lb, 7f, 7e, 8h, 33c, 14c, 8f, 33f, 33g ja 39c HCV:n cdna:t eristettiin tekniikalla, jolla eristettiin HCV:n cnda:iden lambda-gt11-kirjaston päällekkäin meneviä cdna-fragmentteja, kuten kuvattiin osassa IV.A.1.. Käytetty tekniikka oli olennaisesti sama, jota kuvattiin osassa IV.A.3., paitsi että käytetyt koettimet olivat peräisin viimeksi eristettyjen kloonien nuldeotidisekvenssien yhdistelmä-hcv- 20 sekvensenssien 5'- ja 3r-päistä. Hybridisointitaajuus klooneille, jotka hybridisoituivat alla kuvattujen koettimien kanssa, oli noin :sta kussakin tapauksessa. Kloonien 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 14c, 8f, 33f, 33g ja 39c HCV:n cdna:iden nukleotidisekvenssit määritettiin olennaisesti samoin kuin on kuvattu osassa IV.A.2., paitsi että näistä faageista pilkotulla cdna:11a korvattiin kloonista eristetty 25 cdna. 30 Klooni 33c eristettiin käyttäen hybridisaatiokoetinta, joka perustui kloonin 40b nuideotidien sekvenssiin. Kloonin 40b nuldeotidisekvenssi on esitetty kuviossa 12. Kloonin 33c eristämisen käytetyn koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT 3' 35 Kloonin 33c HCV:n cdna-sekvenssi ja päällekkäin meno kloonin 40b sekvenssin kanssa on esitetty kuviossa 15, joka esittää myös siihen koodatut aminohapot. Klooni 8h eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin 33c nukleotidisekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli:

58 56 5' AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC GGT GTT C 3' Kloonin 8h HCV:n cdna-sekvenssi ja päällekkäin meno kloonin 33c sekvenssin 5 kanssa ja siihen koodatut aminohapot ovat esitetyt kuviossa 16. Klooni 7e eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin 8h nukleotidien sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 10 5' TCG GAC CTT TAC CTG GTC ACG AGG CAC 3' Kloonin 7e HCV:n cdna-sekvenssi ja päällekkäin meno kloonin 8h kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa Klooni 14c eristettiin koettimella, joka perustui kloonin 25c nukleotidien sekvenssiin. Kloonin 25c sekvenssi on esitetty kuviossa 13. Kloonin 14c eristämiseen käytetyn koettimen sekvenssi oli: 5' ACC Trc CCC ATT AAT GCC TAC ACC ACG GGC 3' 20 Kloonin 14c HCV:n cdna-sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 25c sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa Klooni 8f eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin 14c nukleotidien sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' TCC ATC TCT CAA GGC AAC TTG CAC CGC TAA 3' 30 Kloonin 8f HCV:n cdna-sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 14c sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 19. Klooni 33f eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin 8f nukleotidisekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 35 5' TCC ATG GCT GTC CGC TTC CAC CTC CAA AGT 3' Kloonin 33f HCV:n cdna-sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 8f sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 20.

59 57 Klooni 33g eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 33f. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5 5' GCG ACA ATA CGA CAA CAT CCT CTG AGC CCG 3' Kloonin 33f HCV:n cdna:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 33f sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa Klooni 7f eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 7e. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' AGC AGA CAA GGG GCC TCC TAG GGT GCA TAA T 3' 15 Kloonin 7f HCV:n cdna:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 7e sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa Klooni 1 1 b eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 7f. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' CAC CTA TGT TTA TAA CCA TCT CAC TCC TCT 3' 25 Kloonin 11b HCV:n cdna:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 7f sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 23. Klooni 14i eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 1 1b. Koettimen nuldeotidisekvenssi oli: 30 5' CTC TGT CAC CAT ATT ACA AGC GCT ATA TCA 3' Kloonin 14i HCV:n cdna:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 1lb sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 24. Klooni 39c eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin 35 kloonissa 33g. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' CTC GTT GCT ACG TCA CCA CAA TTT GGT GTA 3'

60 10E6 E2 58 Kloonin 39c HCV:n cdna:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 33g sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa IV.A.18. Vhdistellrä-RCV '71 CDNA-selcven peräkin HCV:n cl-)1 1 A ta ci r,:4 tä vi qtä eri qtetyi ctä kl non ei on HCV:n cdna-sekvenssit ylläkuvatuissa eristetyistä klooneissa ovat kohdakkain yhdistelmä-hcv:n cdna-sekvenssin luomiseksi. Eristeyt ldoonit, jotka ovat kohdakkain suunnassa 5':sta 3':een ovat : 14i, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g ja 39c. 15 Yhdistelmä-HCV:n cdna-sekvenssi, joka on peräisin eristetyistä klooneista ja siihen koodattu aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 26. Yhdistelmäsekvenssien luomisessa on havaittu seuraavia sekvenssiheterogeenisyyksiä. Klooni 33c sisältää 800 emäsparin HCV:n sdna:ta, joka menee päällekkäin kloonien 40b ja 37c cdna:iden kanssa. Kloonissa 33c ja myös viidessä muussa päällekkäin menevässä kloonissa nukleotidi #789 on G. Kuitenkin kloonissa 37b (ks. osa IV.A. 1 1.) 20 vastaava nukleotidi on A. Tämä sekvenssiero luo ilmeisen heterogeenisyyden siihen koodattuihin aminohappoihin, joka olisi joko CYS tai TYR G:lle tai vastaavasti Alle. Tällä heterogeenisyydellä voi olla tärkeitä seuraamuksia proteiinien muodostumisessa. Kloonin 8f HCV:n cdna:n nuldeotidijäännös #2 on T. Kuiten kuten osoitetaan alla. 25 vastaava jäännös kloonissa 7e on A; lisäksi A tässä asemassa löydetään myös kolmesta muusta eristetystä päällekkäin menevästä kloonista. Täten T-jäännös kloonissa 8h voi edustaa kloonaustekotuotetta. Siksi kuviossa 26 merkitään tässä asemassa olevaa jäännöstä A:lla. 30 Kloonin 8f HCV:n cdna:n 3'-pään nukleotidi on G. Kuitenkin vastaava kloonin 33f jäännös ja kahden muun päällekkäin menevän kloonin jäännös on T. Siksi kuviossa 26 tässä asemassa olevaa jäännöstä merkitään T:llä. Kloonin 33f HCV:n cdna:n 3'-pään sekvenssi on TTGC. Kuitenkin vastaava sekvenssi 35 kloonissa 33g ja kahdessa muussa päällekkäin menevässä kloonissa on ATTC. Siksi kuviossa 26 vastaavaa aluetta merkitään ATTC:llä.

61 59 Kloonin 33g HCV:n cdna.n nukleotidijäännös #4 on T. Kuitenkin kloonissa 33f ja kahdessa muussa päällekkäin menevässä kloonissa vastaava jäännös on A. Siksi kuviossa 26 vastaavaa jäännöstä merkitään Alla. 5 Kloonin 14i 3'-pää on AA, kun taas vastaava dinukleotidi kloonissa llb ja kolmessa muussa ldoonissa on TA. Siksi kuviossa 26 päätä merkitään TA:lla. Muiden sekvenssiheterogeenisyyksien analysoinnista keskustellaan yllä. 10 Yhdistemä-HCV:n cdna:n tutkiminen merkitsee, että se sisältää yhden suuren ORF:n. Tämä ehdottaa, että virusgenomi on transloitusuureen polypeptidiin, jota käsitellään samanaikaisesti translaation kanssa tai sen jälkeen. 15 IV.A.19 Kloonipn 1'?f,15f, 19g, 6g.j0 15e eristäminen ja niiden nnkleotifikekvenqqit Kloonien 12f, 35f, 19g, 26g ja 15e HCV:n cdna:t eristettiin olennaisesti osassa IV.A.17 kuvatulla tekniikalla, paitsi että koettimet olivat sellaisia kuin on merkitty alla. Koettimien kanssa hybridisoituvien kloonien frekvenssi oli noin :sta kussakin tapauksessa. Näiden kloonien HCV:n cdna:iden nukleotidisekvenssit määritettiin 20 olennaisesti, kuten on kuvattu osassa IV.A.2., paitsi että merkittyjen kloonien cdna:ila korvattiin kloonista eristetty cdna. Kloonin 12f, joka sisältää cdna:ta ylävirtaan kuvion 26 HCV:n cdna:sta, eristäminen suoritettiin käyttäen hybridisaatiokoetinta, joka perustui kloonin 14i nukleotidien. 25 sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' TGC TTG TGG ATG ATG CTA CTC ATA TCC CAA 3' Kloonin 12f HCV:n cdna:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 14i sekvenssin 30 kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa Kloonin 35f, joka sisältää cdna:ta alavirtaan kuvion 26 HCV:n cdna:sta, eristäminen suoritettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 39c. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' AGC AGC GGC GTC AAA AGT GAA GGC TAA CTT 3'

62 ' Kloonin 35f sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 39c sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 28. Kloonin 19g eristäminen suoritettiin käyttäen hybridisaatiokoetinta, joka perustui 5 kloonin 35f 3'-sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' TTC TCG TAT GAT ACC CGC TGC TIT GAC TCC 3' Kloonin 19g HCV:n cdna:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 35f sekvenssin 10 kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 29. Kloonin 26g eristäminen suoritettiin käyttäen hybridisaatiokoetinta, joka perustui kloonin 19g 3'-sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 15 5' TGT GTG GCG ACG ACT TAG TCG TTA TCT GTG 3' Kloonin 26g HCV:n cdna:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 19g sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa Kloonin 15e eristäminen suoritettiin käyttäen hybridisaatiokoetinta, joka perustui kloonin 26g 3'-sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' CAC ACT CCA GTC AAT TCC TGG CTA GGC AAC 3' 25 Kloonin 15e HCV:n cdna:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 26g sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 31. Tässä osassa kuvatut klooni on talletettu osassa 11.A. kuvatuilla ehdoilla ja niissä olosuhteissa ja niille on annettu seuraavat talletusnumerot. 30 Jambria-51 1 ATre No Tallptucpäivä klooni 12f klooni 35f klooni 15e 35 klooni K Eristettyjen kloonien ylläkuvatut HCV:n cdna-sekvenssit on asetettu kohdakkain

63 61. yhdistelmä-hcv:n cdna-sekvenssin luomiseksi. Eristetyt kloonit, jotka ovat kohdakkain suunnassa 5':sta 3':uun ovat: 12f, 14i, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, , 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g ja 15e. 5 Eristetyistä klooneista peräisin oleva yhdistelmä-hcv:n cdna-sekvenssi ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa IV.A.20 Vaihtoehtoinen menetelmä kloonin. 12f He'Vm cdna-sekvenssistl ylävirtaan olpvien r_tina-qpievenccien erictämicekqi Perustuen useimpiin 5'-HCV:n sekvensseihin kuviossa 32, jotka ovat peräisin kloonin 12f HCV:n cdna:sta, syntetisoitiin käänteistranskriptaasin pieniä synteettisiä oligonukleotidiprimereitä ja niitä käytettiin sitoutumaan vastaaviin sekvensseihin HCV:n genomin RNA:han ylävirtaan olevien sekvenssien käänteistranskription aloittamiseksi. 15 Primerisekvenssit ovat lähinnä kloonin 12f tunnettua 5'-pään sekvenssiä, mutta siitä riittävästi alavirtaan sallialcseen seilaisten koetinsekvenssien suunnittelun, jotka ovat ylävirtaan primerisekvensseistä. Tunnettuja standardimenetelmiä käytetään aloitukseen ja kloonaukseen. Tuloksena olevia cdna-kirjastoja seulotaan aloituspaikoista ylävirtaan olevilla sekvensseillä (vähennettynä selvitetystä kloonin 12f sekvenssistä). 20 HCV:n genomin RNA saadaan joko plasma- tai maksanäytteistä simpansseista, joilla on NANBH tai vastaavista näytteistä ihmisistä, joilla on NANBH. 25 IV.A.21. v2ihtni.htoinpn menetelmä, joka käyttää hännän lisäämictä, sekvenssien prictämkeleqi T-TCV n g-nnmin 5I-pään alueelta Äärimmäisten 5'-pään sekvenssien eristämiseksi HCV:n RNA-genomista ensimmäisen käänteistranskriptiokierroksen d3na-tuotteeseen, joka on dupleksoitu malli-rna:11a, lisätään oligo C-häntä. Tämä suoritetaan inkuboimalla tuotetta terminaalitransferaasin kanssa CPT:n läsnäollessa. cdnik-synteesin toinen kierros, joka tuottaa ensimmäisen 30 cdna-säikeen komplementin, suoritetaan käyttäen oligo-g:tä primerinä 35 käänteistranslcriptaasireaktiota varten. Genomi-HCV-RNA:n lähteet ovat samoja, joita on kuvattu osassa IV.A.20. Menetelmät hännän lisäämiseksi terrninaalitramsferaasilla ja käänteistranskriptansireaktioita varten ovat niitä, jotka on kuvannut Maniatis et al. (1982). cdna_tuotteet kloonataan, seulotaan ja sekventoidaan sitten. IV.A.22 prio migekqi HCV n_gnnmin 3'-pään alueelta

64 10E Tämä menetelmä perustuu aikaisemmin käytettyihin menetelmiin Flaviviruksen RNA:n cdna:n klooaamiseksi. Tässä menetelmässä RNA alistetaan denaturointiolosuhteisiin sekundääristen rakenteiden poistamiseksi 3'-päästä ja sitten siihen lisätään häntä 5 käyttäen Poly-A-polymeraasia käyttäen ratp:tä substraattina. Poly-A-hännällä varustetun RNA:n käänteistranskriptiota katalysoi käänteistranskripr2asi käyttäen oligodt:tä primerinä. cdna:n toiset säikeet syntetosoidaan, cdna-tuotteet kloonataan, seulotaan ja sekventoidaan. 10 IV.A.23 Suurempia ci)n A-inSerttejä sismtävien 13mhria-gt11.qq4 olevien HCV-n rtina-kirjaonjen lunminpn Menetelmä, jota käytetään luomaan ja seulomaan lambda-gt11-kirjastoja, on olennaisesti sama kuin se, jota on kuvattu osassa IV.A.1., paitsi että kirjasto luodaan 15 Sepharose CL-4B-pylväästä eluoidun suuremman koon cdna:iden varastosta. IV.A.24. }levmednaiugastojen luomme - " " gorneereiä primereinä 20 Uusia HCV:n cdna-kirjastoja on valmistettu RNA:sta, joka on peräisin tautia kantavan simpanssin plasmavarastosta, jota kuvattiin osassa IV.A.1., ja poly-k-rna-fraktiosta, joka on peräisin tämän tautia kantavan eläimen maksasta. cdna rakennettiin olennaisesti, kuten ovat kuvanneet Gubler ja Hoffman (1983), paitsi että ensimmäisien.cdna-säikeiden synteesiä varten olevat primerit olivat kaksi synteettistä oligomeeriä, 25 jotka perustuivat yllä kuvattuun HCV:n genomin sekvenssiin.primerit, jotka perustuivat kloonien 1lb ja 7e sekvenssiin livat: 30 5' CTG GCT TGA AGA ATC 3' ja 51 AGT TAG GCT GGT GAT TAT GC 3' Tuloksena olevat cdna:t kloonattiin lambda-bakteriofaagivektoreihin ja niitä seulottiin eri synteettisillä oligomeereillä, joiden sekvenssit perustuivat kuvion 32 HCV:n sekvenssiin. 35 IV B HCV n rdna isqn krinflatmjen polypeptidien ekqpreqqin nintteiden tunnictaminpn T-TCV n inrimnimina anti-eneinä ja elegpresgnituien

65 IV B 1 Klnnniin lennclattin pnlypeptidin ekcprpccin Klooniin koodattu HCV-polypeptidi (ks. osa IV.A.2., yllä) ekspressoitiin fuusiopolypeptidinä superoksididismutaasilla. Tämä tehtiin alikloonaamalla kloonin cdna-insertti ekspressiovektoriin psodcf1 (Steimer et al. (1986)) seuraavasti. Ensiksi ps0dcfl :stä eristettyä DNA:ta käsiteltiin BamHI:lla ja EcoRI:lla ja seuraava linkkeri liitettiin lineaariseen DNA:han, joka luotiin restriktioentsyymeillä: 5' GAT CCT GGA ATT CTG ATA A 10 3' GA CCT TAA GAC TAT M AA 5' Kloonauksen jälkeen eristettiin insertin sisältävä plasmidi. Insertin sisältävä plasmidi restriktoitiin EcoRI:lla. HCV:n cdna-insertti kloonissa pilkottiin EcoRI:llä ja se liitettiin tähän EcoRI:llä linearisoituun plasmidi-dna:han. 20 DNA-seosta käytettiin transformoimaan E.Coli-kantaa D1210 (Sadler et al. (1980)). Kloonin cdna:n kanssa oikeassa orientaatiossa ORF:n ekspressiota varten olevat rekombinantit, jotka on esitetty kuviossa 1, tunnistettiin restriktiokartoituksen ja nukleotidien sekventoimisen avulla. Yhden kloonin rekombinanttibakteerit saatetiin ekspressoimaaan SOD-NANB polypeptidiä kasvattamalla bakteeria IPTG:n läsnäollessa. 25 IV B 2 Klnnniin R1 knnriatnn pnlypeptidin ekqprpqsio Kloonin 81 sisältämä HCV:n cdna ekspressoitiin SOD-NANB81-fuusiopolypeptidinä. Tätä fuusiopolypeptidiä koodaavan vektorin valmistusmenetelmä oli analoginen sen kanssa, mitä käytettiin SOD-NANB5.1.1 koodaavan vektorin luomiseen, paitsi että HCV:n cdna:n lähde oli klooni 81, joka eristettiin osassa IV.A.3. kuvatulla tavalla ja 30 jota varten cdna_sekvenssi määritettiin kuten kuvattiin osassa IV.A.4.. Kloonissa 81 oleva HCV:n cdna-nukleotidisekvenssi ja siihen koodatun polypeptidin oletettu aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 4. HCV:n cdna-insertti kloonissa 81 pilkottiin EcoRI:lla ja liitettiin ps0dcfl :een, joka 35 sisälsi linkkerin (ks. IV.B.1.) ja joka linearisoitiin EcoRI:lla. DNA-seosta käytettiin sitten transformoimaan E.Coli-kantaa D1210. Rekombinantit kloonin 81 HCV:n cdna:n kanssa oikeassa orientaatiossa kuviossa 4 esitetyn ORF:n ekspressiota varten,

66 64 tunnistettiin restriktiokartoituksen ja nuldeotidin sekventoimisen avulla. 5 Yhdestä kloonista tulleet rekombinanttibakteeria saatettiin ekspressoimaan SOD- NANB8,:tfi kasvattamalla bakteereita IPTG:n läsnäollessa. IV B 3 Klnnniin koodatim polypprtidin tunnistaminen HCV nä ja NANRH hnrt liittyvän 0 antiepenin Kloonin HCV:n cdna:han koodattu polypeptidi tunnistettiin NANBH:hon 10 liittyväksi antigeeniksi toteamalla kokeellisesti, että NANBH-infektoituneiden simpanssien ja ihmisten seerumi reagoi immunologisesti fuusiopolypeptidin SOD-NANB54.1, kanssa, joka muodostuu superoksididismutaasista sen N-päässä ja antigeenistä sen C-päässä. Tämä suoritettiin Western-blottauksen avulla (Towbin et al. (1979)) seuraavasti. 15 Rekombinantti bakteerikanta, joka oli transformoitu ekspressiovektorilla, joka koodasi osassa IV.B.1. kuvattua SOD-NAN polypeptidiä saatettiin ekspressoimaan fuusiopolypeptidiä kasvattamalla IPTG:n läsnäollessa. Koko bakteeriliuos saatettiin elektroforeesiin polyakryyliamidigeelien läpi SDS:n läsnäollessa Laemmlin (1970) 20 mukaan. Erotetut polypeptidit siirrettiin nitroselluloosafilttereille (Towbin et al (1979)). Filtterit leikattiin sitten ohuiksi kaistaleiksi ja kaistaleita inkuboitiin yksilöllisesti eri simpanssin ja ihmisen seerumin kanssa. Sidotut vasta-aineet osoitettiin lisäinkubaatiolla 1 25 I-leimatun lampaan anti-ihmis-ig:n kanssa, kuten kuvattiin osassa IV.A Western-blottausta varten käytetyn simpanssin seerumin karakterisointi ja tulokset, jotka ovat esitetyt autoradiografoitujen kaistaleiden valokuvassa, on esitetty kuviossa 33. Nitroselluloosakaistaleita, jotka sisälsivät polypeptidejä, inkuboitiin simpanssien seerumin kanssa eri aikoina akuutin NANBH:n (Hutchinson-kanta) aikana (kaistat 1-16), hepatitis-a-infektioiden aikana (kaistat ja 26-33) ja hepatitis-b-infektion 30 aikana (kaistat 34-44). Kaistat 25 ja 45 esittävät positiivisiä kontrolleja, joissa immunoblotteja inkuboitiin seerumin kanssa potilaasta, jota käytettiin rekombinanttikloonin tunnistamiseen alkuperäisessä lambda-gt11:ssa olevan cdna-kirjaston seulomisessa (ks. osa IV.A.1.). 35 Kontrollikaistoilla 25 ja 45, kuviossa 23 näkyvä nauha heijastaa vasta-aineiden sitoutumista SOD-fuusiopolypeptidin NANB5.1.1-puoliskoon. Nämä vasta-aineet eivät sitoudu yksin SOD:hen, koska tämä on sisällytetty negatiivisena kontrollina näihin

67 65 näytteisiin, ja se olisi ilmaantunut nauhana, joka liikkuu huomattavasti nopeammin kuin SOD-NANB5.1.1-filusiopolypeptidi. Kaistat 1-16 kuviossa 33 esittävät vasta-aineiden sitoutumista neljän simpanssin 5 seeruminäytteisiin; seerumit saatiin juuri ennen NANBH-infektiota ja jaksoittain akuutin infektion aikana. Kuten kuviosta nähdään, koska vasta-aineet, jotka reagoivat immunologisesti SOD-NANB5.1.1-polypeptidin kanssa, eivät olleet läsnä seeruminäytteissä, jotka saatiin ennen infektoivan HCV-istutteen antamista ja infektion aikaisen akuutin vaiheen aikana, kaikki neljä eläintä lopulta synnyttivät kiertäviä vasta- 10 aineita tälle polypeptidille akuuttia vaihetta seuranneen myöhäisemmän vaiheen aikana. Lisänauhat, joita huomattiin irnmunobloteissa simpanssien numerot 3 ja 4 tapauksissa, johtuivat taustasitoutumisesta isäntäbakteeriproteiineihin. Vastakohtana tuloksille, jotka saatiin NANBH-infektion omaavien simpanssien 15 seerumista, vasta-aineiden kehittymistä fuusiopolypeptidin NANB5.1.1-puoliskolle ei huomattu neljässä simpanssissa, jotka oli infektoitu HAV:llä tai kolmessa simpanssissa, jotka oli infektoitu HBV:llä. Ainoa sitoutuminen näissä tapauksissa oli taustasitoutuminen isäntäbakteeriproteiineihin, mitä tapahtui myös HCV-infektoiduissa 20 näytteissä. Ihmisseerumin, jota käytettiin Western-blottausta varten karakterisointi ja tulokset, jotka nähdään autoradiografoitujen kaistaleiden valokuvassa, ovat esitetyt kuviossa 34. Nitroselluloosakaistaleita, jotka sisälsivät polypeptideitä, inkuboitiin seerumin kanssa, joka oli peräisin ihmisistä eri aikoina NANBH-infektion aikana (kaistat 1-21), HAV- 25 infektion aikana (kaistat 33-40) ja HBV-infektion aikana (kaistat 41-49). Kaistat 25 ja 50 esittävät positiivisia kontrolleja, joissa immunoblotteja inkuboitiin sen potilaan 30 seerumin kanssa, jota käytettiin lambda-gt11-kirjaston alkuperäisessä seulonnassa, jota on kuvattu yllä. Kaistat ja esittävät infektoitumattomia kontrolleja, joissa seerumi oli peräisin normaaleista verenluovuttajista. Kuten nähdään kuviosta 34, yhdeksän NANBH-potilaan seerumit, mukaanlukien seerumi, jota käytettiin lambda-gtll-kirjaston seulomiseen, sisälsivät vasta-aineita fuusiopolypeptidin NANB5.1.1-puoliskolle. Kolmen NANBH-potilaan seerumi ei sisältänyt näitä vasta-aineita. On mahdollista, että tulevaisuudessa näihin potilaisiin 35 kehittyy anti-nanb5.1.1-vasta-aineita. On myös mahdollista, että tämä reaktion puuttuminen johtui erilaisesta NANBV-aineesta, joka aiheuttaa taudin yksilöissä, joista otettiin se seerumi, joak ei aiheuttanut vastetta.

68 Kuvio 34 esittää myös, että seerumit monista HAV- ja HBV-infektoiduista potilaista eivät sisältäneet anti-nanb5_1.1-vasta-aineita ja että nämä vasta-aineet eivät olleet myöskään läsnä normaalien kontrollien seerumissa. Vaikka yksi HAV-potilas näyttääkin 5 sisältävän anti-nanb5.1.1-vasta-aineita, on mahdollista, että tällä potilaalla oli ollut aikaisemmin HCV-infektio, koska NANBH:n mahdollisuus on hyvin korkea ja koska se on usein oireeton. Nämä serologiset tutkimukset merkitsevät, että kloonin cdna koodaa 10 epitooppeja, jotka tunnistetaan erityisesti sellaisten potilaiden ja eläimien seerumista, joilla on BB-NANBV-infektio. Lisäksi cdna ei näytä olevan peräisin kädellisten genomista.kloonista tai kloonista 81 tehty hybridisaatiokoetin ei hybridisoitunut kontrolli-ihmisten tai -simpanssien infektoitumattomien yksilöiden genomi-dna:n "Southern"-blotteihin olosuhteissa, joissa ainutkertaisia, yksittäiskopiogeenejä 15 havaitaan. Nämä koettimet eivät myöskään hybridisoituneet kontrollina käytettyyn härän genomi-dna:n Southern blotteihin. 20 IV B 4 Klooniert36.3,Lja_32.2CV4n_CDNA.:iden_yhdistelmään_kockdaattuje.n...polypep. tidien_ekspressio HCV-polypeptidi, joka oli koodattu ORF:ään, joka ulottui kloonien 36, 81 ja 32 kautta, ekspressoitiin fuusiopolypeptidinä SOD:n kanssa. Tämä suoritettiin liittämällä yhdistelmä-cdna, C100, ekspressiokasettiin, joka sisälsi ihmisen superoksididismutaasigeenin, liittämällä ekspressiokasetti hiivan ekspressiovektoriin ja 25 ekspressoimalla polypeptidi hiivassa. Ekspressiokasetti, joka sisälsi C100-yhdistelmä-cDNA:ta, joka oli peräisin klooneista 36, 81 ja 32, rakennettiin liittämällä 1270 emäsparin EcoRI-fragmenttivektorin ps3-56 (myös kutsuttu ps356:ksi) EcoRI-paikkaan, mistä on tuloksena ps3-56c100-plasmidi. 30 C100:n rakennetta on kuvattu osassa IV.A.16 yllä. Vektori ps3-56, joka on pbr322:n johdannainen, sisältää ekspressiokasetin, joka muodostuu ihmisen superoksididismut»sigeenistä ylävirtaan olevan ADH2/GAPDHhybridihiivapromoottorin ja alavirtaan olevan GAPDH-transkriptioterminaattorin. Samanlaista kasettia, joka sisältää nämä kontrollielementit ja 35 superoksididismutaasigeenin, on kuvannut Cousens et al. (1987) ja sitä kuvataan myös EP-julkaisussa 196,056, joka on julkaistu ja joka on tämän keksinnön hakijan nimissä. Kasetti vektorissa ps3-56 eroaa kuitenkin Cousens et al. (1987) kasetista siinä,

69 67 että heterologinen proinsuliinigeeni ja immunoglobuliinisarana on poistettu ja että superoksididismutaasin glni54:a seuraa sovitussekvenssi, mikä sisältää EcoRI-paikan. Sovittimen sekvenssi on: 5 5'-AAT TTG GGA ATT CCA TAA TGA G -3' AC CCT TAA GGT ATT ACT CAG CT. EcoRI-paikka sallii hetrologisen sekvenssin liittämisen, joka sekvenssi, kun se ekspressoidaan kasetin sisältävästä vektorista, antaa polypeptidejä, jotka ovat fuusioituja 10 superoksididismutaasiin oligopeptidilinkkerin kautta, joka sisältää aminohapposekvenssin: -asn-leu-gly-ile-arg-. 15 ps356-näyte on talletettu Budapest Treaty'n ehtojen mukaisesti American Type Culture Collection'iin (ATCC), Parklawn Dr., Rockville, Maryland ja sille on annettu talletusnumero Ehdot ja olosuhteet talletuksen saatavuutta ja siihen käsiksipääsyä ja talletuksen ylläpitoa varten ovat samat kuin osassa II.A. määritellyt NANBV-cDNA:oita varten määritellyt ehdot ja olosuhteet. Tämä talletus on 20 tarkoitettu vain mukavuudeksi, eikä sitä vaadita tätä keksintöä käytäntöön sovellettaessa tässä esitetyn selityksen valossa. Talletettu materiaali liitetään tässä mukaan viitteeksi. Sen jälkeen, kun rekombinantit, jotka sisältävät C100 cdna-insertin oikeassa orientaatiossa, oli eristetty, elcspressiokasetti, joka sisälsi C100 cdna:n pilkottiin ps cl00:sta BamHI:lla ja emäsparin fragmentti, joka sisälsi kasetin eristettiin ja puhdistettiin. Tämä fragmentti liitettiin sitten hiivavektorin pab24:n BamHI-paikkaan. Plasmidi pab24, jonka merkittävät piirteet on esitetty kuviossa 35, on hiivan sukkulavektori, joka sisältää täydellisen 2 µm:n sekvenssin replikaatiota varten (Broach 30 (1981)) ja pbr322-sekvenssit. -Se sisältää myös hiivan URA3-geenin, joka on peräisin plasmidista YEp24 (Botstein et al. (1979)) ja hiivan LEU2'-geenin, joka on peräisin plasmidista pc1/1. Plasmidi pab24 rakennettiin pilkkomalla YEp24 EcoRI:lla ja religoimalla vektori poistamaan osittaiset 2 p.m:n sekvenssit. Tuloksena oleva plasmidi, YEP24deltaRI, linearisoitiin pilkkomalla Clal:Ila ja liitettiin 35 täydelliseen 2 gm:n plasmidiin, joka oli linearisoitu ClaHla. Tuloksena oleva plasmidi pcbou pilkottiin sitten Xbal:lla ja 8605 emäsparin vektorifragmentti geelieristettiin. Tämä eristetty Xbal-fragmentti liitettiin 4460 emäsparin Xbal-fragmenttiin, joka sisälsi

70 68 ' LEU2d-geenin, joka oli eristetty pc1/1:stä; LEU2d-geenin orientaatio on samassa suunnassa kuin URA3-geenin. Ekspression liittäminen oli ainutkertaisessa pbr322- sekvenssin BamBI-paikassa, mikä täten katkaisi geenin bakteeriresistenssiä varten tetrasykliinille. Yhdistelmäplasmidi, joka sisälsi SOS-C100-ekspressiolcasetin, pab24c100-3, transformoitiinhiivakantaan JSC 308 ja myös muihin hiivakantoihin. Solut transformoitiin, kuten on kuvannut Hinnen et al. (1978) ja ne siirrettiin ura-selektiivisille levyille. Yksittäisiä pesäkkeitä istutettiin leu-selektiiviseen väliaineeseen ja niitä 10 kasvatettiin kyllästymiseen asti. Viljelmä saatettiin ekspressoimaan SOD-C100- polypeptidiä (jota kutsutaan C100-3:ksi) kasvattamalla YEP:ssä, joka sisälsi 1 % glukoosia. Kanta JSC 308 on genotyyppiä leu2, ura3(del) DM15 (GAP/ADR1), joka on 15 liitetty ADR1-paikkaan.JSC 308:ssa positiivisen aktivaattorigeenituotteen, ADR1, yliekspressio aikaansaa ylimääräisen tukahduttamisen eston (ADR1-villityypin säädön suhteen) ja kspressoitujen heterologisten proteiinien merkittävästi paremman saaman, kun sellaisia proteiineja syntetisoidaan ADH2 UAS-säätöjärjestelmän kautta. Hiivakannan JSC 308 rakenne on selvitetty yhdessä tämän hakemuksen kanssa jätetyssä 20 US-patenttihakemuksessa, jonka asiamiehen viitenumero on ja johon tässä viitataan. Näyte JSC 308:sta on talletettu ATCC:hen Budapest Treaty'n ehtojen mukaisesti ja sille on annettu talletusnumero Ehdot ja olosuhteet talletuksen saatavuudeksi ja siihen käsiksi pääsemiseksi ja talletuksen ylläpitämiseksi ovat samat kuin ne, jotka on määritetty osassa II.A. kannoille, jotka sisältävät HCV:n 25 cdna:ita. Täydellisen C100-3-fuusiopolypeptidin, joka on koodattu pab24c100-3:ssa, tulisi sisältää ihmisen SOD:n 154 aminohappoa aminopäässä, joista viisi aminohappoa on peräisin synteettisestä sovittimesta, joka sisältää EcoRJ-paikan, aminohappotähdettä, jotka ovat peräisin C100:n cdna:sta ja viisi karboksipään aminohappoa, jotka ovat peräisin MS2-nukleotidisekvenssistä, joka liittyy HCV:n cdna-sekvenssiin kloonissa 32. (Ks. osa IV.A.7.). Tämän polypeptidin karboksipään oletettu aminohapposekvenssi, alkaen SOD:n viimeistä edellisestä Ala-tähteestä, on esitetty kuviossa 36; esitettynä on myös nuldeotidisekvenssi, joka koodaa polypeptidin 35 tätä osaa.

71 69 IV B 5 r lnö nan lenndahm pnlypt-ptidin tnnnictaminpn NANRT-T hnn Iiitty antigeepinn nä C100-3-fuusiopolypeptidi, joka on ekspressoitu plasmidista pab24c hiivakannassa JSC 308 karakterisoitiin koon suhteen ja C100:aan koodattu polypeptidi tunnistettiin NANBH:hon liittyvänä antigeeninä sen immunologisen reaktiivisuuden mukaan kroonista NANBH:a sairastavan ihmisen serumin kanssa. C100-3-polypeptidi, joka oli ekspressoitu, kuten kuvattiin osassa IV.B.4, analysoitiin 10 seuraavasti. Hiivan JSC 308 solut transformoitiin pab24:llä tai pab24c100-3:11a ja ne saatettiin ekspressoimaan heterologista plasmidikoodattua polypeptidiä. Tuottamaan saatetut hiivasolut 1 ml:ssa elatusainetta (OD650 20) pelletoitiin linkoamalla kierroksella minuutissa yhden minuutin ajan ja ne liuotettiin pyörteistämällä niitä voimakkaasti (10 x 1 min) rc iaēn tilavuusosan kanssa liuosta ja yhden tilavuusosan 15 kanssa lasihelmiä (0,2 nm halkaisijaltaan). Liuos sisälsi 50 mm Tris-HC1:a, ph 8,0, 1 nm EDTA, 1 mm fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) ja 1 µg/ml pepstatiinia.liukenematon materiaali liuoksesta, sisältäen C100-3-polypeptidin, kerättiin linkoamalla (10000 kierrimin 5 minuuttia) ja se liuotettiin keittämällä 5 minuutin ajan Laerrunli SDS-näytepuslcuiissa. (ks. Laemmli (1970)). Sellainen polypeptidimäärä, 20 joka vastasi 0,3 ml:aa hiivaviljelmää, saatettiin elektroforeesiin 10 %:sten polyakryyliamidigeelien läpi SDS:n läsnäollessa Laenunlin (1970) mukaisesti. Proteiinistandardeja elktroforoitiin samalla geeleillä. Geelit jotka sisälsivät ekspressoituja polypeptidejä joko värjättiin Coomassie-loistavan sinisellä tai ne Western-blotattiin, kuten on esitetty osassa IV.B.2., käyttäen kroonista NANBH:a potevan potilaan 25 seerumia pab24:stä tai pa1324c100-3:sta ekspressoitujen polypeptidien immunologisen reaktiivisuuden määrittämiseksi. Tulokset esitetään kuviossa 37. Kuviossa 37A polypeptidit värjättiin Coomassieloistavan sinisellä. pab24:llä transformoidusta JSC 308:sta ja kahdesta eri JSC- 30 pesäkkeestä, joka JSC oli transformoitu pab24c100-3:11a peräisin olevat liukenemattomat polypeptidit on esitetty kaistalla 1 (pab24), ja vastaavasti kaistoilla 2 ja 3. Kaistojen 2 ja 3 vertailu kaistan 1 kanssa osoittaa sen polypeptidin aiheutettua ekspressiota, joka vastaa PAB24C100-3:11a transformoidun JSC 308:n daltonin molekyylipainoa, mutta jota ekspressiota ei synny pab24:llä transformoidulla JSC :11a. Tätä polypeptidiä on merkitty nuolella. Kuvio 37B esittää pab24:llä (kaista 1) tai pab24c100-3:11a (kaista 2)

72 70 transformoidussa JSC 308:ssa ekspressoitujen liukenemattomien polypeptidien Western-blotteja. pab24:stä exspressoidut polypeptidit eivät olleet immunologisesti reaktiivisia NANBH:a sairastavan ihmisen seerumin kanssa. Kuitenkin, kuten on merkitty nuolella, pab24c100-3:11a transformoitu JSC 308 ekspressoi 5 molekyylipainoltaan daltonin polypeptidiä, joka reagoi immonologisesti ihmisen NANBH-seerumin kanssa. Muut immunologisesti reaktiiviset polypeptidit kaistalla 2 saattavat olla tämän daltonin polypeptidin hajaantumistuotteita tai kasaantumistuotteita. 10 IV B 6 riuminpnlyppptidin C 1 nn..1 riihriktus Fuusiopolypeptidi C100-3, joka muodostuu SOD:sta N-päässä ja in-frame C100:n HCV-popypeptidistä C-päässä, puhdistettiin uutettujen isäntähiivasolujen, joissa polypetidi oli ekspressoitu, liukenemattoman fraktion differentiaaliuuttamisen avulla. 15 Fuusiopolypeptidi C100-3 oli ekspressoitu hiivakannassa JSC 308, joka oli transformoitu pab24c100-3:11a, kuten on kuvattu osassa IV.B.4.. Hiivasolut liuotettiin sitten homogenoimalla, liuoksen liukenematonta materiaalia uutettiin ph:ssa 12 ja C100 jäljelle jäävässä liukenemattomassa fraktiossa tehtiin liukenevaksi SDS:ää sisältävässä 20 puskurissa. Hiivaliuos valmistettiin olennaisesti Nagahuma et al. (1984) mukaan. Hiivasolususpensio valmistettiin, jossa oli 33 % soluja (v/v) suspendoituna liuokseen (Puskuri A), joka sisälsi 20 mm Tris-HC1:a, ph 8,0, 1 mm ditiotreitolia ja 1 mm 25 fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF). Suspensionäyte (15 ml) sekoiteniin samanlaiseen tilavuuteen lasehelmiä (0,45-0,50 mm halkaisijaltaan) ja seosta pyörteistettiin huippunopeudella Super Mixer-laitteessa (Lab line Instruments, Inc.) 8 minuutin ajan. Homogenaatti ja lasihelmet erotettiin toisistaan ja lasihelmiä pestiin kolme kertaa samalla tilavuudella puskuri A:ta, kuin alkuperäisiä solujakin. 30 Pesunesteiden ja homogenaatin yhdistämisen jälkeen liuoksen liukenematon materiaali saatiin linkoamalla homogenaattia 7000 x g:n voimalla 15 minuutin ajan 4 C lämpötilassa, suspendoimalla pelletit uudelleen puskuriin A, jonka tilavuus oli kaksi kertaa se, mitä käytettiin alkuperäisiä soluja varten ja materiaali pelletoitiin uudelleen linkomalla 15 minuuttia 7000 x g:n voimalla. Tämä pesutapahtuma toistettiin kolme kertaa. 35 Liuoksen liekenematonta materiaalia uutettiin ph:ssa 12 seuraavasti. Pelletit suspendoitiin puskuriinjoka sisälsi 0,5 M NaCl, 1 mm EDTA, jossa

73 71 suspendointitilavuus oli sama kuin 1,8 kertaa se tilavuus, jota käytettiin alkuperäisiä soluja varten. Suspension ph säädettiin lisäämällä 0,2 tilavuusosaa Nafosfaattipuskurin, ph 12,0. Sekoituksen jälkeen suspensio lingottiin 7000 x g:ssä 15 minuutin ajan 4 C lämpötilassa ja neste poistettiin. Uuttaminen toistettiin kaksi kertaa. 5 Uutetut pelletit pestiin suspendoimalla ne 0,5 M NaC1, 1 mm EDTA ja käyttäen kaksinkertaista tilavuutta alkuperäisiä soluja varten käytettyyn verrattuna, mitä seurasi linkous 7000 x g:ssä 15 minuutin ajan 4 C:ssa. Uutetuissa pelleteissä oleva C100-3-polypeptidi tehtiin liukenevaksi käsittelemällä SDS:11ä. Pelletit suspendoitiin puskuriin A, jonka tilavuus oli 0,9 kertaa alkuperäisiä 10 soluja varten käytetty tilavuus ja 0,1 tilavuusosaa 2 % SDS:ää lisättiin. Kun suspensiota oli sekoitettu, se lingottiin 7000 x g:ssä 15 minuutin ajan 4 C:ssa.Tuloksena olevia pellettejä uutettiin vielä kolme kertaa SDS:llä. Tuloksena olleet nesteet, jotka sisälsivät C100-3 :n, yhdistettiin. 15 Tämä menettely puhdistaa C100-3:n enemmän kuin 10-kertaiseksi hiivahomogenaatin liukenemattomasta fralctiosta ja polypeptidiä saadaan talteen enemmän kuin 50 %. Fuusiopolypeptidin puhdistettu valmiste analysoitiin polyakryyliamidigeelillä elektroforeesilla Laemmiin (1970) mukaan. Tähän analyysiin perustuen polypeptidi oli 20 enemmän kuin 80 % puhdasta ja sen ilmeinen molekyylipaino oli daltonia. IV.0. IINA:m, joica hybridisaituil HOL:z cdna:n_kanssa, tunnistaminen infpktoitunpiscn yksilöiqsä 25 IV C 1 RNA-n, joka hybricliqpitnn HCV:2 enna-n kanssa, tnnnistaminpn cimpanssin, jolla on NANAT-1,, malcqacqa NANBH:ta sairastavan simpanssin maksasta peräisin olevan RNA:n esitettiin sisältävän sellaisia RNA-lajeja, jotka hybridisoituivat HCV:n cdna:n kanssa, joka sisältyi kloo- 30 niin 81 Northern-blottauksen avulla seuraavasti. RNA eristettiin simpanssin malcsabiopsiasta, josta oli peräisin korkean tiitterin plasma (ks. osa IV.A.1.) käyttäen tekniikkaa, jonka on kuvannut Maniatis et al. (1982) kokonais-rna:n eristämiseksi imettäväissoluista ja sen erottamiseksi poly-a+- ja poly-a- 35 raktioihin. Näille RNA-fraktioille suoritettiin elektroforeesi formaldehydi/agaroosigeelillä (1 % w/v), ja ne siirrettiin nitroselluloosalle. (Maniatis et al. (1982)). Nitroselluloosafiltterit hybridisoitiin radioleimatun kloonin 81 HCV:n cdna:n kanssa

74 72 (ks. kuvio 4 insertin nuldeotidisekvenssiä). Radioleimatun koettimen valmistamiseksi kloonista 81 eristetty HCV:n cdna-insertti radioleimattiin "P:llä nicktranslaation avulla käyttäen DNA-polymeraasi I:tä (Maniatis et al. (1982)). Hybridisaatiota suoritettiin 18 tuntia 42 C lämpötilassa liuoksessa, joka sisälsi 10 % (w/v) 5 dekstraanisulfaattia, 50 %(w/v) deionisoitua formamidia, 750 mm NaC1, 75 mm Nasitraattia, 20 mm Na2HPO4, ph 6,5, 0,1 % SDS, 0,02 %(w/v) härän seerumialbumiinia (BSA), 0,02 % (w/v) Ficoll-400, 0,02 % (w/v) polyvinyylipyrrolidonia, 100 µg/m1 lohen sperma-dna:ta, joka oli rikottu ääniaaltojen avulla ja denaturoitu ja 106 cprn/ml nicktransloitua cdna-koetinta.. /0 Autoradiografi koetetusta filtteristä esitetään kuviossa 38. Kaista 1 sisältää 32P-leimattua restriktiofragmenttimarkkeria. Kaistat 2-4 sisältävät simpanssin maksan RNA:ta seuraavasti: kaista 2 sisältää 30 j.tg kokonais-rna:ta; kaista 3 sisältää 30 µg poly-a- RNA:ta; ja kaista 4 sisältää 20 gg poly-a+-rna:ta. Kuten on esitetty kuviossa 38 NANBH:ta sairastavan simpanssin maksa sisältää toistensa suhteen sukulaisia olevien 15 poly-a+-rna-molekyylien heterogeenisen populaation, mikä hybridisoituu HCV:n cdna-koettimeen ja mikä näyttää olevan kooltaan noin 5000 nuldeotidia - noin nukleotidia. Tämä RNA, mikä hybridisoituu HCV:n cdna:han, voisi edustaa virusgenomeita ja/tai virusgenomin erityisiä transkriptioita. 20 Osassa IV.C.2. alla kuvattu koe on yhtäpitävä sen ehdotuksen kanssa, että HCV sisältää RNA-genomin. IV.C.2. NCV st'ä' peräisin olevan RNA ri tunnistnminerlsairaiden yksilöiden qeernmica 25 Nukleiinihapot uutettiin partikkelista, jotka oli eristetty korkean tiitterin simpanssin NANBH-plasmasta, kuten kuvattiin osassa IV.A.1.. Eristettyjen nukleiinihappojen näytteitä (vastaten 1 ml:aa alkuperäistä plasmaa) suspendoitiin uudestaan 20 µ1:aan Hepes:ä, ph 7,5, 1 mm EDTA:aan, ja 16 µg/m1 hiivan liukoista RNA:ta. Näytteet denaturoitiin keittämällä 5 minuuttia, mitä seurasi välittömästi pakastus ja niitä käsiteltiin 30 ribonuldeaasi A:lla (5 µ1, joka sisälsi 0,1 mg/ml ribonuldeaasi A:ta 25 mm:ssa EDTA:ssa, 40 mm Hepes, ph 7,5) tai deoksinuldeaasi I:llä ( , joka sisälsi 1 yksikön. deoksinukleaasi I:tä 10 mm MgC12, 25 mm Hepes, ph 7,5); vertailunäytteitä inkuboitiin ilman entsyymiä. Inkubaation jälkeen lisättiin 230 µi jääkylmää 2XSSC:tä, joka sisälsi 2 hiivan liukoista RNA:ta ja näytteetsuodatettiin nitroselluloosafilttereillä. Filtterit 35 hybridisoitiin cdna-koettimella, joka oli peräisin kloonista 81 ja joka oli nicktranslaation avulla 32P-leimattu. Kuvio 39 esittää filtterin autoradiografin. Hybridisaatiosignaaleita havaittiin deoksinuldeaasikäsitellyissä ja vertailunäytteissä (kaistat 2 ja

75 vastaavasti 1), mutta niitä ei havaittu ribonuldeaasikäsitellyssä näytteessä (kaista 3). Täten koska ribonukleaasi-a-käsittely tuhosi nukleiinihapot, jotka oli eristetty partikkeleista ja deoksinukleaasi-i-icäsittelyllä ei ollut vaikutusta, todisteet ehdottavat vakavasti, että HCV:n genomi koostuu RNA:sta. IV C 3.AmplifinitnjPn T-TCV-D mukleiinihapposicvenssien, jotka ovat peräisin 1-1CV irt puklpiinihappne.ekvfm CCP istk NANBIT ta sairastavan simpanssin maksa- ja pla STrIanäyttei ctä, nqniftaminpn 10 NANBH:ta sairastavien simpanssien ja vertailusimpanssien maksa- ja plasmanäytteissä läsnäolevia HCV:n nuldeiinihappoja amplifioitiin käyttäen olennaisesti polymeraasiketjureaktio-(pcr)-tekniikkaa, jonka on kuvannut Saiki et al. (1986). Primerioligonukleotidit olivat peräisin kloonin 81 tai kloonien 36 ja 37 HCV:n cdnasekvensseistä. Amplifioidut sekvenssit osoitettiin geelielektroforeesin ja Southern- 15 blottauksen avulla käyttäen koettimina sopivaa cdna-oligomeeriä, jonka sekvenssi oli kahden primerin väliseltä alueelta, mutta ei sisältynyt niihin. Amplifikaatiojärjestelmän avulla tutkittavat RNA-näytteet, jotka sisälsivät HCVsekvenssejä, eristettiin kolmen NANBH:ta sairastavan simpanssin ja kahden 20 vertailusimpanssin maksabiopsioista. RNA-fraktion eristäminen tehtiin gaunidiinitiosyanaattimenettelyllä, jota kuvattiin osassa IV.C.1.. Amplifikaatiojärjestelmällä tutkittavat RNA-näytteet eristettiin myös kahden NANBH:ta sairastavan simpanssin ja yhden vertailusimpanssin plasmasta ja myös 25 vertailusimpanssien plasmojen varastosta. Yhden sairaan simpanssin CID/ml oli 106 tai enemmän ja toisen sairaan simpanssin arvo oli 105 tai enemmän. Nuldeiinihapot uutettiin plasmasta seuraavasti. Joko 0,1 ml tai 0,01 ml plasmaa laimennettiin lopulliseen 1,0 ml:n tilavuuteen TENB/proteinaasi K/SDS-liuoksella 30 (0,05 M Tris-HCI, ph 8,0, 0,001 M EDTA, 0,1 M NaCl, 1 mg/ml proteinaasi K:ta ja 0,5 % SDS) sisältäen 10 µg/ml polyadenyylihappoa ja sitä inkuboitiin 60 minuuttia 37 C:ssa. Tämän proteinaasi-k-pilkkomisen jälkeen tuloksena olevat plasmafraktiot deproteinisoitiin uuttamalla TE:Nä (10,0 mm Tris-HC1, ph 8,0, 1 mm EDTA) kyllästetyllä fenolilla. Fenolifaasi erotettiin linkoamalla ja sitä uutettiin uudelleen 35 TENB:llä, joka sisälsi 0,1 % SDS:ää. Kustakin uutoksesta tuloksena olevat vesifaasit yhdistettiin ja niitä uutettiin kahdesti samalla tilavuudella 99:1-seoksella kloroformi/isoamyylialkoholia. Linkoamalla tapahtuneen faasin erottamisen jälkeen

76 74 vesifaasi saatettiin lopulliseen 0,2 M Na-asetaattipitoisuuteen ja nukleiinihapot saostettiin lisäämällä kaksi tilavuutta etanolia. Saostetut nuldeiinihapot palautettiin ultralinkouksen avulla SW 41-roottorissa kierrimin 60 minuutin ajan 4 C:ssa. 5 Edellisen lisäksi korkean tiitterin simpanssin plasmaa ja varastoitua vertailuplasmaa uutettiin vuoronperään 50 gg:lla poly-a-kantajaa menettelyllä, jota ovat kuvanneet Chomcyzski ja Sacchi (1987). Tämä menettely käyttää hapanta guanidiinitiosyanattiuutosta. RNA palautettiin linkoamalla kierr./min 10 minuutin ajan 4 C:ssa Eppendorf microfuge-laitteessa. Kahdessa tapauksessa, ennen cdna:n synteesiä PCR-reaktiossa, nukleiinihapot, jotka oli uutettu plasmasta proteinaasi K/SDS/fenoli-menetelmällä, puhdistetiin edelleen sitomalla ne S- ha S Elutip-R-kolonneihin ja eluoimalla ne sieltä. Seurattu menettely oli 15 valmistajan ohjeiden mukainen. PCR-reaktiota varten mallina käytetty cdna oli peräisin nuldeiinihapoista (joko kokonaisnuldeiinihapoista tai RNA:sta), jotka oli valmistettu yllä kuvatusti. Etanolisaostuksen jälkeen saostuneet nukleiinihapot kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen 20 DEPC:llä käsiteltyyn tislattuun veteen. Nuldeiinihappojen sekundääriset rakenteet rikottiin kuumentamalla 65 C:ssa 10 minuutin ajan ja näytteet jäähdytettiin välittömästi jäissä. cdna syntetisoitiin käyttäen 1-3µg simpanssin kokonais-rna:ta maksasta tai nuldeiinihapoista (tai RNA:sta), jotka oli uutettu gl:sta plasmaa. Synteesi käytti käänteistranskriptaasia ja tapahtui 25 gl:n reaktiossa käyttäen valmistajan, BRL, 25 määrittelemää toimintaohjetta. cdna-synteesiin käytetyt primerit olivat niitä, joita käytettiin myös alla kuvatussa PCR-reaktiossa. cdna-synteesiä varten olevat kaikki reaktioseokset sisälsivät 23 yksikköä ribonukelaasi-inhibiittoria, RNAS1N-R4 (Fisher/Promega). cdna-synteesin jälkeen reaktioseokset laimennettiin vedellä, niitä keitettiin 10 minuuttia ja jäähdytettiin nopeasti jäissä PCR-reaktiot suoritettiin olennaisesti valmistajan (Cetus-Perkin-Elmer) ohjeiden mukaisesti, paitsi että lisättiin 1 gg ribonukleaasi A:ta. Reaktiot suoritettiin 100 µ1:n lopullisessa tilavuudessa. PCR suoritettiin 35 syklin ajan käyttäen lämpötiloina 37 C, 72 C ja 94 C. cdna-synteesiä ja PCR-reaktioita varten olevat primerit olivat peräisin joko kloonin 81, klovnin 36 tai kloonin 37b HCV:n cdna-sekvensseistä. (Kloonien 81, 36 ja 37b

77 75 HCV:n cdna-sekvenssit on esitetty kuvioissa 4, 5 ja vastaavasti 10). Kahden 16- meerin primerin sekvenssit, jotka olivat peräisin kloonista 81 olivat: 5' CAA TCA TAC CTG ACA G 3' 5 ja 5' GAT AAC CTC TGC CTG A 3' Kloonista 36 peräisin olevan primerin sekvenssi oli: 5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'. 10 Kloonista 37b peräisin olevan primerin sekvenssi oli: 5' ACA ATA CGT GT-G TCA C 3'. PCR-reaktioissa primeriparit koostuivat joko kloonista 81 peräisin olevista kahdesta meeristä tai 16-meeristä kloonista 36 ja 16-meeristä kloonista 37b. PCR-rekation tuotteet analysoitiin erottamalla tuotteet alkaalisella geelielektroforeesilla, mitä seurasi Southern-blottaus ja amplifioituneiden HCV:n cdna-sekvenssien osoittaminen 32P-leimatulla sisäisellä oligonukleotidikoettimella, joka oli peräisin siltä 20 HCV:n cdna:n alueelta, mikä ei mene päällekkäin primereiden kanssa. PCRreaktioseoksia uutettiin fenoli/kloroformilla ja nukleiinihapot saostettiin vesifaasista suolalla ja etanolilla. Saostuneet nukleiinihapot kerättiin linkoamalla ja ne liuotettiin tislattuun veteen. Näyte-erille tehtiin elektroforeesi 1,8 % alkaalisella agaroosigeeleillä. 60, 108 ja 161 nukleotidin pituista yksisäikeistä DNA:ta saatettiin samanaikaisesti 25 elektroforeesiin geeleillä moielcyylipainon merkkeinä. Elektroforeesin jälkeen geelillä olevat DNA:t siirrettiin Biorad Zeta ProbeTm-paperille. Esihybridisointi- ja hybridisointi- ja pesuolosuhteet olivat valmistajan (Biorad) ohjeiden mukaisia. Amplifioitujen HCV:n cdna-sekvenssien hybridisaatioon ja osoittamiseen käytetyt 30 koettimet olivat seuraavia. Kun PCR-primeripari johdettiin kloonista 81, koetin oli 108- meeri, jonka sekvenssi vastasi sitä, mikä sijaitsee kahden primerin sekvenssien välisellä alueella. Kun PCR-primeripari oli peräisin klooneista 36 ja 37b, koetin oli kloonista 35 peräisin oleva nicktransloitu HCV:n cdna-insertti. Primerit ovat peräisin kloonin 37b insertin nukleotideista ja kloonin 36 insertin nukleotideista HCV:n 35 cdna-insertin 3'-pää kloonissa 35 menee päällekkäin kloonin 36 insertin nukleotidien kanssa; ja kloonin 35 insertin 5'-pää menee päällekkäin kloonin 37b insertin nukleotidien kanssa. (Vrt. kuviot 5, 8 ja 10). Täten kloonin 35 cdna-insertti

78 76 ulottuu osan alueen yli klooneista 36 ja 37b peräisin olevien primereiden sekvenssien välissä ja se on hyödyllinen koetin nämä primerit sisältäviä amplifioituja sekvenssejä varten. 5 Maksanäytteistä peräisin olevan RNA:n analyysi tehtiin ylläolevan menettelyn mukaisesti käyttäen molempia primereiden ja koettimien sarjoja. Kolmen NANBH:ta sairastavan simpanssin maksasta saatu RNA antoi positiivisia hybridisaatiotuloksia odotetun kokoisille amplifikaatiosekvensseille (161 ja 586 nulcleotidia klooneille 81 ja 36 ja vastaavasti 37b), kun taas vertailusimpanssit antoivat negatiivisia hybridisaatio- 1 0 tuloksia. Samoja tuloksia saatiin, kun kokeet toistettiin kolme kertaa. Plasmasta peräisin olevien nukleiinihappojen ja RNA:n analyysi tehtiin myös ylläolevan menettelyn mukaisesti käyttäen kloonista 81 saatuja primereita ja koetinta. Plasmat olivat NANBH:ta sairastavista simpansseista, vertailusimpanssista, ja 15 vertailusimpanssien varastoiduista plasmoista. Molemmat NANBH-plasmat sisälsivät nukleiinihappoja/rna:ta, joka antoi positiivisia tuloksia PCR-amplifioidussa analyysissä, kun taas molemmat vertailuplasmat antoivat negatiivisisa tuloksia. Näitä tuloksia on saatu toistuvasti useita kertoja. 20 IV.D. RadinimmiinnloginPn analyysi FICV-vasta-aineiden ne.nittamispkci infpktoitnneirlen ykclriirlen ceprnmigsa Kehitettiin kiinteän faasin radioimmunologisia analyysejä vasta-aineiden havaitsemiseksi HCV-antigeeneille perustuen Tsu'n ja Herzenberg'in julkaisuun (1980). 25 Mikrotiitterilevyt (Immulon 2, Removawell-kaistaleet) päällystetään puhdistetuilla polypeptideillä, jotka sisältävät HCV-epitooppeja. Päällystettyjä levyjä inkuboidaan joko ihmisen seeruminäytteiden, joiden epäillään sisältävän vasta-aineita HCV-epitoopeille, kanssa tai sopivien vertailujen kanssa. Inkubaation aikana vasta-aine, jos sellainen on läsnä, sitoutuu immunologisesti kiinteän faasin antigeeniin. 30 Sitoutumattoman materiaalin poistamisen jälkeen ja mikrotiitterilevyjen pesun jälkeen osoitetaan ihmisen vasta-aine-nanbv-antigeenikompleksit inkuboimalla '"I-leimatun lampaan ei-ihmisimmunoglobuliinin kanssa. Sitoutumaton leimattu vasta-aine poistetaan imun avulla ja levyt pestään. Yksittäisten kuoppien radioaktiivisuus määritetään; sidotun ihmisen anti-hcv-vasta-aineen määrä on verrannollinen kuopan 35 radioaktiivisuuteen.

79 IV D 1 FunsiopoIypeptidin SOn-NANR5.1.1 puhdistaminen Fuusiopolypetidi SOD-NANB5.1.1, joka on ekspressoitu yhdistelmäbakteerissa, kuten on kuvattu osassa IV.B.1., puhdistettiin yhdistelmä-e.colista differentiaaliuuttamalla solu- 5 uutteita urealla, mitä seurasi kromatografia anionin- ja kationinvaihtopylväissä seuraavasti. 1 litran viljelmän sulatetut solut suspendoitiin uudestaan 10 ml:aan 20 % (w/v) sukroosia, joka sisälsi 0,01 M Tris-HC1, ph 8,0, ja 0,4 ml 0,5 M EDTA, ph 8,0 lisättiin. 10 Viiden minuutin kuluttua 0 C:ssa seos lingottiin 4000 x g:ssä 10 minuuttia. Tuloksena oleva pelletti suspendoitiin 10 ml:aan 25 % (w/v) suksroosia, joka sisälsi 0,05 M Tris- HC1, ph 8,0, 1 mm fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) ja 1!nimi pepstatiini A:ta, mitä seurasi 0,5 ml:n lisäys lysotsyymiä (10 mg/ml) ja 10 minuutin inkubaatio 0 C:ssa. Sen jälkeen kun oli lisätty 10 ml 1 % (v/v) Triton X-100 0,06 M Tris-HC1:ssä, 15 ph 8,0, 1 mm EDTA, seosta inkuboitiin vielä 10 minuuttia 0 C:ssa silloin tällöin ravistaen. Tuloksena oleva viskoosi liuos homogenoitiin kuljettamalla se kuusi kertaa kooltaan 20 gauge'n injektioneulan läpi ja sitä lingottiin x g:ssä 25 minuutin ajan. Pelletoitu materiaali suspendoitiin 5 ml:aan 0,01 M Tris-HCI, ph 8,0, ja suspensiota lingottiin 4000 x g:ssä 10 minuutin ajan. Pelletti, joka sisälsi SOD-NANB fuusioproteiinin, liuotettiin 5 ml:aan 6 M ureaa 0,02 M Tris-HCl:ssä, ph 8,0, 1 mm ditiotreitolia (puskuri A) ja se pantiin Q-Sepharose Fast Flow-merkkiseen pylvääseen, joka oli tasapainotettu puskuri A:I1a. Polypeptidit eluoitiin 0,0-0,3 M NaCl:n puskuri A:ssa olevalla lineaarisella gradientilla. Eluoinnin jälkeen fraktiot analysoitiin polyakryyyliamidigeelielektroforeesilla SDS:n läsnäollessa niiden SOD-NAN135.,.,- 25 pitoisuuden määrittämiseksi. Fraktiot, jotka sisälsivät tätä polypeptidiä, yhdistettiin ja dialysoitiin 6 M ureaa vastaan 0,02 M natriumfosfaattipuskurissa, ph 6,0, 1 mm ditiotreitolissa (puskuri B). Dialysoitu näyte pantiin puskuri B:llä tasapainotettuun S- Sepharose Fast Flow-pylvääseen ja polypeptidit eluoitiin 0,0-0,3 M NaCl:n puskuri B:ssä olevalla lineaarisella gradientilla. Fraktiot analysoitiin polyakryyliamidigeelie- 30 lektroforeesin avulla SOD-NAN135.1.,:n läsnäolon selvillesaamiseksi ja sopivat fraktiot yhdistettiin. SOD-NANB5.1.1-polypeptidin lopullinen valmiste tutkittiin elektroforeesin avulla polyalcryyliamidigeeleillä SDS:n läsnäollessa. Tähän analyysiin perustuen valmiste oli 35 yli 80 % puhdas. IV D 2 Fuusiopolypeptidin _SCM-NANRai Pnhrlictaminen

80 78 Fuusiopolypeptidi SOD-NANB81, joka on ekspressoitu yhdistelmäbakteerissa, kuten on kuvattu osassa IV.B.2., puhdistettiin yhdistelmä-e.colista solu-uutteiden differentiaaliuuttamisen avulla urealla, mitä seurasikromatografia anionin- ja 5 kationinvaihtopylväissäkäyttäen menettelyä, jota on kuvattu fuusiopolypeptidin SOD- NANBs_i _i eristämisen yhteydessä (ks. osa IV.D.1.). Lopullinen SOD-NANB81-polypeptidin valmiste tutkittiin elektroforeesin avulla polyakryyliamidigeeleillä SDS:n läsnäollessa. Perustuen tähän analyysiin valmiste oli 10 yli 50 % puhdas. IV.D.3. TICV-epitaappica vasfa.aineiden osaittaminpn kiintpän faaqin 15 Seeruminäytteet 32 potilaasta, joiden oli diagnosoitu sairastavan NANBH:a. analysoitiin radioimmunologisella analyysillä (RIA) sen määrittämiseksi, havaitaanko vasta-aineita HCV-epitoopeille, jotka ovat läsnä fuusiopolypeptideissä SOD-NANB5.1., ja SOD-NANB Mikrotiitterilevyt päällystettiin SOD-NANB5.1.1:11a tai SOD-NANB81:11ä, jotka oli osittain puhdistettu osien IV.D.1. ja vastaavasti IV.D.2. mukaisesti. Analyysit suoritettiin seuraavasti. 100 µi näytteitä, jotka sisälsivät 0,1-0,5 µg SOD- 25 NANB5.1.1:a tai SOD-NANB81:a 0,125 M Na-boraattipuskurissa, ph 8,3, 0,075 M NaCl:ssa (BBS) lisättiin mikrotiitterilevyn (Dynatech Immulon 2 Removawell Strips) kuhunkin kuoppaan. Levyä inkuboitiin 4 C:ssa yli yön kosteassa kammiossa, minkä jälkeen proteiiniliuos poistettiin ja kuopat pestiin kolme kertaa BBS:llä, joka sisälsi 0,02 % Triton X-100 (BBST). Ei-spesifisen sitoutumisen estämiseksi kuopat peitettiin härän 30 seerumin albumiinilla (BSA) lisäämällä 100 µi 5 mg/ml:n BSA-liuosta BBS:ssä, mitä seurasi 1 tunnin inkubaatio huoneenlämpötilassa; tämän inkubaation jälkeen liuos poistettiin. Päällystetyissä kuopissa olevat polypeptidit saatettiin reagoimaan seerumin kanssa lisäämällä 100 µi seeruminäytteitä, jotka oli laimennettu 1:100 0,01 M Nafosfaattipuskuriin, ph 7,2, 0,15 M NaC1 (PBS) sisältäen 10 mg/ml BSA:ta ja inkuboitiin 35 seerumia sisältäviä kuoppia 1 tunti 37 C:ssa. Inkubaation jälkeen seeruminäytteet poistettiin imulla ja kuopat pestiin 5 kertaa BBST:llä. Anti-NANB5.1 _, ja anti-nani381, jotka olivat sitoutuneet fuusiopolypeptideihin, määritettiin kiinnittämällä '251-leimattua

81 79 F'(ab)2-lampaan anti-ihmis IgG:tä päällystettyihin kuoppiin. 100 µ1:n näytteitä leimattua koetinta (spesifinen aktiivisuus 5-20 µci/µg) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin 37 C:ssa 1 tunti, mitä seurasi ylimääräisen koettimen poistaminen imulla ja 5 pesua BBST:llä. Kuhunkin kuoppaan sitoutuneen radioaktiivisuuden määrä 5 määritettiin laskemalla laskurissa, joka havaitsee gammasäteilyn. Anti-NANB5.1_,:n ja anti-nanb81:n havaitsemisen tulokset yksilöistä, joilla oli NANBH, on esitetty taulukossa Taulukko 1 Anti-5-1-1:n ja anti-81:n osoittaminen NANB-, HAV- ja HBV-potilaiden seerumista Potilas 15 viite- S/N numero Diagnoosi Anti Anti Kroon. NANB, IVD2 Kroon. NANB, IVD Kroon. NANB, IVD 0,77 1,14 2,11 4,20 5,14 4, AVH3, NANB, ajoitt. Kroon. NANB Kroon. NANB AVH, NANB, IVD Kroon. NANB, IVD Kroon. NANB, IVD 1,09 33,89 36,22 1,90 34,17 32,45 1,05 11,39 13,67 1,54 30,28 30, Kroon. NANB, PT4 16,09 8, M yöh. AVH, NANB, IVD 0,69 M yöh. AVH, NANB, IVD 0,73 0,94 0, AVH, NANB, IVD AVH, NANB, IVD 1,66 1,53 1,96 0, Kroon. NANB, PT Kroon. NANB, PT Kroon. NANB, PT Kroon. NANB, PT 34,40 45,55 41,58 44,20 7,55 13,11 13,45 15,48 Potilas viite- S/N numero Diagnoosi Anti Anti AVH, NANB, IVD "terve" äskett. NANB, AVH 31,92 6, Myöh. AVH, NANB, PT 11,84 31,95 4,45 5,79

82 AVH, NANB, IVD 6,52 1, Myöh. AVH, NANB, PT 39,44 39, Kroon. NANB, PT 42,22 37, AVH, NANB, PT 1,35 1, Kroon. NANB?, PT 0,35 0, AVH, NANB, IVD 6,25 2, Kroon. NANB, PT 0,74 0, AVH, NANB, PT 5,40 1, Kroon. NANB, PT 0,52 0, AVH, NANB 23,35 4, AVD, tyyppi A 1,60 1, AVH, tyyppi A 1,30 0, AVH, tyyppi A 1,44 0, Päätt. äskett. AVH tyyppi A 0,48 0, AVH, tyyppi A 0,68 0,64 Päätt. AVH, tyyppi A 0,80 0, Päätt. äskett. AVH 35 tyyppi A 1,38 1,04 Päätt. äskett. AVH tyyppi A 0,80 0, AVH, tyyppi A 1,85 1,16 40 Päätt. äskett. AVH tyyppi A 1,02 0, AVH, tyyppi A 1,35 0, Myöh. AVH, HBV 0,58 0,55 50 Potilas viite- S/N numero Diagnoosi Anti Anti Kroon. HBV 0,84 1, Myöh. AVH, HBV Kroon. HBV 3,20 0,47 1,60 0,46

83 AVH, HBV 0,73 0,60 terveht. AVH, HBV 0,43 0, AVH, HBV 1,06 0,92 terveht. AVH, HBV 0,75 0, AVH, HBV 1,66 0,61 terveht. AVH, HBV 0,63 0, AVH, HBV 1,02 0,73 terveht. AVH, HBV 0,41 0, AVH, HBV 1,24 1,31 terveht. AVH, HBV 1,55 0, AVH, HBV 0,82 0,79 terveht. AVH, HBV 0,53 0, AVH, HBV 0,95 0,92 terveht. AVH, HBV 0,70 0, AVH, HBV 1,03 0,68 terveht. AVH, HBV 1,71 1,39 25 I jaksottaisia seeruminäytteitä saatavissa näistä potilaista 2 IVD = Intravenous Drug User = suonensisäisten lääkkeiden käyttäjä 3 AVH = Acute Viral Hepatitis = akuutti virushepatiitti 4 PT = Post transfusion = verensiirron jälkeinen. 30 Kuten nähdään taulukosta 1, 19 32:sta seerumista potilaista, joilla oli diagnosoitu olevan NANBH, oli positiivisia SOD-NANB5.1 _,:ssä ja SOD-NANB8,:ssä läsnä olevia HCVepitooppeja vastaan suunnattujen vasta-aineiden suhteen. Kuitenkaan seeruminäytteet, jotka olivat positiivisia, eivät olleet samalla tavalla reaktiivisia SOD-NANB5.1_,:n ja SOD-NANB8,:n kanssa. Potilaasta No. 1 otetut 35 seeruminäytteet olivat positiivisia SOD-NANB81:n suhteen, mutteivat SOD-NAN135.,.,:n suhteen. Seeruminäytteet potilaista numerot 10, 15 ja 17 olivat positiivisia SOD- NANB5.1.,:n suhteen, mutteivat SOD-NANB8,:n suhteen. Seeruminäytteet potilaista numerot 3, 8, 11 ja 12 reagoivat samalla tavalla molempien fuusiopolypeptidien kanssa, kun taas seeruminäytteet potilaista numerot 2, 4, 7 ja 9 olivat 2-3 kertaa korkeampia 40 reaktiossaan SOD-NANB5.1.,:n kanssa kuin SOD-NANB8,:n kanssa. Nämä tulokset ehdottavat, että NANB5.1., ja NANB81 voivat sisältää ainakin kolme erilaista epitooppia; s.o. on mahdollista, että kukin polyppetidi sisältää ainakin yhden ainutkertaisen epitoopinja että näillä kahdella polypeptidillä on ainakin yksi yhteinen epitooppi. 45

84 82 IV.D.4. Kiinte n faasin RIA-13 gpegifisyys NANRIFIle Kiinteän faasin NANBH:ta varten olevien RIA:iden spesifisyys kokeiltiin käyttäen analyysiä sellaisten potilaiden seerumiin, joilla oli HAV tai HBV ja vertailuyksilöiden 5 seerumiin. Analyysit käyttäen osittain puhdistettua SOD-NANB5.1.,:a ja SOD-NANBal:a suoritettiin olennaisesti kuten on kuvattu osassa IV.D.3., paitsi että seerumi oli peräisin potilaista, joilla oli aikaisemmin diagnosoitu joko HAV tai HBV tai yksilöistä, jotka olivat veripankkiluovuttajia. Tulokset HAV- tai HBV-sairaiden potilaiden seerumista on esitetty taulukossa 1. RIA suoritettiin käyttäen 11 seeruminäytettä HAV-sairaista 10 potilaista ja 20 seeruminäytettä HBV-sairaista potilaista. Kuten nähdään taulukosta 1, mikään näistä seerumeista ei antanut positiivista immunologista reaktiota BB-NANBVepitooppeja sisältävien fuusiopolypeptidien kanssa. Suoritettiin RIA käyttäen NANB5.1.1-antigeeniä vertailuyksilöiden seerumin 15 immunologisen reaktiivisuuden määrittämiseksi. 230:stä seeruminäytteestä, jotka saatiin normaalista verenluovuttajaväestöstä, saatiin vain kaksi positiivista reaktiota RIA:ssa (tietoja ei ole esitetty). On mahdollista, että kaksi verenluovuttajaa, joista seeruminäytteet olivat peräisin, olivat aikaisemmin altistuneet HCV:11e. 20 IV.D.5. NAN1.5.1.fn renk-tiivisims NANRH-infektinn aikalm Anti-NANBs_ i _ i-vasta-aineiden läsnäoloa NANBH-infektion aikana 2 potilaassa ja 4 simpanssissa seurattiin käyttäen RIA:aa, kuten on kuvattu osassa IV.D.3. Lisäksi RIA:aa käytettiin määrittämään anti-nanb5.1.1-vasta-aineiden läsnäoloa tai poissaoloa 25 HAV- tai HBV-infektion aikana sairaissa simpansseissa. Tulokset, jotka on esitetty taulukossa 2, osoittavat että simpansseissa ja ihmisissä havaittiin anti-nanb5.1.1-vasta-aineita NANBH-infektion akuutin vaiheen puhkeamisen jälkeen. Anti-NANB5.1.1-vasta-aineita ei havaittu joko HAV- tai HBV-infektoituneiden simpanssien seeruminäytteissä. Täten anti-nanb5_1 _1-vasta-aineet toimivat markkereina 30 yksilön joutumiselle HCV:n hyökkäyksen kohteeksi. Taulukko 2 Seerumin muuttuminen jaksottaisissa seeruminäytteissä hepatitispotilaissa ja - 35 simpansseissa käyttäen antigeeniä

85 83 Potilas/ Näytepv (pv) Hepatitis- Anti ALT simpanssi (o=tart.pv.) virukset (S/N) (mp/m1) 5 Potilas 29 T# T+180 T+208 NANB 1,09 33,89 36, Potilas 30 T 10 T+307 T+799 NANB 1,90 34,17 32, Simp Simp Simp NANB NANB NANB 0,87 9 0, , ,41 1,00 5 1, , ,01 1,08 8 1, , , Potilas/ Näytepv (pv) Hepatitis- Anti ALT simpanssi (o=tart.pv.) virukset (S/N) (mp/m1) Simp NANB 1,12 1,25 6,60 17, Simp HAV 1,50 4 2, , ,53 5 Simp. 6-8 HAV 0, , , Simp HAV 1,17 1, ,55 5 1,60 Simp HAV 0, , ,77 8 1,27 5

86 Simp HBV 1, , , Simp HBV 2, (var.) 2, (var.) 205 2, , Simp HBV 1, (var.) 1, (var.) ,52 10 #T = alkuperäisen näytteen päivä 20 nen N.E. NA.NB5_,_1.3 vactaan olevien pnlyklnnaalisten asta-aineirlim Perustuen SOD-NANB5.1.1-polypeptidin spesifiseen immunologiseen reaktiivisuuteen NANBH-potilaiden seeruminäytteiden vasta-aineiden kanssa kehitettiin menetelmä sellaisten seerumivasta-aineiden puhdistamiseksi, jotka reagoivat immunologisesti 25 NANB5.1_,:ssä olevien epitooppien kanssa. Tämä menetelmä käyttää affiniteettikromatografiaa. Puhdistettu SOD-NANB5.1.1-polypeptidi (ks. osa IV.D.1.) kiinnitettiin Iiukenemattomalle kantajalle; kiinnitys on sellainen, että immobilisoitu polypeptidi säilyttää affinitetttinsa NANB5.1.,:n vasta-aineelle. Seeruminäytteiden vasta-aine absorboidaan matriisiin sidot- 30 tuttu polypeptidiin. Kun on suoritettu pesu epäspesifisesti sitoutuneiden materiaalien poistamiseksi, sitoutunut vasta-aine vapautetaan sitoutuneesta SOD-HCVpolyppetidistä ph:n muutoksella ja/tai kaotrooppisilla reagensseilla, esimerkiksi urealla. Nitroselluloosakalvoja, jotka sisälsivät sitoutunutta SOD-NANB5.1.,:a, valmistettiin seu- 35 raavasti. Nitroselluloosakalvoa, 2,1 cm:n Sartoriusta, jonka huokoskoko oli 0,2 gm, pestiin kolme minuuttia kolme kertaa BBS:llä. SOD-NANB5.1 _, kiinnitettiin kalvoon inkuboimalla puhdistettua valmistetta BBS:ssä huoneen lämpötilassa 2 tuntia; vaihtoehtoisesti sitä inkuboitiin 4 C:ssa yli yön. Liuos, joka sisälsi sitoutumatonta antigeenia, poistettiin ja suodatin pestiin kolme kertaa BBS:llä kolme minuuttia pesua kohti. Jäljelle 40 jääneet aktiiviset paikat kalvossa blokattiin BSA:lla inkuboimalla 5 mg/ml:n BSAliuoksella 30 minuuttia. Ylimääräinen BSA poistettiin pesemällä kaivoa viisi kertaa BBS:llä ja kolme kertaa tislatulla vedellä. Kaivoa, joka sisälsi virusantigeenin ja BSA:n,

87 85 käsiteltiin sitten 0,05 M glysiinihydrokloridilla, ph 2,5, 0,10 M NaCl (GlyHCl) 15 minuutin ajan, mitä seurasi kolme kolmen minuutin pesua PBS:11ä. Polykionaaliset anti-nanb5.1.1-vasta-aineet eristettiin inkuboimalla kaivoja, jotka sisäl- 5 sivät fuusiopolypeptidin seerumin kanssa yksiöstä, jolla oli NANBH, kaksi tuntia. Inkubaation jälkeen suodattimia pestiin viisi kertaa BBS:llä ja kahdesti tislatulla vedellä. Sitoutuneet vasta-aineet eluoitiin sitten kustakin suodattimesta viidellä eluoinnilla GlyHCl:llä, kolme minuuttia per eluointi. Eluaattien ph säädettiin ph 8,0:aan keräämällä kukin eluaatti koeputkeen, joka sisälsi 2,0 M Tris-HCI, ph 8,0. Anti-NANB5.1.1-vasta- 10 aineen palautus affiniteettikromatografian jälkeen on suurin piirtein 50 %. Nitroselluloosakalvoja, jotka sisältävät sidotun virusantigeenin, voidaan käyttää useita kertoja ilman, että niiden sitomiskyky merkittävästi alentuu. Kalvojen uudelleen käyttämiseksi sen jälkeen, kun vasta-aineet on eluoitu, kalvot pestään BBS:llä kolme kertaa 15 kolmen minuutin ajan. Niitä säilytetään sitten BBS:ssä 4 C:ssa. IV F 1104artikkeleiden_sieppnarninen infektoitunersta plasmnsta käyttäen pubdistetmja ihmisen polyklonaalisia anti-hcv-vasta-airipita: siepatuicsa partikkeleicqa nleviprt Purkleiinihnppojen hyhrirliqaatio HCV-n enna han 20 IV F 1 HOLpartikkeieiripn qieppnus infektoihmeesta pl2smrsta käyttäen ihmisen polyk.lonanliqia ant;i4cv-vaqta.-aineita NANBH:ta sairastavan simpanssin infektoituneessa plasmassa olevat proteiini- 25 nuicleiinihappokompleksit eristettiin käyttäen puhdistettuja ihmisen polyklonaalisia anti- HCV-vasta-aineita, jotka kiinnitettiin polystyreeniheimiin. Polyklonaaliset anti-nanb5.1.1-vasta-aineet puhdistettiin NANBH:ta sairastavan ihmisen seerumista käyttäen SOD-HCV-polypeptidiä, joka on koodattu klooniin Puh- 30 distusmenetelmä oli sama, joka on kuvattu osassa IV.E. Puhdistetut anti-nanb5_ 1.1-vasta-aineet kiinnitettiin polystyreenipallosiin (halkaisijaltaan 6,35 mm, peilipinta, Precision Plastic Ball Co., Chicago, Illinois, USA) inkuboimaila kutakin huoneen lämpötilassa yli yön 1 ml:n kanssa vasta-aineita (1 gg/m1 boraat- 35 tipuskuroidussa suolaliuoksessa, ph 8,5). Yli yön tapahtuneen inkubaation jälkeen, palloset pestiin kerran TBST:llä (50 mm Tris-HC1, ph 8,0, 150 mm NaCl, 0,05 % (v/v)

88 86 Tween 20) ja sitten fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), joka sisälsi 10 mg/ml BSA:ta. Vertailupalloset valmistettiin identtisellä tavalla, paitsi että puhdistettu anti-nanb vasta-aineet korvattiin ihmisen kokonaisimmunoglobuliinilla. HCV:n sieppaaminen NANBH:ta sairastavan simpanssin plasmasta käyttäen anti- NANB5.1.1-vasta-aineita, jotka oli kiinnitetty pallosiin, suoritettiin seuraavasti. NANBH:ta sairastavan simpanssin plasmaa on kuvattu osassa IV.A.1.. NANBV-infek- 10 toituneen simpanssin plasman erää (1 ml) inkuboitiin 3 tuntia 37 C:ssa kunkin viidestä pallosesta kanssa, jotka olivat peitettyjä joko anti-nanb5.1 _1-vasta-aineilla tai vertailuimmunoglobulfineilla. Palloset pestiin kolme kertaa TBST:llä. IV.F.2. Siepatuissapartikkeleissaale3zien_nukleiiniha 15 rnna linn 20 Nukleiinihappokomponentti, joka oli vapautettu partikkeleista, jotka oli siepattu anti- NANB5.1.1-vasta-aineilla, analysoitiin kloonista 81 peräisin olevan HCV:n cdna:n hybridisaation suhteen. HCV-partikkelit siepattiin NANBH-infektoituneen simpanssin plasmasta, kuten on kuvattu osassa IV.F.1.. Nukleiinihappojen vapauttamiseksi partikkelista pestyjä pallosia inkuboitiin 60 minuuttia 37 C:ssa 0,2 ml:n kanssa per pallonen liuosta, joka sisälsi proteinaasi k:ta (1 mg/ml), 10 mm Tris-HC1:a, ph 7,5, 10 mm EDTA:aa, 0,25 % (w/v) 25 SDS:ää, 10 µg/ml liukoista hiivan RNA:ta ja erottunut liuos poistettiin. Liuosta uutettiin fenolilla ja kloroformilla ja nuldeiinihapot saostettiin etanolilla yön aikana -20 C:ssa. Nukleiinihapposaostuma kerättiin linkoamalla, kuivattiin ja liuotettiin 50 mm Hepesliuokseen ph:ssa 7,5. Kaksoiserät liukoisista nukleiinihapoista näytteistä, jotka saatiin pallosista, jotka oli päällystetty anti-nanb5.1.1-vasta-aineilla ja vertailupallosista, jotka 30 sisälsivät ihmisen kokonaisimmunoglobuliinia, suodatettiin nitroselluloosasuodattimille. Suodattimet hybridisoitiin nicktranloidulla koettimella, joka oli tehty kloonin 81 puhdistetusta HCV:n cdna-fragmentista. Menetelmiä koettimen valmistamiseksi ja hybridisoimiseksi on kuvattu osassa IV.C Koettimella hybridisoitujen suodattimien, jotka sisältävät nuldeiinihapot partikkeleista, jotka on siepattu anti-nanb5.1.1-vasta-aineita sisältävistä pallosista, autoradiografit on esitetty kuviossa 40. Uutos, joka on saatu käyttäen anti-nanb5.1.1-vasta-aineita (A1,A2),

89 87 antoi selviä hybridisaatiosignaaleja verrattuna vertailuvasta-aineuutokseen (A3,A4) ja vertailuhiiva-rna:han (BI,B2). Standardit, jotka muodostuivat puhdistetun kloonin 81 cdna-fragmentin lpg:stä, 5pg:stä ja l0pg:stä, on esitetty kohdissa Cl - 3 vastaavasti. 5 Nämä tulokset osoittavat, että NANBH-plasmasta anti-nanb5.1.1-vasta-aineiden avulla siepatut partikkelit sisältävät nukleiinihappoja, jotka hybridisoituvat HCV:n cdna:n kanssa ldoonissa 81 ja täten antavat lisätodisteita, että näiden kloonien cdna:t ovat peräisin NANBH:n etiologisesta aiheuttajasta. 10 IV G ri nn-3.n immunninginpn rpaktiivisims anti-nanr5.11-vacta-nineiclen kancc.1 C100-3-fuusiopolypeptidin immunologinen reaktiivisuus anti-nanb5.1-1-vasta-aineiden kanssa määritettiin radioimmunologisella analyysillä, jossa antigeenit, jotka olivat kiinnitettyjä kiinteään faasiin saatettiin kosketuksiin puhdistettujen anti-nanb5.1.1-vasta- 15 aineiden kanssa ja antigeeni-vasta-ainekomplelcsi osoitettiin 125I-leimatuilla veren antiihmisvasta-aineilla. C100-3-polypeptidin immunologisia reaktiivisuutta verrattiin SOD- NANB5.1.1-antigeenin vastaavaan arvoon. Fuusiopolypeptidi C100-3 syntetisoitiin ja puhdistettiin, kuten on kuvattu osassa 20 IV.B.5. ja vastaavasti osassa IV.B.6.. Fuusiopolypeptidi SOD-NANB5.1 _, syntetisoitiin ja puhdistettiin, kuten on kuvattu osassa IV.B.1. ja vastaavasti osassa IV.D.1.. Puhdistetut anti-nanb5.1.1-vasta-aineet saatiin, kuten on kuvattu osassa IV.E :n eriä, jotka sisälsivät vaihtelevia määriä puhdistettua C100-3-antigeeniä 0, M Na-boraattipuskurissa, ph 8,3, 0,075 M NaCI (BBS), lisättiin kuhunkin mikrotiitterilevyn (Dynatech Immulon 2 Removawell Strips) kuoppaan. Levyä inkuboitiin yli yön 4 :ssa kosteassa kammiossa, minkä jälkeen proteiiniliuos poistettiin ja kuopat pestiin kolme kertaa BBS:11ä, joka sisälsi 0,02 % Triton X-100 (BBST). Epäspesifisen sitoutumisen estämiseksi kuopat peitettiin BSA:lla lisäämällä 100 gl 5 mg/ml:n BSA:n liuosta 30 BBS:ssä, mitä seurasi inkubaatio huoneenlämpötilassa tunnin ajan, minkä jälkeen yli-. määräinen BSA-liuos poistettlin.polypeptidien päällystetyissä kuopissa annettiin reagoida puhdistettujen anti-nanb5.1.1-vasta-aineiden kanssa lisäämällä 1 p.g vasta-ainetta kuoppaa kohti ja inkuboimalla näytteitä 1 tunti 37 C:ssa. Inkubaation jälkeen ylimääräinen liuos poistettiin imulla ja kuopat pestiin viisi kertaa BBST:llä. Anti-NANB5.1.1, 35 joka oli sitoutunut fuusiopolypeptideihin, määritettiin wi-leimatun F'(ab)2-lampaan antiihmis-igg:n sitoutumisena pwlystettyihin kuoppiin :n eriä leimattua koetinta (spesifinen aktiivisuus 5-20 µci/gg) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin

90 C:ssa yksi tunti, mitä seurasi ylimääräisen koettimen poistaminen imulla ja viisi pesua BBST:llä. Kuhunkin kuoppaan sitoutuneen radioaktiivisuuden määrä määritettiin laskemalla laskurissa, joka tunnistaa gammasäteilyn. 5 C100:n immunologisen reaktiivisuuden tulokset anti-nanb5.1.1 :n kanssa verrattuna NAN :n reaktiivisuuteen puhdistettujen vasta-aineiden kanssa on esitetty taulukossa Taulukko 3 C100-3:n immunologinen reaktiivisuus verrattuna NANB5_ 1_,:een määritettynä radioimmunologisella analyysillä 15 RIA (cpm/analyysi) AG(ng) NANB C Taulukon 3 tulokset osoittavat että anti-nanb5.1_, tunnistaa C100-3-polypeptidin C100- puoliskon epitoopit. Täten NANB5.1.1:11ä ja C100:11a on yhteisiä epitooppeja. Tulokset ehdottavat, että tätä NANBV-epitooppia koodaava cdna-sekvenssi on se, joka on läsnä sekä ldoonissa että kloonissa IV.H. Trirv-n karaktericninti IV H 1 T-ICV-unnmin qäikpettömyyden karakterkninti HCV-genomi karakterisoitiin säikeettömyytensä suhteen eristämällä nukleiinihappo- 30 fraktio partikkelista, jotka oli siepattu anti-nanb5.1.1-vasta-aineella päällystetyille polystyreenipallosille ja määrittämällä, onko eristetty nulcleiinihappo hydridisoitunut HCV:n cdna:n plus- vai miinussäikeiseisiin. Partikkelit siepattiin HCV-infektoituneen simpanssin plasmasta käyttäen polysty- 35 reenipallosia, jotka oli päällystetty immunopuhdistetulla anti-nanb5.1.1-vasta-aineella, kuten on kuvattu osassa IV.F.1. Partikkleiden nuldeiinihappokomponentti vapautettiin käyttäen menetelmää, joka on kuvattu osassa IV.F.2. Eristetyn genomin numleiinihaposta peräisin olevia näytteitä, jotka vastasivat 3 ml:aa korkean tiitterin

91 89 posta peräisin olevia näytteitä, jotka vastasivat 3 ml:aa korkean tiitterin plasmaa, blotattiin nitroselluloosasuodattimille. Vertailuna blotattiin samoille suodattimille näytteitä denaturoidusta HCV:n cdna:sta kloonista 81 (2 pg). Suodattimia tutkittiin 32Pleimatulla, HCV:n cdna:sta kloonatulla yksisäikeisen DNA:n plus- ja miinussäikeiden 5 seoksella; cdna:t leikattiin klooneista 40b, 81 ja 25c. Yksisäikeiset koettimet saatiin leikkaamalla HCV:n cdna:t klooneista 81, 40b ja 25c EcoRI:lla ja kloonaamalla cdna-frgamentit M13-vektoreihin mpl8 ja mp19 (Messing (1983)). M13-kloonit sekventoitiin sen määrittämiseksi, sisälsivätkö ne HCV:n 10 cdna:sta peräisin olevia plus- vai miinnussäikeitä. Sekventointi suoritettiin Sanger et al.:n (1977) dedeoksiketjun terminaatiomenetelmällä. Kukin kaksoissuodattimien sarjasta sisältäen näytteitä HCV-genomista, joka oli eristetty siepatuista partikkelista, hydridisoitiin joko plus- tai miinnussäikeisten, HCV:n 15 cdna:sta peräisin olevien koettimien kanssa. Kuvio 41 esittää autoradiografit, jotka on saatu tutkimalla NANBV-genomia klooneista 81, 40b ja 25c peräisin olevien koettimien seoksella. Tätä seosta käytettiin-iisäämään hybridisaatioanalyysin herkkyyttä. Levyllä I olevat näytteet hybridisoitlin prussäikeisten koettimien seoksella. Levyllä II olevia näytteiutä tutkittiin hydridisaatiolla miinussäikeisten koettimien seoksen kanssa. Levyillä 20 olevien immunoblottien näytteiden koostumukset on esitetty taulukossa 4. Taulukko 4 kaista 25 1 HCV-genomi 2 3 cdna 81 4 cdna * = kuvaamaton näyte. Kuten nähdään kuvion 41 tuloksista, vain miinussäikeinen DNA-koetin hydridisoituu eristetyn HCV-genomin kanssa. Tämä tulos yhdessä sen tuloksen kanssa, joka osoittaa, että genomi on herkkä ribonukleaasille, muttei deoksinukleaasille (ks. osa IV.C.2.), eh- 35 dottaa, että NANBV:n genomi on positiivissäikeistä RNA:ta. Nämä tiedot ja tiedot muista laboratorioista, jotka koskevat oletetun NANBV:n fysiko-

92 90 kemiallisia ominaisuuksia, ovat yhtäpitäviä sen mahdollisuuden kanssa, että HCV on Flaviviridaen jäsen. Kuitenkin mahdollisuutta, että HCV edustaisi uutta virusten luokkaa, ei ole eliminoitu. 5 IV H 2 Sellaisten qiepathijpp parrikkeleiden gekvengsie.d havaitseminen, jntka arnplifilaiiima2cr:11ähybridisoit~doonista_s.1 per' iqin olevqn.hcv TI cdna:n kansa Siepatuissa partikkeleissa oleva RNA saatiin, kuten on kuvattu osassa IV.H.1. Sellaisten sekvenssien analyysi, jotka hybridisoituvat kloonista 81 peräisin olevan HCV:n 10 cdna:n kanssa, suoritettiin käyttäen PCR-amplifikaatiomenettelyä, kuten on kuvattu osassa IV.C.3., paitsi että hybridisaatiokoetin oli kinaasilla käsitelty oliginukleotidi, joka oli peräisin kloonin 81 cdna-sekvenssistä. Tulokset osoittivat, että amplifloitu sekvenssi hybridisoitui kloonista 81 peräisin olevan HCV:n cdna-koettimen kanssa. 15 IV H 3 Homologin Pi-struktnraRliqen Denguen Flnviviniksen (MN1WWVD1) prnteiinin ja klooniep 14i - 30c yhdistettyyn nr.f äfin koodatti.ijpn HCV-pnlypeptirlipn vfilillä Kloonien 14i - 39c yhdistetyt HCV:n cdna:t sisältävät yhden jatkuvan avoimen lukualueen, kuten on esitetty kuviossa 26. Siihen koodattu polypeptidi analysoitiin homolo- 20 giasekvenssin löytämiseksi Denguen flaviviruksen (MNWVD1) ei-strukturaalisten polypeptidien alueen kanssa. Analyysi käytti Dayhoffin proteiinitietokantaa ja se suoritettiin tietokoneella. Tulokset on esitetty kuviossa 42, jossa symboli (:) merkitsee tarkkaa homologiaa ja symboli (.) merkitsee vähäistä muutosta sekvenssissä; ajatusviivat merkitsevät välejä, jotka on tehty sekvenssiin suurimpien homologioiden aikaansaamiseksi. 25 Kuten kuvasta nähdään, HCV:n cdna:han koodatun ja Denguen viruksen eistrukturaalisten polypeptidien välillä on merkittävää homologiaa. Kuviossa 42 esitetyn homologian lisäksi sisälsi cdna:n 3'-päähän koodattu polypeptidisekvenssi myös sekvenssejä, jotka ovat homologisia sekvenssien kanssa Denguen polymeraasissa. Tämän löydöksen seurauksena on, että kanooninen Gly-Asp-Asp (GDD)- sekvenssi, jonka aja- 30 teltiin olevan olennainen RNA-riippuville RNA-polymeraaseille, sisältyy HCV:n CDNA:han koodattuun polypeptidiin asemassa, joka on yhtäpitävä Dengue 2-viruksen vastaavan osan kanssa. (Tietoa ei ole esitetty). 35 IV H 4 1-ICV-TWA ta ei havaita NANRT-T-infeletoitimpessa kiltinkceqca Kahden tyyppiset tutkimukset antavat tuloksia, jotka ehdottavat, ettei HCV-DNA ole havaittavissa sellaisen yksilön kudoksessa, jolla on NANBH. Nämä tulokset yhdessä

93 91 osissa N.C. ja N.H.1. ja IV.H.2. saatujen tuloksien kanssa antavat todisteita siitä, ettei HCV ole DNA:ta sisältävä virus ja ettei sen replikaatio liity cdna:han. IV H 4 a. Southern Rinttausmenettely Sen määrittämiseksi, sisältääkö NANBH-infektoituneen simpanssin maksa havaittavaa HCV-DNA:ta (tai HCV-cDNA:ta), tästä lähteestä eristetyn DNA:n restriktioentsyymifragmentteja Southern-blotattiin ja blotteja tutkittiin 32P-leimatulla HCV:n cdna:11a. Tulokset osoittivat, ettei leimattu HCV:n cdna hybridisoitunut infektoituneen sim- 10 panssin maksasta peräisin olevan blotatun DNA:n kanssa. Se ei myöskään hybridisoitunut normaalin simpanssin maksasta olevan vertailuna käytetyn blotatun DNA:n kanssa. Tälle vastakohtana positiivisessa vertailussa leimattu betainterferonigeenin koetin hybridisoitui voimakkaasti restriktioentsyymillä pilkotun ihmisen istulcka-dna:n Southern-blotteihin. Nämä järjestelmät olivat suunniteltuja havaitsemaan sen geenin 15 yksittäinen kopio, joka oli tarkoitettu tulla havaituksi leimatulla koettimella. DNA:t eristettiin kahden NANBH-simpanssin maksasta. Vertailu-DNA:t eristettiin infektoitumattoman simpanssin maksasta ja ihmisen istukoista. DNA:n uuttamismenettely oli olennaisesti Maniatis et al. (1982) mukainen ja DNA-näytteitä käsiteltiin ribonukle- 20 aasilla eristysmenettelyn aikana. Kutakin DNA-näytettä käsiteltiin joko EcoRI:11a, Mbol:lla tai Hincll:lla (12 1.1g) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pilkotut DNA:t elektroforesoitiin 1%:11e neutraalille agaroo-. sigeeleille, ne Southem-blotattiin nitroselluloosalle ja blotattu materiaali hybridisoitiin 25 sopivalla nicktransloidulla koetin-cdna:11a (3 x 106 cpm/m1 hybridisaatioseosta). Infektoituneesta simpanssin maksasta ja normaalista maksasta peräisin oleva DNA hybridisoitiin 32P-leimatulla kloonien 36 ja 81 HCV:n cdna:11a; ihmisen istukan DNA hybridisoitiin 32P-leimatulla betainterferonigeenin DNA:11a. Hybridisaation jälkeen blotit pestiin ankarissa olosuhteissa, s.o. liuoksella, joka sisälsi 0,1 x SSC, 0,1 % SDS C:ssa. Betainterferoningeenin DNA valmistettiin kuten on kuvannut Houghton et al. (1981). 35 IV.H.4.b. AmplifiknAtin PR-tekniiknl1R Sen määrittämiseksi, voidaanko HCV-DNA:ta havaita NANBH:ta sairastavien simpanssien maksasta, DNA eristettiin kudoksesta ja sille tehtiin PCR-amplifikaatio-määritys

94 92 käyttäen primereita ja koetinpolynukleotideja, jotka olivat peräisin HCV:n cdna:sta kloonista 81. Negatiiviset vertailut olivat DNA-näytteitä, jotka oli eristetty infeictoitumattomista HepG2-kudoksen viljelysoluista ja oletettavasti infektoitumattomasta ihmisen istukasta. Positiiviset vertailut olivat negatiivisten vertailu-dna:oitten näytteitä, 5 joihin oli lisätty tunnettu, suhteellisen pieni määrä (250 molekyyliä) HCV:n cdnainserttiä kloonista 81. Lisäksi sen varmistamiseksi, että NANBH:ta sairastavien simpanssien samoista maksoista eristetyt RNA-fraktiot sisälsivät sekvenssejä, jotka olivat kompiementäärisiä 10 HCV-cDNA-koettimelle, käytettiin PCR-amplifikaatio-määritysjärjestelmää myös eristettyihin RNA-näytteisiin. 15 Tutkimuksissa DNA:t eristettiin menetelmällä, jota on kuvattu osassa IV.H.4.a. ja RNA:t uutettiin olennaisesti siten, kuin on kuvannut Chirgwin et al. (1981). DNA-näytteet eristettiin kahden infektoituneen simpanssin maksasta, infektoitumattomista HepG2-soluista ja ihmisen istukasta. Yksi 1.1g kutakin DNA:ta pilkottiin HindIII:Ila valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pilkotut näytteet PCR-amplifikoitiin ja osoitettiin amplifioidusta HCV:n cdna:sta olennaisesti kuten on kuvattu osassa IV.C.3., paitsi 20 että käänteistranskriptaasivaihe jätettiin pois. PCR-primerit ja koetin olivat HCV:n cdna:ta kloonista 81 ja niitä on kuvattu osassa IV.C.3.. Ennen amplifiointia yhden mikrogramman näytteeseen kutakin DNA:ta, positiivisia vertailuja varten, lisättiin 250 molekyyliä HCV:n cdna-inserttiä, joka oli eristetty kloonista 81. :. 25 Sen määrittämiseksi, oliko läsnä HCV-sekvenssejä RNA:ssa, joka oli eristetty NANBH:ta sairastavien simpanssien maksoista, näytteitä, jotka sisälsivät 0,4 µg kokonais-rna:ta amplifioitiin olennaisesti kuten on kuvattu osassa IV.C-3., paitsi että käänteistranskriptaasi jätettiin pois joistakin näytteistä negatiivisena vertailuna. PCRprimerit ja koetin olivat peräisin kloonin 81 HCV:n cdna:sta, kuten on kuvattu yllä. 30 Tulokset osoittivat, että HCV:n cdna:lle komplementaarisia amplifioituja sekvenssejä ei ollut havaittavissa infektoituneen simpanssin maksan DNA:oissa, eikä myöskään negatiivisissa vertailuissa. Vastakohtana tälle, kun näytteisiin, sisältäen infektoituneen simpanssin maksasta olevan DNA:n, lisättiin HCV:n cdna:ta ennen amplifikaatiota, 35 kloonin 81 sekvenssit havaittiin kaikissa positiivisissa kontrollinäytteissä. Lisäksi RNAtutkimuksissa amplifioitu kloonin 81 HCV:n cdna-sekvenssit havaittiin vain, kun. käänteistranskriptaasia käytettiin, mikä viittaa vahvasti siihen, että tulokset eivät johtu-

95 93 neet DNA-kontaminaatiosta. Nämä tulokset osoittavat, että NANBH:ta sairastavien simpanssien maksasolut eivät sisällä HCV:n DNA:ta tai sisältävät niitä havaitemattoman määrän. Perustuen lisäystutkimukseen, jos HCV:n cdna:ta on läsnä, sitä on tasolla, joka on paljon alle 0,06 kopio- 5 ta per maksasolu. Tälle vastakohtanasamoista maksanäytteistä peräisin olevan kokonais- RNA:n HCV-sekvenssit havaittiin helposti PCR-tekniikalla. IV I HCV-infektinn PT TRA-ngiNri.- vc käyttäen HCV c100-3.n kof-nntieppnitiä 10 Kaikki näytteet analysoitiin käyttäen HCV c 100-3:a ELISA-menetelmällä. Tämä analyysi käyttää HCV c100-3-antigeeniä (joka syntetisoitiin ja uhdistettiin, kuten on kuvattu osassa IV.B.5.) ja hiiren monoklonaalisen anti-ihmis-igg:n piparjuuriperoksidaasikonjugaattia (HRP). 15 Valmistettiin levyjä, jotka oli päällystetty HCV c100-3-antigeenillä seuraavasti. Valmistettiin liuos, joka sisälsi 21 ml/levy päällystyspuskuria (50mM Na-boraatti, ph 9,0), BSA:ta (25 µg/m1), c100-3:a (2,50 µg/m1) juuri ennen lisäämistä Removeawell Immulon I-levyille (Dynatech Corp.).Sen jälkeen kun sitä oli sekoitettu 5 minuuttia lisättiin 0,2 ml/kuoppa liuosta levyille, ne peitettiin ja niitä inkuboitiin 2 tuntia 37 C:ssa, minkä 20 jälkeen liuos poistettiin imemällä. Kuopat pestiin kerran 400 µlila Wash Bufferia (100 mm natriumfosfaattia. ph 7,4, 140 mm natriumkloridia, 0,1 % (w/v) kaseiinia, 1 % (w/v) Triton x-100:aa, 0,01 % (w/v) Thimerosal'ia). Pesuliuoksen poistamisen jälkeen lisättiin 200 µ1/kuoppa Postcoat-liuosta (10 mm natriumfosfaattia, ph 7,2, 150 mm natriumkloridia, 0,1 % (w/v) kaseiinia ja 2 mm fenyylimetyylisulfonyylifluoridia 25 (PMSF)), levyt peitettiin löysästi haihtumisen estämiseksi ja niiden annettiin olla huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Kuopat imettiin sitten liuoksen poistamiseksi ja ne lyofilisoitiin kuivaksi yön yli ilman lämmitystä. Valmistetut levyt voidaan varastoida 2-8 C:ssa saumatuissa alumiinipusseissa. 30 ELISA-määrityksen suorittamiseksi lisättiin 20 µi seeruminäytettä tai vertailunäytettä kuoppaan, joka sisälsi 200 µi näytteen laimenninta (100 mm natriumfosfaatti, ph 7,4, 500 mm natriumkloridi, 1 mm EDTA, 0,1 % (w/v) kaseiinia, 0,015 % (w/v) Therosol, 1 % (w/v) Triton X-100, 100 µg/m1 hiivauutetta). Levyt suljettiin ja niitä inkuboitiin 2 tuntia 37 C:ssa, minkä jälkeen liuos poistettiin imemällä ja kuopat pestiin 400 µlila 35 pesupuskuria (fosfaattipuskuroitu suola (PBS), joka sisälsi 0,05 % Tween 20:a). Pestyjä kuoppia käsiteltiin 200 µlila hiiren anti-ihmis IgG-HRP-konjugaattia, joka oli Ortho'n konjugaatinlaimenninliuoksessa (10 mm natriumfosfaatti, ph 7,2, 150 mm natriumklo-

96 94 ' ridi, 50 % (v/v) härän sikiöseerumia, 1 % (v/v) lämpökäsitelty hevosseerumi, 1 mm K3Fe(CN)6, 0,05 % (w/v) Tween 20, 0,02 % (w/v) Thimersal). Käsittelyä suoritettiin 1 tunti 37 C:ssa, liuos poistettiin imemällä ja kuopat pestiin pesupuskurilla, mikä myös poistettiin imemällä. Sidotun entsyymikonjugaatin määrittämiseksi lisättiin 200 gl sub- 5 straattiliuosta (10 mg 0-fenyleenidiamiinidihydrokloridia/ 5 ml Developer-liuosta). 10 Developer-liuos sisältää 50 mm natriumsitraattia säädettynä ph-arvoon 5,1 fosforihapolla ja 0,6 µ1/m1 30% vetyperoksidia. Substraattiliuoksen sisältäviä levyjä inkuboitiin pimeässä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, reaktiot pysäytettiin lisäämällä 50111/m1 4 N rikkihappoa ja OD:t määritettiin. Alla esitetyt esimerkit osoittavat, että mikrotiitterilevyseulonnalla ELISA-menetelmällä käyttäen HCV c100-3-antigeeniä on korkean luokan spesifisyys, minkä todistaa noin 1 %:n alkuperäinen reaktiivisuusnopeus, jolla on noin 0,5 %:n toistettava reaktiivisuusnopeus sattumanvaraisilla luovuttajilla. Analyysillä voidaan havaita immunovaste sekä 15 akuutin vaiheen ohittaneella infektiolle että taudin krooniselle vaiheelle. Lisäksi analyysi voi havaita joitakin näytteitä, jotka antavat negatiivisen tuloksen NANBH:n korvaavissa kokeissa; nämä näytteet tulevat yksilöistä, joilla on olut NANBH tai luovuttajilta, jotka ovat mukana NANBH:n siirtymisessä. 20 Allakuvatuissa esimerkeissä käytetään seuraavia lyhenteitä: ALT Anti-HBc Anti-HBsAg 25 HBc ABsAg IgG IgM IU/L 30 NA NT N Neg OD 35 Pos S/CO SD alaniiniaminotransferaasi HBc:n vastainen vasta-aine HBsAg:n vastainen vasta-aine hepatitis-b:n ydinantigeeni hepatitis-b:n pinta-antigeeni immunoglobuliini-g immunoglobuliini-m kansainvälisiä yksiköitä/1 ei saatavissa ei tutkittu näytteen koko negatiivinen optinen tiheys positiivinen signaali/sulku standardipoikkeama

97 x WNL keskimääräinen tai keskiarvo normaalien rajojen sisällä 5 IV I 1 T-ICV-infektio cattnninnvaraigten verenlnovnttnjien jonlence.,1 Saatiin 1056:n näytteen ryhmä (tuoretta seerumia) sattumanvaraisista verenluovuttajista Irwin Memorial Blood Bankstä San Francisco, California. Koetulokset, jotka on saatu näistä näytteistä on esitetty histogrammissa, mikä esittää optisen tiheyden arvojen jakaantuman (kuvio 43). Kuten nähdään kuviosta 43, 4 näytettä on arvoltaan > 3, yksi 10 näyte on välillä 1 ja 3, 5 näytettä on välillä 0,4 ja 1 ja loput 1046 näytettä ovat alle 0,4, joista näytteistä yli 90 % on arvoltaan alle 0,1. Reaktiivisten sattumanvaraisten näytteiden tulokset on esitetty taulukossa 5. Käyttäen sulkuarvona keskimääräistä arvoa plus miinus 5 standardipoikkeamaa, 10 näytettä :sta (0,95%) oli alunperin reaktiivisia. Näistä viisi näytettä (0,47%) olivat toistuvasti reaktiivisia, kun ne analysoitiin toiseen kertaan käyttäen ELISA-menetelmää. Taulukko 5 esittää myös ALT- ja anti-hbd-tilanteen kullekin toistuvasti reaktiiviselle näyt- 20 teelle. Erityisen mielenkiintoinen on se tosiasia, että kaikki viisi toistuvasti reaktiivista näytettä olivat negatiivisia molemmilla korvaavilla kokeilla tutkittaessa NANBH:n varalle, kun taas ne olivat positiivisia HCV:n ELISA-kokeessa. Taulukko 5 Reaktiivisten sattumanvaraisten n.nytteiclen tulokset 25 N=1051 x=0,049* SD=±0,074 Cut-off: x + 5SD = 0,419 (0,400 + negatiivinen vertailu) 30 Näyte Alkuper. Uusintareaktiiv. reaktiiv. opt.tih. opt.tih. ALT** (IU/1) Anti-HBc*** (opt.tih.) ,462 0,084 NA NA ,569 ' 0,294 NA NA ,699 0,326 NA NA ,735 0,187 NA NA ,883 0,152 NA NA ,567 1,392 30,14 1, >3,000 >3,000 46,48 1, >3,000 >3,000 48,53 1, >3,000 >3,000 60,53 1,165

98 >3,000 3,000 WNL**** Neg. 10/1056 = 0,95 % 5/1056 = 0,47 % * arvoltaan >1,5 tuloksia ei otettu mukaan laskettaessa keskiarvoja ja standardipoikkeamia 5 ** ALT z 68 IU/1 on normaaliarvojen yläpuolella *** anti-hbc < 0,535 (kilpaileva analyysi) pidetään positiivisena **** WNL: normaalirajojen sisällä. 10 IV.I.2. Simpancqirt ceprilminaytteet Yhdestätoista simpanssista peräisin olevat seeruminäytteet testattiin HCV c ELISA-menetelmällä. Neljällä näistä simpansseista oli NANBH-infektio kontaminoituneesta tekijä VIII-erästä (oletettavasti Hutchinson-kanta), mitä seurasi yhdessä tri Daniel Bradleyn kanssa luotu toimintamalli Centers for Disease Control'ssa. Vertailuna 15 tartutettiin neljä muuta simpanssia HAV:lla ja kolme HBV:llä. Seeruminäytteet saatiin eri aikoina infektion jälkeen. Tulokset, jotka on esitetty taulukossa 6, esittävät dokumentoidun vasta-aineen serokonversion kaikissa Hutchinson-kantaa olevilla NANBH:lla infektoiduilla simpansseilla. 20 Akuutin infektiovaiheen jälkeen (mitä todisti ALT-tason merkittävä nousu ja sen jälkeinen palaaminen normaaliksi) voitiin havaita vasta-aineita HCV c :a vastaan kaikkien neljän NANBH-infektoidun simpanssin seerumissa. Näiden näytteiden oli aikaisemmin osoitettu, kuten on keskusteltu osassa IV.B.3., olevan positiivisia Westernanalyysillä ja RIA:lla. Tälle vastakohtana mikään vertailusimpansseista, jotka oli infek- 25 toitu HAV:lla tai HBV:llä, ei osoittanut todisteita reaktiivisuudesta ELISA-analyysissä. Taulukko 6 Simpanssin seeruminäytteet Opt. S/CO Istut. pv Näytepv ALT IU/1 Virus Neg. vert 0, Pos. vert. 1,504 Cutoff 0,401 Simp 1-0,007 0, NANB 0,003 0, >3,000 >7, >3,000 >7, Simp NANB

99 ,003-0,005 0,945 >3,000 0,00 0,00 2,36 >7, Simp 3 0,005 0, NANB 0,017 0, ,006 0, ,010 2, Simp 4-0,006 0, NANB 0,003 0, ,523 1, ,574 3, Simp 5-0,006 0, HAV 0,001 0, ,003 0, ,006 0, Simp HAV -0,005 0, ,001 0, Opt. S/CO Istut. Näyte- ALT Virus pv pv IU/1-0,004 0, ,290 0, Simp 7-0,008 0, HAV -0,004 0, ,006 0, ,005 0, Simp 8-0,007 0, HAV 0,000 0, ,004 0, ,000 0, ,5 40 Simp HBV 0,019 0, ,015 0, ,008 0, Simp HBV 0,011 0, ,015 0, ,008 0, ,010 0, Simp HBV 0,000 0, ,003 0,

100 98-0,003 0, ,003 0, Levy._t_ihmisistä_peräisin_okma_NANaluantajan todictptligti infpktnitu cnenn- 5 Mi Koodattu levy käsitti 22 erillistä näytettä, kukin niistä kahtena niin, että näytteitä oli 44 yhteensä. Näytteet olivat peräisin todistetusti infektoituneesta seerumista kroonisista NANBH-kantajista, infektoituneesta seerumista todetuista verenluovuttajista ja infektoi- 10 tuneesta seerumista akuutin vaiheen NANBH-potilaista. Lisäksi näytteitä oli varmoista 15 negatiivisista vertailuista ja muista sairausvertailuista. Levyn toimitti tri H. Alter, Department of Health and Human services, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. Levyn on suunnitellut tri Alter useita vuosia sitten ja sitä on käyttänyt tri Alter oletettujen NANBH-analyysien osoituslevynä. Koko levy analysoitiin kahdesti ELISA-analyysillä ja tulokset lähetettiin tri Alterille arvioitavaksi. Arvioinnin tulokset on esitetty taulukossa 7. Vaikka taulukko antaakin tulokset vain toiselle kaksoisnäytteistä, samat arvot saatiin kussakin kaksoisnäytteessä. 20 Kuten on esitetty taulukossa 7, kuusi seerumia, jotka oli todettu infektoituneiksi simpanssimallissa, oli voimakkaasti positiivisia. Seitsemäs infektoitunut seerumi vastasi akuutin NANBH-tapauksen näytettä, eikä se ollut reaktiivinen tässä ELISAanalyysissä.Todetusta verenluovuttajasta oleva näyte, jonka ALT-arvo oli normaali ja jonka simpanssitutkimuksessa saatu tulos oli epävarma, ei ollut reaktiivinen analyysissä. 25 Kolme muuta sarjanäytettä yhdestä yksilöstä, jolla oli akuutti NANBH, eivät myöskään olleet reaktiivisia. Kaikki näytteet, jotka tulivat varmoista negatiivisista vertailuista ja jotka oli saatu verenluovuttajilta, joilla oli ainakin 10 veren luovutusta ilman todettua hepatitista, eivät olleet reaktiivisia ELISA:ssa. Lopulta neljä näytteistä, jotka oli tutkittu aikaisemmin, oli arvioitu positiivisiksi oletetuissa NANBH-analyyseissä muiden toi- 30 mesta, muttei näitä analyysejä voitu varmistaa. Nämä näytteet arvioitiin negatiivisiksi HCV ELISA:lla. 35 J evy Taulukko 7 RAT TFR'in levy I. 1 tulos 2 tulos 1) todettu inf. simpanssimallilla A. Kroon. NANB:Post-Tx

101 99 JF EB PG B. Todettu luov. kohonn.alt 5 BC JJ BB C. Akuutti NANB: Post-Tx WH 10 2) Epäselv. infekt. simpanssimallilla A. Todettu luov. normaali ALT CC 3) Akuutti NANB: Post-Tx JL viikko I 15 JL viikko 2 JL viikko 3 4) Sairausvertailut A. Primäärinen sappikirroosi EK 20 B. Toipumassa oleva alkoholihepatitis HB 5) Varmat neg. vertailut DM DC 25 LV ML AH 6) Potent. NANB-"antigeenejä" JS-80-01T-0 (Ishida) 30 Asterix (Trepo) Zurtz (Arnold) Becassdine (Trepo) - 35 IV.I.4. pyy? T uninittaja/vastaanottojr Koodattu levy käsitti kymmenen epäselvää verensiirron luovuttaja-vastaanottajatapausta, joihin liittyi NANBH, kaikkiaan 188 näytettä. Kukin tapaus käsitti näytteitä joiltakin tai kaikilta vastaanottajan luovuttajilta ja sarjanäytteitä (otettu 3, 6 ja 12 kuukautta verensiirron jälkeen) vastaanottajasta. Sisällytettynä oli myös verinäyte, joka 40 oli otettu vastaanottajasta ennen verensiirtoa. Koodatun levyn toimitti tri H.Alter NIH:stä ja tulokset lähetettiin hänelle arvioitavaksi. 9 1 Tulokset, jotka on annettu taulukossa 8, osoittavat, että ELISA havaitsi vasta-aineen serokonversion yhdeksässä kymmenestä NANBH:hon liittyvästä verensiirtotapauksesta.

102 100 Tapauksesta 4 oleva näyte (jossa ei havaittu serokonversiota) yhtäpitävästi reagoi huonosti ELISA:ssa. Kaksi kymmenestä vastaanottajanäytteestä oli reaktiivista kolme kuukautta verensiirron jälkeen. Kuusi kuukautta verensiirron jälkeen kahdeksan vastaanottajanäytettä oli reaktiivisia; ja 12 kuukautta jälkeen olivat kaikki näytteet reaktiivisia lu- 5 kuunottamatta tapausta 4. Lisäksi ainakin yksi vasta-ainepositiivinen luovuttaja huomattiin 7:ssä kymmenestä tapauksesta, jolloin tapaukselta 10 oli kaksi positiivista luovuttajaa. Tapauksessa 10 myös vastaanottajan ennen verenluovutusta otettu näyte oli positiivinen HCV-vasta-aineille. Tästä vastaanottajasta otettu yhden kuukauden näyte putosi reaktiivisuuden rajatasolle, kun taas se kohosi positiiviseksi neljän ja kymmenen kuu- 10 kauden näytteissä. Yleisesti suhdetta S/CO, joka on 0,4 pidetään positiivisena. Täten tämä tapaus voi edustaa yksilön aikaisempaa HCV-infektiota. ALT- ja HBc-status kaikille reaktiivisille, s.o. positiivisille näytteille on esitetty taulukossa 9. Kuten taulukosta nähdään, 1/8 luovuttajanäytteistä oli negatiivinen korvaavilla 15 markkereilla ja reaktiivinen HCV-vasta-aine-ELISA:ssa. Toisaalta vastaanottajanäytteet (joita seurattiin 12 kuukautta verensiirron jälkeen) olivat ALT-arvoltaan kohonneita. anti-hbc :n suhteen positiivisia tai molempia.

103 101 Tmilvleko R 5 1 unvnilaja/v&stnanottaja - NANB-1evy Alterin lunvuttaiq/vactaanottaii0 - NANB-levy 10 Tapaus Luovuttaja Vast.ott. Opt.tih. S/CO näyte ennen verens. Opt.tih. S/CO 1. 0,032 0, ,059 0, ,403 0,94 0,049 0, ,065 0,15 5. >3,000 >6, 96 0,034 0,08 6. >3, 000 >6, 96 0,056 0, >3, 000 >6, 96 0,034 0,08 8. >3,000 >6,96 0,061 0,14 9. >3,000 >6, 96 0,080 0, >3,000 >6,96 >3,000 >6, 96 >3, 000 >6,96 25 Tapaus Verens. jälkeen 3 kk 6 kk 12 kk OT S/CO OT S/CO OT S/CO ,112 0,26 >3,000 >6, 96 >3,000 >6, ,050 0,12 1,681 3,90 >3,000 >6, ,057 0,13 >3,000 >6,96 >3,000 >6, ,073 0,17 0,067 0,16 0,217 0, ,096 0,22 >3,000 >6, 96 >3,000 >6, ,475 3,44 >3,000 >6, 96 >3,000 >6, ,056 0,13 >3,000 >6, 96 >3,000 >6, ,078 0,18 2,262 5,28 >3,000 >6, ,127 0,30 0,055 0,13 >3,000 >6, ,317* 0,74 >3,000** >6,96 >3,000*** >6,96 * 1 kk, ** 4 kk, *** 10 kk. OT = optinen tiheys

104 102 Taulukko 9 5 Af T- jai-11:1,r-qtaruc reaktiivicille näytteille H Alterin levyqcä 1 Näytteet Anti-ALT* HBc** 10 Luovuttajat tapaus 3 normaali neg. tapaus 5 kohonnut pos. tapaus 6 kohonnut pos. 15 tapaus 7 ei saatavilla neg. tapaus 8 normaali pos. tapaus 9 kohonnut ei saatav. tapaus 10 normaali pos. tapaus 10 normaali pos. 20 Vastaanottajat tapaus 1 6 kk kohonnut pos. 12 kk kohonnut ei tutk. 25 tapaus 2 6 kk kohonnut neg. tapaus 3 12 kk kohonnut ei tutk. 6 kk normaali ei tutk*** 12 kk kohonnut ei tutk*** tapaus 5 6 kk kohonnut ei tutk kk kohonnut ei tutk. tapaus 6 3 kk kohonnut neg. 6 kk kohonnut neg. 12 kk kohonnut ei tutk. tapaus 7 6 kk kohonnut neg kk kohonnut neg. tapaus 8 6 kk normaali pos. 12 kk kohonnut ei tutk. tapaus 9 12 kk kohonnut ei tutk. tapaus 10 4 kk kohonnut ei tutk kk kohonnut ei tutk. 45 * ALT > 45 IU/1 on normaalirajojen yläpuolella ** Anti-HBc < 50 % (kilpaileva analyysi) pidetään positiivisena *** ennen verensiirtoa otettu näyte ja 3 kk:n näyte olivat negatiivisia HBc:lle. IV I 5 HCV-infektion määrittäminen suuren riskin ryhmän näytteistä Näytteitä suuren riskin ryhmistä tarkkailtiin käyttäen ELISA:aa reaktiivisuuden mäkittämiseksihcv c100-3-antigeenille. Nämä näytteet saatiin tri Gary Tegtmeieriltä, Com- 50 munity Blood Bank, Kansas City. Tulokset on esitetty taulukossa 10.

105 Kuten taulukosta nähdään, saatiin näytteet, joiden reaktiivisuus oli korkein verenvuototautia sairastavilta (76 %). Lisäksi näytteet yksilöistä, joiden ALT oli koholla ja jotka olivat positiivisia anti-hbc:lle, arvioitiin 51 % reaktiivisiksi, arvo mikä on yhtäpitävä sen arvon kanssa, joka arvioidaan kliinisestä tiedosta ja NANBH:n levinneisyydestä 5 tässä ryhmässä. HCV:n vastaisen vasta-aineen esiintyminen oli myös yleisempää verenluovuttajissa, joilla oli vain kohonnut ALT, verenluovuttajilla, jotka olivat positiivisia vain hepatitis-b-kuoren vasta-aineiden suhteen ja verenluovuttajissa, jotka oli hylätty muista syistä kuin korkean ALT-arvon tai anti-kuori-vasta-aineen takia verrattuna sattumanvaraisiin vapaaehtoisiin luovuttajiin. TAniiiickn NANBH:n suhteen suuren riskin ryhmän näytteet Ryhmä N Jakaantuma N OT % reakt. 20 Kohonnut ALT 35 3 >3,000 11,4 1 0,728 Anti-HBc 24 5 >3,000 20,8 Koh. ALT, Anti-HBc >3,000 51, , , , , , Hylätyt luovuttajat 25 5 >3,000 20,0 Luov. hepatitis aikais >3,000 14,7 1 0, , , Verenvuototautiset >3,000 76,0 1 2, , , , , , , IV.I.6. vertaiipturkimukspt käyttäen A nti_igg_ tai Anti-IgN-monnkInnn2iisin vastatyyqisq ELISA-määrityksen herkkyyttä käyttäen anti-igg-monoklonaalista konjugaattia verrat-

106 109 tiin siihen, mikä saatiin käyttäen joko anti-igm-monoklonaalista konjugaattia tai korvaamalla molemmat polyklonaalisella antiseerumilla, jonka on ilmoitettu olevan spesifinen sekä raskaalle että kevyelle ketjulle. uoritettiin seuraavat tutkimukset. 5 IV 16 a SaTigniiyfreet qprokonvertnijictn Sarjanäytteitä kolmesta tapauksesta, jotka olivat NANB-serokonvertoijia, tutkittiin HCV c100-3-elisa-analyysillä käyttäen entsyymikonjugaatissa joko anti-iggmonoldonaalista yksin tai yhdistelmänä anti-igm-monoklonaalisen kanssa tai käyttäen 10 polyklonaalista antiseerumia. Näytteet toimitti tri Cladd Stevens, N.Y. Blood Center, N.Y.C., N.Y.. Näytehistoria on esitetty taulukossa 11. Tulokset, jotka saatiin käyttäen anti-igg-monoklonaalista vasta-aineentsyymikonjugaattia, on esitetty taulukossa 12. Tiedot osoittavat, että voimakas reak- 15 tiivisuus havaitaan alunperin näytteissä 1-4, 2-8 ja 3-5 vastaavasti tapauksista 1, 2 ja 3. Tulokset, jotka saatiin käyttäen anti-igg-monoklonaalista konjugaattia yhdessä anti- IgM-konjugaatin kanssa, on esitetty taulukossa 13. Kolme erilaista anti-igg:n ja anti- IgM:n suhdetta tutkittiin, anti-igg:n laimennos 1:10000 oli vakio koko 20 ajan.laimennokset, jotka tutkittiin anti-igm-monoklonaaliselle konjugaatille olivat 1:30000, 1:60000 ja 1: Tiedot osoittavat, että yhtäpitävästi yksin anti-igg:ilä saatujen tulosten kanssa, alkuperäinen voimakas reaktiivisuus havaittiin näytteissä 1-4, 2-8 ja Tulokset, jotka saatiin ELISA:lla käyttäen anti-igg-monoklonaalista konjugaattia (1:10000 laimennos) tai Tago-polyklonaalista konjugaattia (1:80000 laimennos) tai Jackson-polyklonaalista konjugaattia (1:80000 laimennos), on esitetty taulukossa 14. Tiedot merkitsevät, että alkuperäinen voimaks reaktiivisuus havaitaan näytteissä 1-4, 2-8 ja 3-5 käyttäen kaikkia kolmea järjestelmää; Tago-polyklonaaliset vasta-aineet antoi- 30 vat alhaisimmat signaalit. ;. Yllä esitetyt tulokset osoittavat, että kaikki kolme järjestelmää havaitsevat reaktiiviset näytteet samalla tavalla taudin akuutin vaiheen jälkeen (minkä todistaa ALT:n nousu). Lisäksi tulokset merkitsevät, että HCV c100-3-elisa:n herkkyys käyttäen anti-igg- 35 monoklonaalista entsyymikonjugaattia on yhtä hyvä tai parempi kuin muiden tutkittujen entsyymikonjugaattien järjestelmien herkkyydet.

107 Taulukko 11 rinriri Stevensin levyn ntlytteirien hivans 5 pvm HBsAg Anti- Anti- HBs HBc ALT Bili - rubin Tapaus ,0 91,7 12,9 40,0-1, ,0 121,0 15,1 274,0 1, ,0 64,0 23,8 261,0 0, ,0 67,3 33,8 75,0 0, ,0 50,5 27,6 71,0 1,0 Tapaus ,0 1,0 116,2 17,0-1, ,0 0,8 89,5 46,0 1, ,0 1,2 78,3 63,0 1, ,0 0, ,0 1, ,0 0,8 93,6 624,0 1, ,0 0,8 92,9 66,0 1, ,0 0,8 86,7 70,0 1, ,0 0,9 69,8 24,0-1, ,0 0,9 67,1 53,0 1, ,0 0,5 74,8 95,0 1, ,0 0,8 82,9 37,0-1,0 Tapaus ,0 1,2 88,4 13,0-1, ,0 1,1 126,2 236,0 0, ,0 0,7 99,9 471,0 0, ,0 1,2 110,8 315,0 0, ,0 1,1 89,9 273,0 0, ,0 1,0 118,2 158,0 0, ,0 1,0 112,3 84,0 0, ,0 0,9 102,5 180,0 0, ,0 1,0 84,6 154,0 0,3 45

108 106 Taulukko 12 5 FT ISA-111InkcP, intica or c.49atu leyttäejlanti~donalistakaniugaattia Näyte Pvm ALT Opt.tih. S/CO 10 Neg. vertailu 0,076 Cutoff 0,476 PC (1:128) 1, Tapaus ,0 0,178 0, ,0 0,154 0, ,0 0,129 0, ,0 0,937 1, ,0 >3,000 >6, 30 Tapaus ,0 0,058 0, ,0 0,050 0, ,0 0,047 0, ,0 0,059 0, ,0 0,070 0, ,0 0,051 0, ,0 0,139 0, ,0 1,867 3, ,0 >3,000 >6, ,0 >3,000 >6, ,0 >3,000 >6, 30 Tapaus ,0 0,090 0, ,0 0,064 0, ,0 0,079 0, ,0 0,211 0, ,0 1,707 3, ,0 >3,000 >6, ,0 >3,000 >6, ,0 >3,000 >6, ,0 >3,000 >6, 30

109 Taulukko 13 ELISA=tulokset,ioficamsaatu 5 gaania NANB ELISA:t rink1(1~1 qta knpjli- Monokl. Monokl. Monokl. IgG* IgG* IgG* 10 IgM** IgM*** IgM**** Näyte Pvm ALT OT S/CO OT S/CO OT S/CO Neg. vertailu Cutoff 0,100 0,080 0, PC (1:128) 1,083 1,328 1,197 Tapaus ,0 0,173 0,162 0, ,0 0,194 0,141 0, ,0 0,162 0,129 0, ,0 0,812 0,85 0, ,0 >3,000 >3,000 >3, Tapaus ,0 0,442 0,045 0, ,0 0,102 0,029 0, ,0 0,059 0,036 0, ,0 0,065 0,041 0, ,0 0,082 0,033 0, ,0 0,102 0,042 0, ,0 0,188 0,068 0, ,0 1,728 1,668 1, ,0 >3,000 2,443 >3, ,0 >3,000 >3,000 >3, ,0 >3,000 >3,000 >3,000 Tapaus ,0 0,193 0,076 0, ,0 0,201 0,051 0, ,0 0,132 0,067 0, ,0 0,175 0,155 0, ,0 1,335 1,238 1, ,0 >3,00 >3,00 >3, ,0 >3,00 >3,00 >3, ,0 >3,00 >3,00 >3, ,0 >3,00 >3,00 >3, OT = optinen tiheys * = laimennos 1:10000, ** = laimennos 1:30000, *** = laimennos 1:60000, **** = laimennos 1:120000

110 TsmInlekn 14 FT TRA-tulnimet, jntlea nn qfintn kfiyttnpn pnlykinnnalicia knnjnpattpja 5 NANR FT.TRA Monokl. Tago Jackson 1: : : Näyte Pvm ALT OT S/CO OT S/CO OT S/CO Neg. vertailu 0,076 0,154 0,045 Cutoff 0,476 0,545 0, PC (1:128) 1,390 0, Tapaus ,178 0,37 0,067 0,12 0,153 0, ,154 0,32 0,097 0,18 0,225 0, ,129 0,27 0,026 0,05 0,167 0, ,937 1,97 0,324 0,60 0,793 1, >3, 00 >6, 30 1,778 3,27 >3,00 >4,59 25 Tapaus ,058 0,12 0,023 0,04 0,052 0, ,050 0,11 0,018 0,03 0,058 0, ,047 0,10 0,020 0,04 0,060 0, ,059 0,12 0,025 0,05 0,054 0, ,070 0,15 0,026 0,05 0,074 0, ,051 0,11 0,018 0,03 0,058 0, ,139 0,29 0,037 0,07 0,146 0, ,867 3,92 0,355 0,65 1,429 2, >3, 00 >6, 30 0,748 1,37 >3, 00 >4, >3, 00 >6, ,88 >3,00 >4, >3,00 >6,30 0,917 1,68 >3,00 >4,59 Tapaus ,090 0,19 0,049 0,09 0,138 0, ,064 0,13 0,040 0,07 0,094 0, ,079 0,17 0,045 0,08 0,144 0, ,211 0,44 0,085 0,16 0,275 0, ,707 3,59 0,272 0,50 1,773 2, >3,00 >6,30 1,347 2,47 >3,00 >4, >3,00 >6, ,21 >3,00 >4, >3,00 >6,30 >3,00 >5,50 >3,00 >4, >3,00 >6,30 >3,00 >5,50 >3,00 >4,59 50

111 IV 16 b Näytteet sattumanvaraiqictn verenhialnittaji sta Näytteitä sattumanvaraisista verenluovuttajista (ks. osa IV.I.1.) seulottiin HCVinfektion suhteen käyttäen c100-3-elisa:aa, jossa vasta-aine-entsyymikonjugaatti oli 5 joko anti-igg-monoklonalinen konjugaatti tai polyldonaalinen konjugaatti. Seulottujen näytteiden kokonaismäärä oli 1077 polyklonaalisilla konjugaateilla ja vastaavasti 1056 monoklonaalisilla konjugaateilla. Seulonnan tulokset on esitetty taulukossa 15 ja näytteiden jakaantuma on esitetty kuvion 44 histogrammissa. /0 Keskimääräisen ja standardipoikkeaman laskeminen suoritettiin sulkemalla pois näytteet, jotka antoivat yli 1,5 olevan signaalin, s.o optisen tiheyden arvoa käytettiin laskemisia varten käyttäen polyklonaalista konjugaattia ja 1051 käytettäessä anti-iggmonoklonaalista konjugaattia. Kuten nähdään taulukosta 15, kun käytettiin polyklonaalista konjugaattia, nousi keskiarvo 0,0493:sta 0,0931:een ja satndardipoikkeama 15 lisääntyi 0,074:stä 0,0933:een. Lisäksi tulokset osoittavat myös, että x + SSD:n kriteeriä käytetään määrittämään analyysin cutoffia, polyklonaalisen konjugaatin järjestelmä vaatii ELISA:ssa korkeamman cutoff-arvon. Tämä merkitsee alentunutta analyysispesifisyyttä verrattuna monoklonaaliseen järjestelmään. Lisäksi, kuten on kuvattu kuvion 44 histogrammissa, suurempi tulosten erottuminen negatiivisten ja positiivisten jakaantu- 20 misien välillä tapahtuu, kun sattumanvaraisia verenluovuttajia seulotaan ELISA:lla käyttäen anti-igg-monoldonaalista konjugaattia verrattuna analyysiin, joka käyttää kaupallista polyklonaalista leimaa. Taulukko Kahden FT TSA-järjecteltnÄn vertailu tntkittaecsa sattumanynraistpn vererduovuttajien n ytteitä Konjuciaatti Polyklonaalinen Anti-IgG:n monoklon. Näytteiden lkm (Jackson) Keskiarvo (x) 0,0931 0,04926 Standardipoikk. 0,0933 0, SD 0,4666 0,3714 Cutoff (5 SD+x) 0,5596 0,4206 IV.J. TirV-cerolconvergiOn havitsemine ntilaissa_exi_maantieteellisissä_pal kaissa

112 110 Seerumia potilaista, joiden epäiltiin sairastavan NANBH:a perustuen kohonneisiin ALT-tasoihin ja jotka olivat negatiivisia HAV- ja HBV-testeissä, seulottiin käyttäen RIA:aa olennaisesti, kuten on kuvattu osassa IV.D., paitsi että HCV c100-3-antigeeniä 5 käytettiin seulonta-antigeeninä milcrotiitterilevyillä. Kuten nähdään taulukossa 16 esitetyistä tuloksista, RIA:n avulla havaittiin positiivisia näytteitä suuressa tapausten prosenttimäärässä. Taillukkn anti-r 1 no-1 -a p joukossa käyttäen Maa Hollanti Italia Japani Tutk.lkm Positiivisia Posit. % IV K HCV-serokonverqion. hnvnitspminpn potilaista, joilla nn "yhteisrihankittu" NANR14 20 Seerumia joka saatiin 100 potilaasta, joilla oli NANBH, ja joille ei ollut ilmeistä siirtymistietä (s.o. ei verensiirtoja, suonensisäistä lääkkeen käyttöä, vapaita sukupuolisuhteita jne. joita kysyttiin riskitekijöinä) toimitti tri M. Alter Center for Disease Controlista ja tri J. Dienstag Harvardin yliopistosta. Nämä näytteet seulottiin käyttäen RIA:aa olennai- 25 sesti, kuten on kuvattu osassa IV.D., paitsi että HCV c100-3-antigeeniä käytettiin seulonta-antigeeninä kiinnitettynä mikrotiitterilevyille. Tulokset osoittivat, että 100 seruminäytteestä 55 sisälsi vasta-aineita, jotka reagoivat immunologisesti HCV c100-3-antigeenin kanssa. 30 Ylläkuvatut tulokset ehdottavat, että "yhteisöhankittu" NANBH aiheutuu myös HCV:stä. Lisäksi, koska tässä on todistettu, että HCV on Flaviviruksien sukua, joista useimmat siirtyvät niveljalkaisten välityksellä, herättää tämä ajatuksen, että HCV:n siirtyminen "yhteisöhankituissa" tapauksissa on myös tulosta siirtymisestä niveljalkaisten välityksellä. 35

113 IV L 1-TCV-vaqta-ainpirlen ja korvaavien ruarkk-reiden eqiintytrken vertailu Inetvlittajicca, jotka liittyvät NANRT- n qiirtymiceest Tulevaisuutta kartoittava tutkimus suoritettiin sen määrittämiseksi, serokonvertoituvat- 5 ko sellaiset veren vastaanottajat, jotka saavat verta epäillyistä NANBH-positiivisista luovuttajista, jotka kehittivät NANBH:n, anti-hcv-vasta-ainepositiivisiksi. Verenluovuttajat tutkittiin korvaavien markkereiden epänormaalisuuksien suhteen, joita markkereita käytetään nykyään NANBH-infektion markkereina, s.o. kohonneet ALTtasot ja antikuori-vasta-aneiden läsnäolo. Lisäksi luovuttajat tutkittiin myös anti-hcv- 10 vasta-aineiden läsnäolon varalta. Anti-HCV-vasta-aineiden läsnäolon määrittäminen tehtiin käyttäen radioimmtmologista analyysiä, kuten on kuvattu osassa N.K. Tutkimuksen tulokset on esitetty taulukossa 17, mikä esittää: potilaiden lukumäärän (palsta 1); anti-hcv-vasta-aineiden läsnäolon potilasseerumissa (palsta 2); potilaan saamien luovutusten lukumäärän, kunkin luovutuksen ollessa eri luovuttajalta (palsta 3); anti- 15 HCV-vasta-aineiden läsnäolon iuovuttajan seerumissa (palsta 4); ja luovuttajan korvaavan epänormaalisuuden (palsta 5) (NT tai merkitsee, ettei sitä ole tutkittu) (ALT on kohonnut transaminaasi ja anti-hbc on antikuori vasta-aine). Taulukon 17 tulokset osoittavat, että HCV-vasta-ainekoe on tarkempi havaitsemaan 20 infektoituneita verenluovuttajia kuin korvaavat markkerikokeet. Yhdeksän kymmenestä potilaasta, jotka kehittivät NANBH-oireita havaittiin positiivisiksianti-hcv-vastaaineiden serokonversion suhteen. Yhdestätoista epäillystä luovuttajasta (potilas 6 sai luovutuksia kahdelta eri yksilöitä, joiden epäiltiin olevan NANBH-kantajia) yhdeksän oli positiivista anti-hcv-vasta-aineiden suhteen ja yksi oli rajatapaus positiivisena ja 25 sen takia epävarma (potilaan 1 luovuttaja). Tälle vastakohtana, käyttäen kohonnutta ALT-koetta, kuusi kymmenestä luovuttajasta oli negatiivista ja käyttäen antikuori-vastaainekoetta, viisi kymmenest luovuttajasta oli negatiivista. Suuremmasta merkityksestä on kuitenkin kolmessa tapauksessa (potilaiden 8, 9 ja 10 luovuttajat), että ALT-koe ja anti-1-1bc-koe antoivat tuloksena ristiriitaisia tuloksia. Taulukko 17 Anti-HCV-vasta-aineiden kehittyminen potilaissa, jotka saivat verta luovuttajilta, joiden epäiltiin olevan NANBH-kantajia

114 112 5 Potilas Anti-HCVserokonv. potilaassa Luovut./ Luovutt. lkm Anti-HCVpositiiv. luovutt. Korvaava epänorm. ALT Anti-HB 1 kyllä 18 epäselvä ei ei 2 kyllä 18 kyllä NT kyllä 3 kyllä 13 kyllä ei ei. 4 ei 18 ei 10 5 kyllä 16 kyllä kyllä kyllä 6 kyllä 11 kyllä (*) ei kyllä 7 kyllä 15 kyllä NT ei 8 kyllä 20 kyllä ei kyllä 15 9 kyllä 5 kyllä kyllä ei 10 kyllä 15 kyllä ei kyllä ei kyllä * sama luovuttaja kuin anti-nanbh-positiivinen IV.M AnwlifiknAtio HCV ri cdna-sekvensqipp Icloonamiseksi käyttäen PC`g ää j3 20 primereitä, jotka ovat peräisin Flavivirukqen genorniqekven,siprk oilyneist n111p1 sta Yllä esitetyt tulokset, jotka ehdottavat, että Hcv on flavivirus tai flavityyppinen virus.. sallii strategian karalcterisoimattomien HCV:n cdna-sekvenssien kloonaamiseksi käyttäen PCR-tekniikkaa ja primereita, jotka ovat peräisin niiltä alueilta, jotka kodaavat säi- 25 Jyviä aminohapposekvenssejä flaviviruksissa. Yleisesti yksi primereista on johdettu määritellystä HCV:n genomisekvenssistä ja toinen primeri, joka on sekventoimattoman HCV-polynukleotidin alueen vieressä, on peräisin flavivirusgenomin säilyvästä alueesta. Flaviviruksien genomien tiedetään sisältävän säilyviä sekvenssejä NS1- ja E- polypeptideissä, jotka ovat koodattuja flaviviruksen genomin 5'-alueella. Vastaavat näi- 30 tä alueita koodaavat sekvenssit ovat kuviossa 26 esitetyistä HCV:n cdna-sekvensseistä 35 ylävirtaan päin. Täten tältä HCV:n genomin alueelta peräisin olevien sekvenssien eristämiseksi suunnitellaan ylävirran puolen primereita, jotka ovat peräisin näiden flaviviruspolypeptidien säilyvistä sekvensseistä. Alavirran puolen primerit ovat peräisin HCV:n cdna:n tunnetun osan ylävirran puolen päästä. Koodin degeneroitumisen takia on luultavaa, että flaviviruskoettimien ja vastaavan HCV-genomin sekvenssin välillä on sopimattomia alueita. Siksi käytetään strategiaa, joka samanlainen kuin se, minkä on kuvannut Lee (1988). Leen menettelytapa käyttää sekaoligonukleotidiprimereita, jotka ovat komplementaarisia aminohapposekvenssin 40 käänteistranslaatiotuotteille; sekaprimereiden sekvenssit ottavat huomioon jokaisen kodonin degeneraation säilyvää aminohapposekvenssiä varten. On luotu kolme sarjaa primeriseoksia, jotka perustuvat useissa flaviviruksissa havaittui-

115 hin aminohappohomologioihin, mukaanlukien Dengue-2,4 (D-2,4), japanilaisen enkefaliittiviruksen (JEV), keltakuumeen (YF) ja Länsi-Niilin viruksen (WN). Useimmista ylävirran säilyvistä sekvensseistä (5'-1) peräisin oleva primeriseos perustuu aminohapposekvenssiin gly-trp-gly, mikä on osa säilyvästä sekvenssistä asp-arg-gly-trp-gly-aspn. 5 joka on löydetty D-2:n, JEV:n, YF:n ja WN:n E-proteiinista. Seuraava primeriseos (5'- 2) perustuu alavirran säilyvään sekvenssiin E-proteiinissa, phe-asp--gly-asp-ser-tyr-ileuphe-gly-asp-ser-tyr-ileu ja se on peräisin phe-gly-asp:sta; säilyvä sekvenssi on läsnä D- 2:ssa, JEV:ssä, YF:ssä ja WN:ssä. Kolmas primeriseos perustuu aminohapposekvenssiin arg-ser-cys, joka on osa säilyvää sekvenssiä cys-cys-arg-ser-cys D-2:n, D-4:n, JEV:n. 10 YF:n ja WN:n NS1-proteiinissa. Yksittäiset primerit, jotka muodostavat seoksen 5'- 3:ssa on esitetty kuviossa 45. Säilyvästä alueesta peräisin olevien eri sekvenssien lisäksi kukin primeri kussakin seoksessa sisältää myös vakioalueen 5'-päässä, joka sisältää sekvenssin, joka koodaa paikkoja restriktioentsyymejä HincIIII, Mbol ja EcoRI varten. 15 Alavirran puolen primeri, ssc5h20a on peräisinkloonin 5h nukleotidisekvenssistä, joka sisältää HCV:n cdna:ta, jonka sekvenssit menevät päällekkäin kloonien 14i ja 11 b sekvenssien kanssa. ssc51120a:n sekvenssi on 20 5' GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA 3' Voidaan käyttää myös vaihtoehtoista primeria, ssc5h34a. Tämä primeri on peräisin kloonin 5h sekvenssistä ja se sisältää lisäksi nukleotideja 5'-päässä, jotka luovat restriktioentsyymin paikan täten helpottaen kloonausta. ssc5h34a:n sekvenssi on 25 5' GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT GGT GAC AGA GTC A 3' PCR-reaktio, jota on alunperin kuvannut Saiki et al. (1986), suoritetaan olennaisesti, kuten on kuvannut Lee et al. (1988), paitsi että cdna:n malline on RNA, joka on eristetty HCV_infektoidun simpanssin-rnalcsasta, kuten on kuvattu osassa IV.C.2., tai virus- 30 partikkeleista, jotka on eristetty HCV-infektoidun simpanssin seerumista, kuten on kuvattu osassa IV.A.1. Lisäksi olosuhteet ovat vähemmän ankarat amplifikaation ensimmäisellä kierroksella (0,6 M NaCI ja 25 C), koska primerin se osa, joka liittyy HCVsekvenssiin on vain 9 nukleotidin pituinen ja siinä voi olla huonosti yhteensopivia osia. Lisäksi, jos käytetään ssc5h34a:ta, lisäsekvenssit, jotka eivät ole peräisin HCV:n ge- 35 nomista ovat taipuvaisia destabiloimaan primeri-mallinehybridin. Amplifikaation ensimmäisen kierroksen jälkeen liitosolosuhteet voivat olla ankarammat (0,066 M NaC1 ja C), koska amplifioidut sekvenssit sisältävät nyt alueita, jotka ovat komplemen-

116 taarisia primereille tai niiden kopioille. Lisäksi ensimmäiset kymmenen amplifikaatiosykliä suoritetaan Klenowin entsyymi I:llä tälle entsyymille sopivissa PCRolosuhteissa. Syklien suorittamisen jälkeen näytteet uutetaan ja niihin käytetään Tagpolymeraasia pakkauksen ohjeiden mukaisesti, kuten Cetus/Perkin Elmer on esittänyt. Amplifilcaation jälkeen amplifioidut HCV:n cdna-sekvenssit osoitetaan hybridisaation avulla käyttäen kloonista 5h peräisin olevaa koetinta. Tämä koetin on peräisin sekvensseistä ylävirtaan niistä, joita käytettiin primeria varten, ja joka ei mene päällekkäin kloonista 5h peräisin olevien primereiden sekvenssien kanssa. Koettimen sekvenssi on 5' CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTC GTG TGG CGG TGT TGT TCT CGT CGG GTT GAT GGC GC 3' IV N 1 H.C_V_.:n_cDNA_Jdrjastnn_hu:>minen_infektaidun_NANBH:ta_sairasta3zan_snnpans. 15 gin makcacta Luotiin HCV:n cdna-kirjasto sellaisen simpanssin maksasta, josta oli luotu osan IV.A.1 HCV:n cdna-kirjasto. Tekniikka kirjaston luomiseksi oli samanlainen kuin se. jota käytettiin osassa IV.A.24., paitsi, että käytettiin tätä erilaista RNA:n lähdettä ja että 20 primeri perustui kloonin 1lb HCV:n cdna-sekvenssiin. Primerin sekvenssi oli 5' CTG GCT TGA AGA ATC 3' IV.N.2. KInonisq3 k9,1 25 kkin meriev mikleotirlicplevemcci ja eristäminen olevan HCV:n cdna:n kloonin_ llb cdna n kanssa päällpk, Klooni k9-1 eristettiin HCV:n cdna-kirjastosta, joka oli luotu NANBH-infektoidun simpanssin maksasta, kuten kuvattiin osassa IV.A.25. Kirjasto seulottiin sellaisten kloonien suhteen, jotka menevät päällekkäin kloonin 1 lb sekvenssin kanssa käyttäen 30 kloonia, joka menee päällekkäin Idoonin 11 b kanssa 5'-päässä, kloonia 1 1 e. Kloonin 1 lb sekvenssi on esitetty kuviossa 23. Positiiviset kloonit eristettiin taajuudella I :sta. Yhtä eristettyä kloonia, k9-1, tutkittiin tarkemmin. Kloonin k9-1 HCV:n cdna:n päällekkäin menevä luonne kuvion 26 HCV:n cdna:n 5'-pään kanssa varmistettiin tutkimalla kloonia kloonilla Alex46; jälkimmäinen Idooni sisältää HCV:n cdna- 35 sekvenssin, jossa on 30 emäsparia, jotkå vastaavat niitä emäspareja ylläkuvatun kloonin 14i HCV:n cdna:n 5'-päässä.

117 Kloonista k9-1 eristetynhcv:n cdna:n nukleotidisekvenssi määritettiin käyttäen tekniikoita, joita kuvattiin yllä. Kloonin k9-1 HCV:n cdna:n sekvenssi, sen päällekkäisyys kuvion 26 HCV:n cdna:n kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 46. Kloonin k9-1 cdna-sekvenssi on rinnakkainen niiden sekvenssien 5 kanssa, jotka ovat klooneissa, joita on kuvattu osassa IV.A.19. yhdistelmä-hcv:n cdna-sekvenssin luomiseksi, jolloin k9-1-sekvenssi on asetettu ylävirtaan kuviossa 32 esitetystä sekvenssistä. Yhdistelmä-HCV:n cdna-sekvenssi, joka sisältää k9-1-sekvenssin ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa Kuviossa 47 esitetyn HCV:n cdna:n 5'-alueeseen koodattujen aminohappojen sekvenssiä on verrattu yllä kuvattujen Dengue-viruskantojen vastaavaan alueeseen alueiden hydrofobisuuden ja hydrofiilisyyden suhteen. Tämä vertailu osoitti, että HCV:n ja tälle alueelle koodatun Dengue-viruksen, mikä vastaa NS1:tä (tai osaa siitä) koodaavaa aluetta, polypeptidit ovat hydrofobisuus-/hydrofiilisyysprofiileiltaan samanlaisia. Alla annettu tieto sallii HCV-kantojen identifioinnin. Muiden HCV-kantojen eristäminen ja karakterisointi voidaan suorittaa eristämällä nuldeiinihappoja ruumiin osista, jotka sisältävät viruspartikkeleita, luomalla cdna-kirjastoja käyttäen polynukleotidikoettimia, jotka perustuvat alla kuvattuihin HCV:n cdna-koettimiin, seulo- 20 uralla kirjastoja sellaisten kloonien varalta, jotka sisältävät alla kuvattuja HCV:n cdnasekvenssejä ja vertaamalla uusista eristetyistä osista olevia HCV:n cdna:oita alla kuvattuihin cdna:oihin. Niihin tai virusgenomiin koodattuja polypeptidejä voidaan tarkkaillaimmunologisen ristireagoivuuden suhteen käyttäen yllä kuvattuja polypeptidejä ja vasta-aineita. Kannat, jotka sopivat HCV:n parametreihin, kuten on kuvattu yllä olevas- 25 sa Määritelmät-osassa, voidaan identifioida helposti. Muut menetelmät HCV-kantojen identifioimiseksi ovat ilmeisiä alan ammattilaisille perustuen tässä annettuun tietoon. Keksinnöllä on, lukuisissa tässä esitetyissä ilmenemismuodoissaan, monia teollisia käyttöjä, joista muutamat ovat seuraavia. HCV:n cdna:oita voidaan käyttää koettimien 30 suunnitteluun HCV:n nuldeiiruliappojen osoittamiseeen näytteissä. cdna:oista peräisin olevia koettimia voidaan käyttää HCV:n nukleiinihappojen osoittamiseen esimerkiksi kemiallisissa synteettisissä reaktioissa. Niitä voidaan käyttää myös seulontaohjelmissa antiviraalisia aineita varten, aineiden tehon määrittämiseen estämään virusreplikaatiota soluviljelyjärjestelmissä ja eläinmallijärjestelmissä. HCV-polynukleotidikoettimet ovat 35 myös hyödyllisiä virusnukleiinihappojen osoittamisessa ihmisissä ja täten ne voivat toimia perusteena HCV-infektion diagnosoimiseksi ihmisissä.

118 116 Yllä olevan lisäksi tässä esitetyt cdna:t antavat tietoa ja välineet HCV:n epitooppeja sisältävien polypeptidien syntetisoimiseksi. Nämä polypeptidit ovat hyödyllisiä osoitettaessa vasta-aineita HCV-antigeeneille. Tässä kuvataan sarja immunologisia analyysejä HCV-infektiolle perustuen yhdistelmäpolypeptideihin, jotka sisältävät HCV- 5 epitooppeja ja ne ovat kaupallisesti käytettävissä diagnosoitaessa HCV:n aiheuttamaa 10 NANBH:a, seulottaessa veripankkien luovuttajia HCV:n aiheuttaman tarttuvan maksatulehduksen varalta ja myös osoittamaan saastunut veri, joka tulee tartuttavista verenluovuttajista. Virusantigeeneillä on myös käyttöä tarkkailtaessa antiviraalisien aineiden tehoa eläinmallijärjestelmissä. HCV:n cdna:oista peräisin olevat polypeptidit ovat käyttökelpoisia, yllä kuvattujen käyttöjen lisäksi, anti-hcv-vasta-aineiden synnyttämiseksi. Kuitenkin vasta-aineet, jotka ovat syntyneet HCV-polypeptideillä tapahtuneen immunisoinnin seurauksena, ovat myös käyttökelpoisia osoitettaessa virusantigeenien läsnäolo näytteessä. Täten niitä 15 voidaan käyttää HCV-polypeptidien tuotannon analysoimiseen kemiallisissa järjestelmissä. HCV:n vastaisia vasta-aineita voidaan käyttää myös tarkkailemaan virustenvastaisten aineiden tehoa seulontaohjelmissa, joissa näitä aineita testataan kudosviljelyjärjestelmissä. Niitä voidaan käyttää diagnosoimaan HCV:n aiheuttamaa NANBH:a sallimalla virusantigeenien osoittaminen sekä verenluovuttajissa että -vastaanottajissa. 20 Toinen tärkeä käyttö HCV:n vastaisille vasta-aineille on affiniteettikromatografiassa viruksen ja viruspolypeptidien puhdistamiseksi. Puhdistettu virus voi olla myös hyödyllinen soluviljelyjärjestelmien kehittämisessä, joissa järjestelmissä HCV replikoituu. Soluviljelyjärjestelmällä, joka sisältää HCV-infektoituneita soluja, on monia käyttöjä. 25 Niitä voidaan käyttää suhteellisen laajamittaiseen HCV:n tuotantoon, mikä on normaalisti alhaisen tiitterin virus. Nämä järjestelmät ovat myös hyödyllisiä viruksen molekyylibiologian selvittämiseen ja ne voivat johtaa virustenvastaisten aineiden kehittämiseen. Soluviljelyjärjestelmät ovat myös hyödyllisiä virustenvastaisten aineiden tehon seulonnassa. Lisäksi HCV:a sisältävät soluviljelyjärjestelmät ovat hyödyllisiä heikennettyjen 30 HCV-kantojen tuottamiseen. Mukavuuden vuoksi HCV:n vastaiset vasta-aineet ja HCV-polypeptidit, joko luonnolliset tai yhdistelmät, voidaan pakata välinepakkauksiin. Menetelmä, jota käytetään HCV:n cdna:n eristämiseen ja joka käsittää cdna- 35 kirjaston valmistamisen ollen peräisin yksilön infektoituneesta kudoksesta ekspressiovektoriin ja sellaisten kloonien valitsemisen, jotka tuottavat ekspressiotuotteita, jotka reagoivat immunologisestivasta-aineiden kanssa vasta-aineita sisältävissä muiden infek-

119 117 toineiden yksilöiden, muttei infektoitumattomien yksilöiden, ruumiin osissa, voivat olla myös käyttökelpoisia cdna:oitten eristämiseksi, jotka ovat peräisin muista tähän asti tuntemattomista, sairauteen liittyvistä aineista, jotka muodostuvat genomiosista. Tämä voisi vuorostaan johtaa näiden aineiden eristämiseen ja karakterisointiin ja diagnostisiin 5 reagensseihin näitä sairauksiin liittyviä aineita varten. Patpnttivaatimilkset Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää HCV-antigeenisen determinantin ja sisältää jatkuvan, kuviossa 47 esitetyssä sekvenssissä koodatun vähintään 8 aminohapon sekvenssin, ja sitä voidaan käyttää HCV:n vastaisen vasta-aineen (anti-hcv-vasta-aineen) toteamiseksi in vitro Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää HCV-antigeenisen determinantin ja sisältää jatkuvan, kuviossa 14 esitetyssä sekvenssissä koodatun vähintään 8 aminohapon sekvenssin, ja sitä voidaan käyttää HCV:n vastaisen vasta-aineen (anti-hcv-vasta-aineen) toteamiseksi in vitro Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää HCV-antigeenisen determinantin ja sisältää jatkuvan, kuviossa 26 esitetyssä sekvenssissä koodatun vähintään 8 aminohapon sekvenssin, ja sitä voidaan käyttää HCV:n vastaisen vasta-aineen (anti-hcv-vasta-aineen) toteamiseksi in vitro Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää HCV-antigeenisen determinantin ja sisältää jatkuvan, kuviossa 32 esitetyssä sekvenssissä koodatun vähintään 8 aminohapon sekvenssin, ja sitä voidaan käyttää HCV:n vastaisen vasta-aineen (anti-hcv-vasta-aineen) toteamiseksi in vitro Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää HCV-antigeenisen determinantin ja sisältää jatkuvan, American Type Culture Collection:iin (ATCC) viitenumerolla talletetun lambda-gtl 1 cdna-kirjastossa koodatun vähintään 8 aminohapon sekvenssin.

120 Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että jatkuva sekvenssi käsittää vähintään 10 aminohappoa Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että jatkuva sekvenssi käsittää vähintään 15 aminohappoa. 8. Fuusioproteiini, tunnettu siitä että se käsittää jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukaisen polypeptidin niissä mainittu jatkuva sekvenssi on fuusioitunut ei-hcv amino- 10 happosekvenssiin joka on valittu ryhmästä superoksididismutaasisekvenssi, beetagalaktosidaasisekvenssi, erittymisen mahdollistava sekvenssi, partikkelin muodostumisen mahdollistava sekvenssi, hepatiitti-b-pinnan esisekvenssi ja hepatiitti-b pintaanti geenisekvenssi Immunologisen määritysmenetelmän välinepakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukaista polypeptidiä sopivassa astiassa. 10. Immunologinen määritysmenetelmä vasta-aineen määrittämiseksi in vitro, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: 20 (a) otetaan käyttöön polypeptidi, joka käsittää antigeenisen determinantin jonka anti- HCV vasta-aine pystyy sitomaan, jolloin mainittu antigeeninen deterrninantti käsittää kuviossa 47 esitetyssä sekvenssissä koodatun jatkuvan, ainakin 8 aminohappoa käsittävän aminohapposekvenssin; (b) inkuboidaan biologinen näyte in vitro mainitun polypeptidin kanssa vasta-aine - 25 antigeenikompleksin muodostumisen mahdollistavissa olosuhteissa, ja (c) määritetään, muodostuuko vasta-aine - antigeenikompleksia joka käsittää mainittua polypeptidiä Immunologinen määritysmenetelmä vasta-aineen määrittämiseksi in vitro, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) otetaan käyttöön polypeptidi, joka käsittää antigeenisen determinantin jonka anti-

121 119 HCV vasta-aine pystyy sitomaan, jolloin mainittu antigeeninen determinantti käsittää jatkuvan, American Type Culture Collection:iin (ATCC) viitenumerolla talletetun lambda-gtl 1 cdna-kirjastossa koodatun vähintään 8 aminohapon sekvenssin; (b) inkuboidaan biologinen näyte in vitro mainitun polypeptidin kanssa vasta-aine - 5 antigeenikompleksin muodostumisen mahdollistavissa olosuhteissa, ja (c) määritetään, muodostuuko vasta-aine - antigeenikompleksia joka käsittää mainittua polypeptidiä. 12. Immunologinen määritysmenetelmä vasta-aineen määrittämiseksi in vitro, tunnettu 10 siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) otetaan käyttöön polypeptidi, joka käsittää antigeenisen determinantin jonka anti- HCV vasta-aine pystyy sitomaan, jolloin mainittu antigeeninen determinantti käsittää kuviossa 14 esitetyssä sekvenssissä koodatun jatkuvan, ainakin 8 aminohappoa käsittävän aminohapposekvenssin; 15 (b) inkuboidaan biologinen näyte in vitro mainitun polypeptidin kanssa vasta-aine - antigeenikompleksin muodostumisen mahdollistavissa olosuhteissa, ja (c) määritetään, muodostuuko vasta-aine - antigeenikompleksia joka käsittää mainittua polypeptidiä Immunologinen määritysmenetelmä vasta-aineen määrittämiseksi in vitro, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) otetaan käyttöön polypeptidi, joka käsittää antigeenisen determinantin jonka anti- HCV vasta-aine pystyy sitomaan, jolloin mainittu antigeeninen determinantti käsittää 25 kuviossa 26 esitetyssä sekvenssissä koodatun jatkuvan, ainakin 8 aminohappoa käsittä- vän aminohapposekvenssin; (b) inkuboidaan biologinen näyte in vitro mainitun polypeptidin kanssa vasta-aine - antigeenikompleksin muodostumisen mahdollistavissa olosuhteissa, ja (c) määritetään, muodostuuko vasta-aine - antigeenikompleksia joka käsittää mainittua 30 polypeptidiä. ;.

122 Immunologinen määritysmenetelmä vasta-aineen määrittämiseksi in vitro, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) otetaan käyttöön polypeptidi, joka käsittää antigeenisen determinantin jonka anti- HCV vasta-aine pystyy sitomaan, jolloin mainittu antigeeninen determinantti käsittää 5 kuviossa 32 esitetyssä sekvenssissä koodatun jatkuvan, ainakin 8 aminohappoa käsittävän aminohapposekvenssin; (b) inkuboidaan biologinen näyte in vitro mainitun polypeptidin kanssa vasta-aine - antigeenikompleksin muodostumisen mahdollistavissa olosuhteissa, ja (c) määritetään, muodostuuko vasta-aine - antigeenikompleksia joka käsittää mainittua 10 polypeptidiä. 15. Vasta-ainekoostumus, tunnettu siitä, että se on anti-hcv-vasta-ainekoosttunus joka käsittää vasta-aineita jotka sitovat HCV:n antigeenistä determinanttia jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukaisessa polypeptidissä, ja joka vasta-ainekoostumus on (a) puh- 15 distettu valmiste polyklonaalisista vasta-aineista, (b) koostumus monoklonaalisista vasta-aineista Patenttivaatimuksen 15 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että anti-hcv vastaaineet ovat sidottuina kiinteään kantojaan. 17. Immunologisen määritysmenetelmän välinepakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 15 tai 16 mukaista anti-hcv-vasta-ainekoostumusta sopivassa astiassa Immunologinen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että sillä todetaan näytteestä HCV-antigeeniä ja menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: (a) otetaan käyttöön patenttivaatimuksen 15 tai 16 mukainen anti-hcv-vastaainekoo stumus ; (b) inkuboidaan näyte mainitun anti-hcv-vasta-ainekoostumuksen kanssa vasta-aine - 30 antigeenikompleksin muodostumisen mahdollistavissa olosuhteissa, ja (c) määritetään, muodostuuko vasta-aine - antigeenikompleksia joka käsittää anti-hcv - vasta-ainetta.

123 Olennaisesti eristetty polypeptidi käytettäväksi patenttivaatimuksen 15 mukaisen anti-hcv - vasta-ainekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä että se käsittää HCV-antigeenistä determinanttia ja sisältää kuviossa 47 esitetyssä sekvenssissä kooda- 5 tun, vähintään 8 aminohapon jatkuvan sekvenssin. 20. Olennaisesti eristetty polypeptidi käytettäväksi patenttivaatimuksen 15 mukaisen anti-hcv - vasta-ainekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä että se käsittää HCV-antigeenistä determinanttia ja sisältää kuviossa 14 esitetyssä sekvenssissä kooda- 10 tun, vähintään 8 aminohapon jatkuvan sekvenssin. 21. Olennaisesti eristetty polypeptidi käytettäväksi patenttivaatimuksen 15 mukaisen anti-hcv - vasta-ainekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä että se käsittää HCV-antigeenistä determinanttia ja sisältää kuviossa 26 esitetyssä sekvenssissä kooda- 15 tun, vähintään 8 aminohapon jatkuvan sekvenssin. 22. Olennaisesti eristetty polypeptidi käytettäväksi patenttivaatimuksen 15 mukaisen anti-hcv - vasta-ainekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä että se käsittää HCV-antigeenistä determinanttia ja sisältää kuviossa 32 esitetyssä sekvenssissä kooda- 20 tun, vähintään 8 aminohapon jatkuvan sekvenssin. Patentierav 1. En polypeptid i väsentligen isolerad form, kännetecknad därav att den omfattar en 25 HCV-antigen determinant och innehäller en kontinuerl ig sekvens om minst 8 aminosyror kodad i sekvensen enligt figur 47, och kan användas flir konstaterande av av antikroppar mot HCV (anti-hcv antikroppar) in vitro. 2. En polypeptid i väsentligen isolerad form, kännetecknad därav att den omfattar en 30 HCV-antigen determinant och innehäller, en kontinuerlig sekvens om minst 8 aminosyror kodad i sekvensen enligt figur 14, och kan användas för konstaterande av av antikroppar mot HCV (anti-hcv antikroppar) in vitro.

124 En polypeptid i väsentligen isolerad form, kännetecknad därav att den omfattar en HCV-antigen determinant och innehåller en kontinuerlig sekvens om minst 8 aminosyror kodad i sekvensen enligt figur 26, och kan användas för konstaterande av av anti- 5 kroppar mot HCV (anti-hcv antikroppar) in vitro. 4. En polypeptid i väsentligen isolerad form, kännetecknad därav att den omfattar en HCV-antigen determinant och innehåller en kontinuerlig sekvens om minst 8 aminosyror kodad i sekvensen enligt figur 32, och kan användas för konstaterande av av anti- 10 lcroppar mot HCV (anti-hcv antikroppar) in vitro. 5. En polypeptid i väsentligen isolerad form, kännetecknad därav att den omfattar en HCV-antigen determinant och innehåller en kontinuerlig sekvens om minst 8 aminosyror kodad inom lambda-gt11 cdna-biblioteket deponerat i American Type Culture Col- 15 lection (ATCC) under referensnummer En polypeptid enligt någon av patentkrav 1-5, kännetecknad därav att den kontinuerliga sekvensen omfattar minst 10 aminosyror En polypeptid enligt någon av patentkrav 1-5, kännetecknad därav att den kontinuerliga sekvensen omfattar minst 15 aminosyror. 8. Fusionsprotein, kännetecknat därav att det omfattar en polypeptid enligt någon av patentkrav 1-7 vari nämnda kontinuerliga sekvens är fusionerad till en icke-hcv- 25 aminosyrasekvensvald ur gruppen superoxiddismutassekvens, betagalaktosidassekvens, sekvens vilken möjliggör utsöndring, sekvens vilken möjliggör partikelformation, presekvens för hepatit-b yta samt antigensekvens för hepatit-b yta. 9. Utrustningsfbrpackning för en immunologisk bestämningsmetod, kännetecknad 30 därav att den omfattar en polypeptid enligt något av patentkrav 1-8 i ett lämpligt kärl. 10. En immunologisk bestämningsmetod för bestämning av antikroppar in vitro, känne-

125 123 tecknad därav att den omfattar fbljande steg: (a) en polypeptid tas i bruk vilken ofattar en antigen determinant som anti-hcv antikroppar kan binda, varvid nämnda antigena determinant omfattar en aminosyrasekvens kodad i sekvensen enligt figur 47 och omfattande minst 8 aminosyror; 5 (b) ett biologiskt prov inkuberas in vitro med nämnda polypeptid i förhållanden vilka möjliggör uppkomst av ett antikropp-antigenkomplex, och (c) en bestämning görs huruvida ett ett antikropp-antigenkomplex uppkommer, vilket innehåller nämnda polypeptid En immunologisk bestämningsmetod för bestämning av antikroppar in vitro, kännetecknad därav att den omfattar fbljande steg: (a) en polypeptid tas i bruk vilken ofattar en antigen determinant som anti-hcv antikroppar kan binda, varvid nämnda antigena determinant omfattar en kontinuerlig sekvens om minst 8 aminosyror, kodad inom lambda-gtl 1 cdna-biblioteket deponerat 15 vid American Type Culture Collection (ATCC) med referensnumret 40394; (b) en biologiskt prov inkuberas in vitro med nämnda polypeptid i förhällanden vilka möjliggör uppkomst av ett antikropp-antigenkomplex, och (c) en bestämning görs huruvida ett ett antikropp-antigenkomplex uppkommer, vilket innehäller nämnda polypeptid En immunologisk bestämningsmetod för bestämning av antikroppar in vitro, kännetecknad därav att den omfattar fbljande steg: (a) en polypeptid tas i bruk vilken ofattar en antigen determinant som anti-hcv antikroppar kan binda, varvid nämnda antigena determinant omfattar en aminosyrasekvens 25 kodad i sekvensen enligt figur 14 och omfattande minst 8 aminosyror; 30 (b) en biologiskt prov inkuberas in vitro med nämnda polypeptid i förhällanden vilka möjliggör uppkomst av ett antikropp-antigenkomplex, och (c) en bestämning görs huruvida en ett antikropp-antigenkomplex uppkommer, vilket innehäller nämnda polypeptid. 13. En immunologisk bestämningsmetod för bestämning av antikroppar in vitro, kännetecknad därav att den omfattar följande steg:

126 (a) en polypeptid tas i bruk vilken ofattar en antigen determinant som anti-hcv antikroppar kan binda, varvid nämnda antigena determinant omfattar en aminosyrasekvens kodad i sekvensen enligt figur 26 och omfattande minst 8 aminosyror; (b) ett biologiskt prov inkuberas in vitro med nämnda polypeptid i fiirhållanden vilka 5 möjliggör uppkomst av ett antikropp-antigenkomplex, och (c) en bestämning görs huruvida ett ett antikropp-antigenkomplex uppkommer, vilket innehiller nämnda polypeptid. 14. En immunologisk bestämningsmetod för bestämning av antikroppar in vitro, känne- 10 tecknad därav att den omfattar fbljande steg: (a) en polypeptid tas i bruk vilken ofattar en antigen determinant som anti-hcv antikroppar kan binda, varvid nämnda antigena determinant omfattar en aminosyrasekvens kodad i sekvensen enligt figur 26 och omfattande minst 8 aminosyror; (b) ett biologiskt prov inkuberas in vitro med nämnda polypeptid i fiirhällanden vilka 15 möjliggör uppkomst av ett antikropp-antigenkomplex, och (c) en bestämning görs huruvida ett ett antikropp-antigenkomplex uppkommer, vilket innehåller nämnda polypeptid. 15. Antikroppkomposition, kännetecknad därav att den är en anti-hcv- 20 antikroppkomposition som omfattar antikroppar vilka binder en HCV-antigen determinant i en polypeptid enligt något av patentkrav 1-8, och vilken antikroppkombination är (a) en renad produkt av polyldonala antikroppar, (b) en produkt av monoklonala antikroppar En komposition enligt patentkrav 15, kännetecknad därav att anti-hcvantikropparna är bundna till en fast bärare Utrustningsförpackning för en immunologisk bestämningsmetod, kännetecknad därav att den omfattar en polypeptid enligt patentkrav 15 eller 16 i ett lämpligt kärl En immunologisk bestämningsmetod, kännetecknad därav att därmed konstateras HCV-antigen i ett prov, och den omfattar följande steg:

127 125 (a) en anti-hcv-antikroppkomposition enligt patentkrav 15 eller 16 tas i bruk; (b) ett biologiskt prov inkuberas med nämnda anti-hcv-antikroppkomposition i förhållanden vilka möjliggör uppkomst av ett antikropp-antigenkomplex, och (c) en bestämning görs huruvida ett ett antikropp-antigenkomplex uppkommer, vilket 5 innehåller anti-hcv-antikroppar. 19. En väsentligen isolerad polypeptid fbr användning vid framställning av en anti- HCV-antikroppkomposition enligt patentkrav 15, kånnetecknad därav att den omfattar HCV-antigen determinant och innehäller en kontinuerlig sekvens om minst 8 arn'ino- 10 syror, kodad i sekvensen enligt figur En väsentligen isolerad polypeptid fbr användning vid framställning av en anti- HCV-antikroppkomposition enligt patentkrav 15, kännetecknad därav att den omfattar HCV-antigen determinant och innehäller en kontinuerlig sekvens om minst 8 amino- 15 syror, kodad i sekvensen enligt figur En väsentligen isolerad polypeptid fbr användning vid framställning av en anti- HCV-antikroppkomposition enligt patentkrav 15, kännetecknad därav att den omfattar HCV-antigen determinant och innehäller en kontinuerlig sekvens om minst 8 amino- 20 syror, kodad i sekvensen enligt figur En väsentligen isolerad polypeptid fbr användning vid framställning av en anti-. HCV-antilcroppkomposition enligt patentkrav 15, kännetecknad därav att den omfattar HCV-antigen determinant och innehåller en kontinuerlig sekvens om minst 8 amino- 25 syror, kodad i sekvensen enligt figur 32. 1

128 F1G. 1 Kloonin DNA:n translaatio AlaSerCysLeuAsnCysSerA1aSerIleIleProAspArgG1uValLeuTyrArgGlu 1 GGCCTCCTGCTTGAACTGCTCGGCGAGCATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGA CCGGAGGACGAACTTGACGAGCCGCTCGTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCT PheAspGluMetG1uGluCysSerG1nHisLeuProTyrI1eG1uGlnGlyMetMALeu 61 GTTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCT CAAGCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGC.ATGTAGCTCGTTCCCTACTACGA AlaG1uGlnPheLysG1nLysA1aLeuGlyLeu 121 CGCCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCC GCGGCTCGTCAAGTTCGTC 1TCCGGGAGCCGGAGG FIG. 3 Kloonien 5-1-1, 81, 91 ja 1-2 DNA:n translaatio GlyCysValVa1IleVa1G1yArgVa1ValLeuSerGlyLysProAlaileIleProAsp 1 CTGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTG GACCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGGAC T ArgG1uValLeuTyrArgGluPheAspG1UMetGluGluCysSerGlnHisLeuProTyr 61 ACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGT TGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGCA A IleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGln 121 ACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGC TGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGGACG ThrAlaSerArgGlnAlaGluValIleAlaProAlaValG1nThrAsnTrpG1nLysLeu 181 AGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTGTCCAGACCAACTGCAAAAAC TCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGACAGGTCTGGTTGACCGTTTTTG. GluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsnPheIleSerGlyIleGlnTyrLeuAlaGly 241 TCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCAGTGGGATACAATACTTGGCGG AGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGTCACCCTATGTTATGAACCGCC LeuSerThrLeuProGlyAsnProAlaIleAlaSerLeuMetAlaPheThrAlaAlaVal 301 GCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCATTGATGGCTTTTACAGCTGCTG CGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTAACTACCGAAAATGTCGACGAC ThrSerProLeuThrThrSerGln 361 TCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAA AGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTT

129 . ffi g g dc ic = =?-----? 516=11 W:1 ~» =1. 1~. =MM» dffillffi iii 4C-4C--4C=.=1 = = = "4 "I "4 CD r %Co.I ~I 4,...., liee l Om=11. 1 ei 0 11 ei - ri o CD n ei 0 44, re V) ei 0 M CO tri 0.4 ei ei ei 0 CD Ch ~I UI CO 0+ "4 4l$ CO 0% "4 CD Ok CD 014 E4

130 FIG. 4 Kloonin 81 DNA:n translaatio S erg1ylysproalaileileproasparggluvalleutyrarggiupheaspg1umet 1 GTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGAT CAGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTA G iuglucysserglnhisleuprotyrilegluglnglymetmetleualagiuglnphe 61 GGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTT C CTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAA LysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGinThrAlaSerArgGlnAlaGluValIleAlaPro 121 CAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCC GTTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGQGG AlaValG1nThrAsnTrpG1nLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsnPhe TGCTGTCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTT ACGACAGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAA IleSerGlyIleG1nTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuPtoGlyAsnProAlaIleAla 241 CATCAGTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAXCGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGC GTAGTCACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACG SerLeuMetAlaPheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGin 301 TTCATTGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAA AAGTAACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTT FIG. 5 Kloonin 36 DNA:n translaatio AspAlaHisPheLeuSerG1nThrLysG1nSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAla 1 GATGCCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCG CTACGGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATOGC TyrGlnAlaThrValCysAlaArgAlaGlnAlaProProProSerTrpAspGlnMetTrp 61 TACCAAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGG ATGGTTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGCGTAGCACCCTGGTCTACACC LysCysLeuIleArgLeulaysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeu 121 AAGTGTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTG TTCACAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGAC GlyAlaValGlnAsnGluIleThrLeuThrHisProValThrLysTyrIleMetThrCys 181 GGCGCTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGC CCGCGACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACG MetSerAlaAspLeuGluValValThrSerThrTrpValLeuValGlyGlyValLeuAla 241 ATGTCGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCT TACAGCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGA AlaLeuAlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCysValValIleValGlyArgValValLeu 301 GCTTTGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTG CGAAACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAAC SerGlyLysProAlaIleIleProAspArgGluValLeuTyrArg 361 TCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAG AGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTC

131 W5652 FIG. 6 Kloonien 36 ja 81 DNA:oitten yhdistetty avoin lukualue AspAlaHisPheLeuSerG1nThrLysG1nSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAla 1 GATGCCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCG CTACGGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGC TyrG1nAlaThrValCysAlaArgAlaG1nAlaPmProProSerTrpAspG1nMetTrp 61 TACCAAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGG ATGGTTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACC LysCysLeuIleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeu 121 AAGTGTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTG TTCACAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGAC GlyAlaValGlnAsnGluIleThrLeuThrHisProValThrLysTyrIleMetThrCys 181 GGCGCTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGC CCGCGACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACG MetSerAlaAspLeuGluValValThrSerThrTrpValLeuValGlyGlyValLeuAla 241 ATGTCGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCT TACAGCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGA AlaLeuAlaAlaTyreysLeuSerThrGlyCysValValIleValGlyArgValValLeu 301 GCTTTGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTG CGAAACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAAC SerGlyLysProAlaIleIleProAspArgGluValLeuTyrArgGluPheAspGluMet 361 TCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATG AGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCITCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTAC GluGluCysSerGInHisLeuProTyrIleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGlnPhe 421 GAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTC CTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAG LysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuG1nThrAlaSerArgGlnAlaGluValIleAlaPro 481 AAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCT TTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGA AlaValG1nThrikånliMiX4rṣteuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsnPhe 541 GCTGTCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTC CGACAGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAG IleSerGlyIleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnProAlaIleAla 601 ATCAGTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCT TAGTCACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGA

132 FIG.1 Kldonin 32 DNA:n translaatio ----Päällekkäisyys kloonin 81 kanssa---- PheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerG1nThrLeuLeuPheAsnIleLeu 1 CTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCAACATAT GAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGTTGTATA GlyGlyTrpValAlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAlaAlaThrAlaPheValGlyAla 61 TGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTGTGGGCG ACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAACACCCGC GlyLeuAlaGlyAlaAlaIleGlySerValGlyLeuGlyLysValLeuIleAspileLeu 121 CTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAGACATCC GACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATCTGTAGG AlaGlyTyrGlyAlaGlyValAlaGlyAlaLeuValAlaPheLysIleMetSerGlyGlu 181 TTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGAGCGGTG AACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACTCGCCAC ValProSerThrGluAspLeuValAsnLeuLeuProAlaIleLeuSerProGlyAlaLeu 241 AGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCGGAGCCC TCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGCCTCGGG ValValGlyValValCysAlaAlaIleLeuArgArgHisValGlyProGlyGluGlyAla 301 TCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCGAGGGGG AGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGCTCCCCC Va1G1nTrpMetAsnArgLeuIleAlaPheAl-aSerArgGlyAsnHisvalSer 361 CAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTTCCCC GTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAAGGGG

133 FIG. 8 Kloonin 35 DNA:n translaatio SerIleGluThrIleThrLeuProGlnAspAlaValSerArgThrGlnArgArgGlyArg 1 TCCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCAGG AGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGTCC ThrGlyArgGlyLysProGlyIleTyrArgPheV1A1aProGlyGluArgProSerGly 61 ACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCGGC TGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGCCG MetPheAspSerSerValLeuCysGluCysTyrAspAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeu 121 ATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGCTC TACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCGAG ThrProAlaGluThrThrValArgLeuArgAlaTyrMetAsnThrProGlyLeuProVal 181 ACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCGTG TGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGCAC CysGlnAspHisLeuGluPheTrpGluGlyValPheThrGlyLeuThrHisIleAspAla 241 TGCCAGGACCATCTTGAATT1TGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATGCC ACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTACGG HisPheLeuSerG1nThrLysG1nSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAlaTyrGln 301 CACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACCAA GTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGGTT.Päällekkäisyys kloonin 36 kanssa AlaThrValCysAlaArgAlaGlnA1aProProProSerTrpAspG1nMetTrpLysCys 361 GCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGTGT CGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCACA LeuIleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeuGlyAla 421 TTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCGCT AACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGCGA

134 FIG. 9-1 Kloonien 35, 36, 81 ja 32 yhdistetyt avoimet lukualueet SerIleGluThrIleThrLeuProGlnAspAlavalSerArgThrGlnArgArgGlyArg 1 TCCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCAGG AGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGTCC ThrGlyArgGlyLysProGlyIleTyrArgPheValAlaProG1yGluArgProSerGly 61 ACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCGGC TGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGCCG MetPheAspSerSerValLeuCysGluCysTyrAspAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeu 121 ATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGCTC TACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCGAG ThrProAlaGluThrThrValArgLeuArgAlaTyrMetAsnThrProGlyLeuProVal 181 ACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCGTG TGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGCAC CysGlnAspHisLeuGluPheTrpGluGlyValPheThrGlyLeuThrNisIleAspAla 241 TGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATGCC ACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTACGG HisPheLeuSerG1nThrLysG1nSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAlaTyrGln 301 CACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACCAA GTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCC=GGAAGGAATGGACCATCGCATGGTT AlaThrValCysA1aArgA1aGlnA1aProProProSerTrpAspG1nMetTrpLysCys 361 GCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGTGT CGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCACA LeuIleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeuGlyAla 421 TTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCGCT AACTAAGCGGAG'TTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGCGA valglnasngluilethrleuthrmisprovalthrlystyrilemetthrcysmetser 481 GTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGCATGTCG CAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACAGC AlaAspLeuGluvalValThrSerThrTrpValLeuValGlyGlyValLeuAlaAlaLeu 541 GCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTTTG CGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAAAC AlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCysValValIleValGlyArgvalValLeuSerGly 601 GCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCGGG CGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGCCC LysProAlaIleIleProAspArgGluValLeuTyrArgGluPheAspGluMetGluGlu 661 AAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAGAG TTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTCTC CysSerGlnHisLeuProTyrIleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGLIPheLysGln 721 TGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGCAG ACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCGTC LysAlaLeuGlyLeuLeuG1nThrAlaSerArganklaGluValIleAlaProAlaVa1 781 AAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGC.AGAGGTTATCGCCCCTGCTGTC TTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGAC.AG

135 GlnThrAsnTrpG1nLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsnPheIleSer 841 CAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCAGT GTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGTCA GlyIleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnProAlaIleAlaSerLeu 901 GGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCATTG CCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACC.ATTGGGGCGGTAACGAAGTAAC MetAlaPheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerG1nThrLeuLeuPheAsn 961 ATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCAAC TACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGTTG IleLeuGlyGlyTrpValAlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAlaAlaThrAlaPheVal 1021 ATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTGTG TATAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACCGAAACAC GlyAlaGlyLeuAlaGlyAlaAlaIleGlySerValGlyLeuGlyLysValLeuIleAsp 1081 GGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAGAC CCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATCTG IleLeuAlaGlyTyrGlyAlaGlyValAlaGlyAlaLeuValAlaPheLysIleMetSer 1141 ATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGIGGCATTCAAGATCATGAGC TAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACTCG GlyGluValProSerThrGluAspLeuValAsnLeuLeuProAlaIleLeuSerProGly 1201 GGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCGGA CCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGCCT AlaLeuValValGlyValValCysAlaAlaIleLeuArgArgHisValGlyProGlyGlu 1261 GCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCGAG CGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGCTC GlyAlaValGlnTrpMetAsnArgLeulleAlaPheAlaSerArgGlyAsnHisValSer 1321 GGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTTCCCC CCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAAGGGG FIG. 9-2

136 FIG. 10 Kloonin 37b DNA:n translaatio LeuAlaAlaLysLeuValA1aLeuGlyIleAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAsp 1 CTCGCCGCAAAGCTGGTCGCATTGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGAC GAGCGGCGTTTCGACCAGCGTAACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTG ValSerValIleProThrSerGlyAspValValVa1ValAlaThrAspAlaLeuMetThr 61 GTGTCCGTCATCCCGACCAGCGGCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACC CACAGGCAGTAGGGCTGGTCGCCGCTACAACAGCAG_CACCGTTGGCTACGGGAGTACTGG GlyTyrThrGlyAspPheAspSerValIleAspTyrAsnThrCysValThrG1nThrVa1 121 GGCTATACCGGCGACTTCGACTCGGTGATAGACTACAATACGTGTGTCACCCAGACAGTC CCGATATGGCCGCTGAAGCTGAGCCACTATCTGATGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAG -Päällekkäisyys AspPheSerLeuAspProThrPheThrIleGluThrIleThrLeuProGlnAspAlaVal 181 GATTTCAGCCTTGACCCTACCTTCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTC CTAAAGTCGGAACTGGGATGGAAGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAG kloonin 35 kanssa SerArgThrGlnArgArgGlyArgThr 241 TCCCGCACTCAACGTCGGGGCAGGACTG AGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGTCCTGAC FIG. II Kloonin 33b DNA:n translaatio Päällekkäisyys kloonin 32 kanssa MetAsnArgLeuIleAlaPheA1aSerArgGlyAsnHisValSerProThrHisTyrVal 1 GATGAACCGGCTGATAGCCTTCgCCTCCCGGGGGAACCATGTTTCCCCCACGCACTACGT CTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAAGGGGGTGCGTGATGCA ProGluSerAspAlaAlaA1aArgValThrAlaIleLeuSerSerLeuThrValThrGln 61 GCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCACTGCCATACTCAGCAGCCTCACTGTAACCCA CGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTGACGGTATGAGTCGTCGGAGTGACATTGGGT LeuLeuArgArgLeuNisG1nTrpIleSerSerG1uCysThrThrProCysSerGlySer 121 GCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCTCGGAGTGTACCACTCCATGCTCCGGTTC CGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTCACATGGTGAGGTACGAGGCCAAG TrpLeuArgAspIleTrpAspTrpIleCysGluValLeuSerAspPheLysThrTrpLeu 181 CTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGTTGAGCGACTTTAAGACCTGGCT GACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACAACTCGCTGAAATTCTGGACCGA LysAlaLysLeuMetProGlnLeuProGlyIleProPheValSerCysGlnArgGlyTyr 241 AAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGGGATCCCCTTTGTGTCCTGCCAGCGCGGGTA TTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGAAACACAGGACGGTCGCGCCCAT LysGlyValTrpArgVal 301 TAAGGGGGTCTGGCGAGTG ATTCCCCCAGACCGCTCAC

137 FIG. 12 Kloonin 40b DNA:n translaatio AlaTyrMetSerLysAlaHisGlyIleAspProAsnIleArgThrGlyValArgThrIle 1 GGCTTACATGTCCAAGGCTCATGGGATCGATCCTAAGATCAGGACCGGGGTGAGAACAAT CCGAATGTACAGGTTCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTA ThrThrGlySerProIleThrTyrSerThrTyrGlyLysPheLeuAlaAspGlyGlyCys 61 TACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTG ATGGTGACCGTCGGGGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCAC SerGlyGlyAlaTyrAspIleIleIleCysAspGluCysHisSerThrAspAlaThrSer 121 CTCGGGGGGCGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATC GAGCCCCCCGCGAATACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAG IleLeuGlyIleGlyThrValLeuAspG1nAlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuValVa1 181 CATCTTGGGCATCGGCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGT GTAGAACCCGTAGCCGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACA LeuAlaThrAlaThrProProGlySerValThrVa1ProHisProAsnIleGluGluVal 241 GCTCGCCACCGCCACCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGT CGAGCGGTGGCGGTGGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCA AlaLeuSerThrThrGlyGluIleProPheTyrGlyLysAlaIleProLeuGluValIle 301 TGCTCTGTCCACCACCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAAT- ACGAGACAGGTGGTGGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTA LysGlyGlyArgHisLeuIlePheCysHisSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAla 361 CAAGGGGGGGAGACATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGC GTTCCCCCCCTCTGTAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCG Päällekkäisyys kloonin 37b kanssa LysLeuValAlaLeuGlyIleAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAspValSerVal 421 AAAGCTGGTCGCATTGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGT TTTCGACCAGCGTAACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCA IleProThr 481 CATCCCGACCAG GTAGGGCTGGTC

138 F Kloonin 25c DNA:n translaatio CysSerLeuThrValThrGlnLeuLeuArgArgreuHisG1nTrpIleSerSerGluCys 1 ACTGCAGCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCTCGGAGT TGACGTCGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTGA. ThrThrProCysSerGlySerTrpLeuArgAspIleTrpAspTrpIleCYsGluValLeu 61 GTACCACTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGT CATGGTGAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACA Päällekkäisyys kloonin 33b kanssa SerAspPheLysThrTrpLeuLysAlaLysLeuMetProGlnLeuProGlyIleProPhe 121 TGAGCGACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGGGATCCCCT ACTCGCTGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGA ValSerCysGlnArgGlyTyrLysGlyValTrpArgGlyAspGlyIleMetHisThrArg 181 TTGTGTCCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGGGGACGGCATCATGCACACTC AACACAGGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCCCCTGCCGTAGTACGTGTGAG CysHisCysGlyAlaGluIleThrGlyHisValLysAsnGlyThrMetArgIleValGlY 241 GCTGCCACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAGGATCGTCG CGACGGTGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTCCTAGCAGC ProArgThrCysArgAsnMetTrpSerGlyThrPheProIleAsnAlaTyrThrThrGlY 301 GTCCTAGGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCTACACCACGG CAGGATCCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCC ProCysThrProLeuProAlaProAsnTyrThrPheAlaLeuTrpArgValSerAlaGlu 361 GCCCCTGTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTCTGCAG CGGGGACATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTpCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTC G1uTyrValGluileArgGlnValGlyAspPheHisTyrValThrGlyMetThrThrAsp 421 AGGAATATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTATGACTACTG TCCTTATACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATACTGATGAC AsnLeuLysCysProCysG1nValProSerProGluPhePheThrGlu 481 ACAATCTCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAAT TGTTAGAGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTA

139 W5652 FIG Kloonien 40b/37b/35/36/81/32/33b/25c DNA:oitten yhdistetty avoin lukualue AlaTyrMetSerLysAlaHisGlyIleAspProAsnIleArgThrGlyValArgThrIle 1 TGCTTACATGTCCAAGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAAT ACGAATGTACAGGTTCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTA ThrThrGlySerProIleThrTyrSerThrTyrGlyLysPheLeuAlaAspGlyGlyCys 61 TACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCWACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTG ATGGTGACCGTCGGGGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCAC SerGlyGlyAlaTyrAspllellelleCysAspGluCysHisSerThrAspAlaThrSer 121 CTCGGGGGGCGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATC GAGCCCCCCGCGAATACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAG IleLeuGlyIleGlyThrValLeuAspG1nAlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuValVa1 181 CATCTTGGGCATCGGCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGT GTAGAACCCGTAGCCGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACA LeuAlaThrAlaThrProProGlySerValThrValProHisProAsnIleGluGluVal 241 GCTCGCCACCGCCACCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGT CGAGCGGTGGCGGTGGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCA AlaLeuSerThrThrGlyGluIleProPheTyrGlyLysAlaIleProLeuGluValIle 301 TGCTCTGTCCACCACCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAAT ACGAGACAGGTGGTGGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTA LysGlyGlyArgHisLeuIlePheCysHisSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAla 361 CAAGGGGGGGAGACATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGC GTTCCCCCCCTCTGTAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCG LysLeuValAlaLeuGlyIleAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAspValSerVal 421 AAAGCTGGTCGCATTGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGT TTTCGACCAGCGTAACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCA IleProThrSerGlyAspValValValVa1A1aThrAspAlaLeuMetThrGlyTyrThr 481 CATCCCGACCAGCGGCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATAC GTAGGGCTGGTCGCCGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATG GlyAspPheAspSerValIleAspTyrAsnThrCysValThrGlnThrValAspPheSer 541 CGGCGACTTCGACTCGGTGATAGACTACAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCAG GCCGCTGAAGCTGAGCCACTATCTGATGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTC LeuAspProThrPheThrIleGluThrIleThrLeuProGlnAspAlaValSerArgThr 601 CCTTGACCCTACCTTCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCAC GGAACTGGGATGGAAGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTG GlnArgArgGlyArgThrGlyArgGlyLysProGiyIleTyrArgPheValAlaProGly 661 TCAACGTCGGGGCAGGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGG AGTTGCAGCCCCGTCCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCC GluArgProSerGlyMetPheAspSerSerValLeuCysGluCysTyrAspAlaGlyCys 721 GGAGCGCCCCTCCGGCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTG CCTCGCGGGGAGGCCGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGAC AlaTrpTyrGluLeuThrProAlaGluThrThrValArgLeuArgAlaTyrMetAsnThr 781 TGCTTGGTATGAGCTCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACAC ACGAACCATACTCGAGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTG ProGlyLeuProValCysGlnAspHisLeuGluPheTrpGluGlyValPheThrGlyLeu 841 CCCGGGGCTTCCCGTGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCT GGGCCCCGAAGGGCACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGA ThrHisIleAspAlaHisPheLeuSerG1nThrLysG1nSerGlyGluAsnLeuProTyr 901 CACTCATATAGATGCCCACTTTCTATCCCAGACAAAGC.AGAGTGGGGAGAACCTTCCTTA GTGAGTATATCTACGGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAAT

140 LeuValAlaTyrGlnAlaThrValCysAlaArgAlaGlnAlaProProProSerTrpAsp 961 CCTGGTAGCGTACCAAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGA GGACCATCGCATGGTTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCT GlnMetTrpLysCysLeuIleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeu 1021 CCAGATGTGGAAGTGTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCT GGTCTACACCTTCACAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGA TyrArgLeuGlyAlaValGlnAsnGluIleThrLeuThrHisProValThrLysTyrIle 1081 ATACAGACTGGGCGCTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACAT TATGTCTGACCCGCGACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTA MetThrCysMetSerAlaAspLeuGluValValThrSerThrTrpValLeuValGlYGly 1141 CATGACATGCATGTCGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGG GTACTGTACGTACAGCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCC ValLeuAlaAlaLeuAlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCysValValIleValGlyArg 1201 CGTCCTGGCTGCTTTGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAG GCAGGACCGACGAAACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTC ValValLeuSerG1yLysProA1aIleIleProAspArgGluValLeuTyrArgGluPhe 1261 GGTCGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTT CCAGCAGAACAGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAA AspGluMetGluGluCysSerGlnHisLeuProTyrIleGIuGlnGlyMetMetLeuAla 1321 CGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGC GCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCG G1uG1nPheLysGlnLysA1aLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArgGlnAlaGluVal 1381 CGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGT GCTCGTCAAGTTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCA IleAlaProAlaVa1G1nThrAsnTrpG1nLysLeuGluThrPheTrpA1aLysHisMet 1441 TATCGCCCCTGCTGTCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATAT ATAGCGGGGACGACAGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCITCGTATA TrpAsnPheIleSerG1yIleG1nTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnPro 1501 GTGGAACTTCATCAGINGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCC CACCTTGAAGTAGTCACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGG Ala IleAlaSerLeuMetAlaPheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGln 1561 CGCCATTGCTTCATTGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCA GCGGTAACGAAGTAACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGT ThrLeuLeuPheAsnIleLeuGlyGlyTrpValAlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAla 1621 AACCCTCCTCTTCAACATATTGGGGGGGTOGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGC TTGGGAGGAGAAGTTGTATAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACG AlaThrAlaPheValGlyAlaGlyLeuAlaGlyAlaAlaIleGlySerValGlyLeuGlY 1681 CGCTACTGCCTTTGTGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGG GCGATGACGGAAACACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCC LysValLeuIleAspIleLeuAlaGlyTyrGlyAlaGlyValAlaGlyAlaLeuValAla 1741 GAAGGTCCTCATAGACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGC CTTCCAGGAGTATCTGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCG PheLysIleMetSexG1yG1uValProSerThrGluAspLeuValAsnLeuLeuProAla 1801 ATTCAAGATCATGAGCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGC TAAGTTCTAGTACTCGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCG IleLeuSerProGiyAlaLeuValValGlyValValCysAlaAlaIleLeuArgArgHis 1861 CATCCTCTCGCCCGGAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCA GTAGGAGAGCGGGCCTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGT Fri( ValGlyProGlyG1uGlyA1aValGlnTrpMetAsnArgLeuIleA1aPheAlaSerArg

141 1921 CGTTGGCCCGGGCGAGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCG GCAACCGGGCCCGCTCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGC GlyAsnHisValSerProThrHisTyrValProGluSerAspAlaAlaAlaArgValThr 1981 GGGGAACCATGTTTCCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCAC CCCCTTGGTACAAAGGGGGTGCGTGATGCACGGCCfiCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTG AlaIleLeuSerSerLeuThrValThrGlnLeuLeuArgArgLeuHisG1nTrpIleSer 2041 TGCCATACTCAGCAGCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAG ACGGTATGAGTCGTCGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCqpTGACGTGGTCACCTATTC SerGluCysThrThrProCysSerGlySerTrpLeuArgAspIleTrPAspTrPIleCYs 2101 CTCGGAGTGTACCACTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATG GAGCCTCACATGGTGAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATAC GluValLeuSerAspPheLysThrTrpLeuLysAlaLysLeuMetProGlnLeuProGlY 2161 CGAGGTGTTGAGCGACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGG GCTCCACAACTCGCTGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACC IleProPheValSerCysGlnArgGlyTyrLysG1yValTrpArgValAspGlYIleMet 2221 GATCCCCTTTGTGTCCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCAT CTAGGGGAAACACAGGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTA HisThrArgCysHisCysGlyAlaGluIleThrGlyHisValLysAsnGlyThrMetArg 2281 GCACACTCGCTGCCACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAG CGTGTGAGCGACGGTGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTC IleValGlyProArgThrCysArgAsnMetTrpSerGlyThrPheProIleAsnAlaTyr 2341 GATCGTCGGTCCTAGGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCTA CTAGCAGCCAGGATCCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGAT ThrThrGlyProCysThrProLeuProAlaProAsnTyrThrPheAlaLeuTrpArgVal 2401 CACCACGGGCCCCTGTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGT GTGGTGCCCGGGGACATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCA SerAlaGluGluTyrValGluIleArgGlnliplGlyAspPheHisTyrValThrGlyMet 2461 GTCTGCAGAGGAATATGTGGAGATAAGGCAGGTGGCGGACTTCCACTACGTGACGGGTAT CAGACGTCTCCTTATACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATA ThrThrAspAsnLeuLyseysProCysG1nValProSerProGluPhePheThrGlu 2521 GACTACTGACAATCTCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAAT CTGATGACTGTTAGAGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTA FIG. 14-3

142 FIG. 15 Kloonin 33c DNA:n translaatio AlaValAspPheIleProValGluAsttLeuGluThrThrt4etArgSerProValPheThr 1 GGCGGTGGACTITATCCCTGTGGAGAACCTAGAGAC.AACCATGAGGTCCCCGGIGITCAC CCGCC.ACCTGAAATAGGGACACCTCTTGGATCTCTGITGGTACTCCAGGGGCCAC.AAGTG AspAsnSerSerProProValValProGlnSerPheGlnValAlaHisteullisAlaPro 61 GGATAACTCCTCTCCACC.AGTAGTGCCCCAGAGCTTCC.AGGTGGCTCACCTCC.A1GCTCC CCTATTGAGGAGAGGTGGTCATCACGGGGTCTCGAAGGTCCACCGAGTGGAGGTACGAGG ThrGlySerGlyLysSerThrLysValProAlaAlaTyrAlaAlaGlnGlyTyrLysVal 121 C.ACAGGCAGCGGCAAAAGCACC.AAGGTCCCGGCTGCATATGCAGCTCAGGGCTATAAGGT GTGTCCGTCGCCGTTITCGTGGITCCAGGGCCGACGTATACGTCGAGTCCCGATAITCCA LeuValLeuMnProSerValAlaAlaThrLeuGlyPheGlyAlaTyrMetSerLysAla 181 GCTAGTACTCAACCCCTCTGTIGCTGCAACACIGGGCTTTGGTGCTTACATGTCCAAGGC CGATCATGAGTIGGGGAGACAACGACGTTGTGACCCGAAACC.ACGAATGTACAGGITCCG Päällekkäisyys kloonin 40b ic rissa iiisglyileaspproasnileargthrg13rvalargthri1ethrthrglyserproile 241 TCAIGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCCCCAT AGTACCCIAGCTAGGAITGTAGTCCTGGCCCCACTCITGITAATGGTGACCGTCGGGGTA ThrTyrSerThrTyrGlyLysPheloeuAlaAspGlyGlyeysSeiGlyGlyAlaTyrAsp 301 CACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCGGGGGGCGCTIATGA GTGCATGAGGTGGATGCCGITCAAGGAACGGCTGCCGCCCACGAGCCCCCCGCGAATACT I le I le IleCysAspG lticysiti sserthraspalathrser IletLeuGly IleG lythr 361 CATAATAAITTGTGACGAGIGCCACTCCACGGA=C.ACATCCATCTTGGGCATIGGCAC GTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAGGTAGAACCCGTAACCGTG ValLeuAspG1nAlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuValValLeuAlaThrAlaThrPro 421 TGTC ITGTGCTCGCC.ACCGCCACCCC AC.AGGAACTGGITCGTCTCZGACGCCCCCGCTCTGACC.AAC.ACGAGCGGTGGCGGTGGGG ProGlySerValThrVal.ProillsProAs nileglugluvalalaleuserthrthrgly 481 TCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGTTGCTCTGTCCACCACCGG AGGCCCGAGGCAGTGAC.ACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCAACGAGACAGGTGGTGGCC GluIl eprophetyrglylysalaileproleugluval I lelysglyglyarghisleu 541 AGAGATCCCTITTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCG»GTAATCAAGGGGGGGAGACATCT TCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTAGTTCCCCCCCTCTGTAGA IlePheCysHisSe.rLysLysLysCysAspGluLeuAlaAlaLysLeuvalAlaLeuGly 601 CATCITCIGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGCAAAGCTGGTCGCATTGGG GTAGAAGACAGTAAGTITCITCTTCACGCTGCTTGAGCGGCGTITCGACCAGCGTAACCC I leas nal avalx1 atyrtyrargglyleuaspvals erval IleProThrSezG lyasp 661 CATCAATGCCG TGGCCTACTACCGCCATCTTGACGTGTCCGTCATCCCGACCAGCGGCGA GTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACIGCACAGGCAGTAGGGCTGGTCGCCGCT ValValValValAlaThrAspAlaLeubtetThrGlyTyrThrGlyAspPheAspSerVal 721 TGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATACCGGCGACTTCGACTCGGT ACAACAGCAGCACCGTIGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATGGCCGCTGAAGCTGAGCCA I leas pcysasnthrey, 781 GATAGACTGCAATACGTGTG CTATCTGACGTTATGCACAC

143 FIG. 16 Kloonin 8h DNA:n translaatio PrceysThrCyaGlySerSerAippLeuTyrLeuValThrArglilsAlaAspValIlePro 1 CTCCCTGCACI I'GCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTC GAGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGGAAATGGACCAG1r3CTCCGTGCGGCTACAGTAAG ValArgArgArgGlyAspSerArgGlySerLeuLeuSerProArgProileSerTyrLeu 61 CCGTGCGCCGGCGGGGIr3ATAGCAGGGGCAGCCTGCTGTCGCCCCGGCCCATTTCCTACT GGCACGCGGCCGCCCCACTATCGTCCCCGTCGGACGACAGCGGGGCCGGGTAAAGGATGA LysGlySerSerGlyGlyProLeuLeuCyaPronaGlyffisAlaValayIlePheArg 121 TGAAAGGCTCCTCGGGGGGTCCGCTGTXTGCCCCGCGGGGCACGCCGTGGGCATATTTA ACTIvrCCGAGGAGCCCCCCAGGCGACAACACGGGGCGCCCCGTGCGGCACCCGTATAAAT --Päällekkäisyys kloonin 33c AlaklaValCysThrArgGlyValAlaLyaAlaValAst>PheIleProValGluAsiLLeu 181 GGGCCGCGGTGTGCACCCGTGGAGTGGCTAAGGCGGTGGACTTTATCCCTGTGGAGAACC CCCGGCGCCACACGTGGGCACCTCACCGATTCCGCCACCTGAAATAGGGAC.ACCTCTTGG kanssa GluThrThrMet.ArgSerProValPhoThrAspAsnSer 241 TAGAGAC.AACCATGAGGTCCCCGGTGITCACGGATAACTCCTC ATCTCTGTTGGTACTCCAGGGGCCACAAGTGCCTAITGAGGAG FIG. 17 xloonin 7e DNA:n translaatio GlyTrpArgLeuLeuAlaProIleThrAlaTyrAlaGlnGln ihrkrgglyleuleugly 1 GGGGTGGAGGTIGCTGGCGCCCATCACGGCGTACGCCCAGC.AGACAAGGGGCCTCCTAGG CCCCACCTCCAACGACCGCGGGTAGTGCCGCATGOWGTCGTCTGTTCCCCGGAGGATCC CysileneThrSerLeuThrGlyArgAspLysAanGlaValGluGlyGluvalGlene 61 GTGC.ATAATCACCAGCCTAACTGGCCGGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGAT CACGTATTAGTGGTCGGATTGACCGGCCCTGTTITIGGTTCACCTCCC.ACTCCAGGTCTA ValSerThrAlaAlaGlzahrPheLeuAlaThreysIleAanGlyValCysTrpThrVal 121 TGTGTCAACTGCTGCCCAAACCTTCCTGGC.AACGTGCATCAAIGGGGTGTGCTGGACTGT ACACAGTTGACGACGGGTrTGGAAGGACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACCTGACA TyrHisGlyAlaGlyThrArgThrIleAlaSerProLysGlyloroValIleGlnMetTyr 181 CTACCACGGGGCCGGAACGAGGACCATCGCGTCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTA GATGGTGCCCCGGCCTTGCTCCTGGTAGCGCAGTGGGTTCCCAGGACAGTAGGTCTACAT ThrAsaValAspG1nAspLeuValGlyTrpProAlaProGlaGl7SerArgSerLeuThr 241 TACCAATGTAGACCAAGACCTTGTGGGCTGGCCCGCTCCGC.AAGGTAGCCGCTCATTGAC ATGGTTACATCTGGTTCTGGAACACCCGACCGGGCGAGGCGTTCCATCGGCGAGTAACTG --Päällekkäisyys kloonin 8h kanssa-- ProCysThrCysGlySerSerkspLeuTyrLeuValThrArgliis 301 ACCCTGC.ACTTGCGGCTeCTCGGACCTTdrACCTC;GTCACGAGGCACG TGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGGANUGGACCMTGCTCCGTGC

144 FIG. 18 Kloonin 14c DNA:n translaatio AsnMetTrpSerGlyThrPheProIleAsnAlaTyrThrThrGlyProCysThrProLeu _ 1 GP ACATGTGGAGTGGGACC?rCCCCATTAATGCCTACACCACC,GGCCCCTGTACCCCCCT CTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCCCGGGGACATCAGGCGA Päällekkäisyys kloonin 25C kanssa ProAlaProAsnTyrThrPheAlalauTrpArgValSerAlaGluGluTyrValGluIle 61 TCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTC1r.C.AGAGGAATACGTGGAGAT AGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTCTCCIVATGCACCTCTA ArgGlnValGlyAspPheMisTyrValThrGlyMetThrl'hrAspAsnLeuLysCysPro 121 AAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACCIGACGGGTAACTACTGAC.AATCTIAAATGOX TTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATACTGATGACTGTTAGAATTTACGGG CysGlaValProSerProGluPhePeThrGluLeuAs l alargleuillsargphe 181 GTGCCAGGTCCCATCGC=AATTTTT h pgyv CACAGAATTGGACGGGG TGCGCCTACATAGGTT CACGGTCCAGGGTAGCGGGC1 TAAAAAGTGIVITAACCTGCCCCACGCGGATGTATCCAA AlaProProCysLysProLeuLeuArgGluGluValSerPheArgValGlyLeuRisGlu 241 TGCGCCCCCCTGC.AAGCCCTTGCTGCGGGAGGAGGTATCATTCAGAGTAGGACTCCACGA ACGCGGGGGGACGTTCGGGAACGACGCCCTCCTCCATAGTAAGTCTCATCCMAGGTCCT TyrProValGlySerGlnLeuProCysGluProGluProAspValAlaValLeuThrSer 301 ATACCCGGTAGGGTCGCAATTACCTTGCGAGCCCGAACCGGACGTGGCCGTGMACGTC TATGGGCCATCCCAGCGTTAATGGAACGCTCGGGCTTGGCCTGCACCGGCAC.AACTGCAG MetLeuThrAspProSerHisIleThrAlaGluAlaAlaGlyArgArgLeuAlaArgGly 361 CATGCTCACTGATCCCTCCCATATAACAGCAGAGGCGGCCGGGCGAAGGTTGGCGAGGGG GTACGAGTGACTAGGGAGGGTATATTGTCGTCTCCGCCGGCCCGCTTCCAACCGCMCCC SerProProSerValAlaSerSerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSerLeuLysAla 421 ATCACCCCCCTCTGTGGCCAGCTCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCATCTCTCAAGGC TAGTGGGGGGAGACACCGGTCGAGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTAGAGAGTTCCG ThrCysThrAlaAsnHisAspSerProAsp 481 AACTTGCACCGCTAACCATGACTCCCCTGAT TTGAACGTGGCGATTGGTACTGAGGGGACTA

145 171G. 19 Kloonin 8f DNA:n translaatio Päällekkäisyys kloonin 14c kanssa-- SerSerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSerLeuLysAlaThrCysThrAlaAsnitis 1 AGCTCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCATCTCTCAAGGCAACTIGCACCGCTAACCAT TCGAGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTAGAGAGTTCCGTIGAACGTGGCGATTGGTA AspSerProAspAlaGltiLeuIleGluAlaAsnLeuLeuTrpArgGInGluMetGlyGly 61 GACTCCCCIGATGCTGAGCTCATAGAGGCCAACCTCCTATGGAGGCAGGAGATGGGCGGC CTGAGGGGACTACGACTCGAGTATCTCCGGTTGGAGGATACCTCCGTCCTCIACCCGCCG AsnIleThr ArgValGluSerGluAsnLysValVallleLeuAspSerPheAspProLeu 121 AAC.ATCACCAGGGTTGAGTCAGAAAAC.AAAGTGGTGATTCTGGACTCCTTCGATCCGCTT TTGTAGTGGTCCCAACTCAGTCTTTIGTTTCACCACTAAGACCTGAGGAAGCTAGGCGAA ValAlaGluGluAspGluArgGluneSe-rValProAlaGluIleLeuArgLysSerArg 181 GTGGCGGAGGAGGACGAGCGGGAGATCTCCGTACCCGCAGAAATCCTGCGGAAGTCTCGG CACCGCCTCCTCCTGCTCGCCCTCTAGAGGCATGGGCGTCTTTAGGACGCCTTCAGAGCC ArgPheAlaGlnAlaLeuProValTrpAlaArgProAsplyrAsnProProlAuValGlu 241 AGATTCGCCCAGGCCCTGCCCGTIVGGGCGCGGCCGGACTATAACCCCCCGCTAGTGGAG TCTAAGCGGGTCCGGGACGGGCAAACCCGCGCCGGCCTGATATTGGGGGGCGATCACCTC ThrTrpLysLysProMpTyrGltiProProValValHisGlyCysProLeuProProPro 301 ACGTGGAAAAAGCCCGACTACGAACCACCTGTGGTCCKTGGCTGTCCGCTTCCACCTCCA TGCACCTTTTTCGGGCTGATGCTTGGTGGACACCAGGTACCGACAGGCGAAGGTGGAGGT LysSerProProValPro 361 AAGTCCCCTCCTGTGCCG TTCAGGGGAGGACACGGC - F7 I Ck 20 Kloonin 33f DNA:n translaatio ValTrpAlaArgProAspTyrAsnProProLeuValGluThrTrpLysLysProkspTyr 1 CGTTTGGGCGCGGCCGGACTATAACCCCCCGCTAGTGGAGACGTGGAAAAAACCCGACTA GCAAACCCGCGCCGGCCTGATATTGGGGGGCGATCACCTCTGC.ACCTTTTTTGGGCTGAT Päällekkäisyys kloonin öf kanssa GluProProValValRisGlyCysProLeuProProProLysSerProProValProPro 61 CGAACCACCTGTGGTCCATGGCTGCCCGCTTCC.ACCTCCAAAGTCCCCTCCTGTGCCTCC GCTTGGTGGACACCAGGTACCGACGGGCGAAGGTGGAGGTTTCAGGGGAGGACACGGAGG ProArgLysLysArgThrValValLeuThrGluSerThrLeuSerThrAlaLeuAlaGlu 121 GCCTCGGAAGAAGCGGACGGTGGTCCTCACTGAATCAACCCTATCTACTGCCTIGGCCGA CGGAGCCTTCTTCGCCIGCC.ACCAGGAGTGACTTAGTTGGGATAGATGACGGAACCGGCT LeuAlaThrArgSerPheGlySerSerSerThrSerGlyIleThrGlyAspAsnThrThr 181 GCTCGCC.ACCAGAAGCITIGGCAGCTCCTCAACTICCGGCATTACGGGCGACAATACGAC CGAGCGGTGGTCPTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGTTATGCTG ThrSerSerGluProAlaProSecrGlyCyaProProAspSerAspAlaGluSerPha 241 AACATCCTCTGAGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTITGC TTGTAGGAGACTCGGGCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGAAACG

146 F=1G. 21 Kloonin 33g DNA:n translaatio AlaSerArgSerPheGlySerSerSerThrSerGlyIleThrGlyAspAsn'ThrThrThr 1 GCCTCCAGAAGCMGGCAGerCCTCAACTTCCGGCATTACGGGCGACAATACGACAACA CGGAGGIVTTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGITATGCTGTTGT Päällekkäisyys kloonin 33f kanssa SerSerGluProAlaProSerGlyCysProProAspSerAspAlaGluSerTyrSerSer 61 TCCTCTGAGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTATTCCTCC AGGAGACTCGGGCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGATAAGGAGG NetProProLeuG1uGlyGluProGlyAapProAspLeuSerAspGlySerTrpSerThr 121 ATGCCCCCCCTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCATGGTCAACG TACGGGGGGGACCZCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGitATCGCTGCCCAGTACCAGTTGC Va1SerSerGluAlaAsnAlaGluAspValValCysCysSert4etSerTyrSerTrpThr 181 GTCAGTAGTGAGGCC.AACGCGGAGGATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCTTACTCTTGGACA Ċ AGTCATCACTCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACGAGTIAC.AGAATGAGAACCTGT GlyAlaLeuValThrProCyzAlaAlaGluGluGlaLyaLeuProrleAsnAlaLeuSer 241 GGCGCACTCGTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAACIGOCCAkCAMGCACTAAGC CCGCGTGAGCAGTGGGGC.ACGCGGCGCCTIVITGTCPTTGACGGGTAGITACGTGATTCG AsnSerLeuLeuArgiiisHiaAsaLeuValTyrSerThrThrSerArgSer 301 AACTCGTTGCTACGTCACMAATTIGGTGTAIWCACC.ACCTCACGCAG= TTGAGC.AACGATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCAC F=10. 22! Kloonin 7f_DNA:n translaatio GlyThrTyrValTyrAsnHisLeuThrProLeuArgAspTrpAlaH1sAsnGlyLeuArg 1 GGCACCTATGTTTATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGCGA CCGTGGATACAAATATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACGCT AspLeuAlaValAlaValGluProValValPheSerG1nMetGluThrLysLeuIleThr 61 GATCTGGCCGTGGCTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCACG C TAGACCGGCACCGACATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTTTACCTCTGGTTCGAGTAGTGC TrpGlyAlaAspThrAlaA1aCysG1yAspIleIleAsnGlyLeuProValSerAlaArg 121 TGGGGGGCAGATACCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCCGC ACCCCCCGTCTATGGCGGCGCACGCCACTGTAGTAGTTGCCGAACGGACAAAGGCGGGCG A rgglyarggluileleuleuglyproalaaspglymetvalserlysglytrpargleu 181 AGGGGCCGGGAGATACTGCTCGGGCCAGCCGATGGAATGGTCTCCAAGGGTTGGAGGTTG T CCCCGGCCCTCTATGACGAGCCCGGTCGGCTACCTTACCAGAGGTTCCCAACCTCCAAC LeuAlaProIleThrAlaTyrAlaGlnG1nThrArgGlyLeuLeuGlyCysIleIleThr 241 CTGGCGCCCATCACGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTAGGGTGCATAATCACC GACCGCGGGTAGTGCCGCATGCGGGTCGTCTGTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGTGG Päällekkäisyys kloonin 7e kanssa S erleuthrglyargasplysasng1nva1g1ug1yg1uvalglnilevalserthrala 301 AGCCTAACTGGCCGGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTGCT T CGGATTGACCGGCCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGACGA AlaG1nThrPheLeuAlaThrCysIleAsnGlyValeysTrp 361 GCCCAAACCTTCCTGGCAACGTGCATCAATGGGGTGTGCTGG CGGGTTTGGAAGGACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACC

147 FIG. 23 Kloonin llb DNA:n translaatio GlyGlyVa1Va1LeuValGlyLeuMetAlaLeuThrLeuSerProTyrTyrLysArgTyr 1 GGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGACTCTGTC,ACCATATTACAAGCGCTAT CCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACTGAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATA I 1 es er Tr pcy sle utrptr pleug1ntyr PheLeuTitrArgVa 1G 1 ual ag lnleuhi s 61 ATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTCTGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCAC TAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAGACTGGTCTCACC TTCGCGTTGACGTG Va1TrpI1eProProLeuAsnValArgGlyG1yArgAspAlaVa1IleT,euLeuMetCys 121 GTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGCGCGACGCCGTCATCTTACTCATGTGT CACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCGCGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACA AlaValHisProThrLeuValPheAspileThrLysLeuLeuLeuAlaValPheGlYPro 181 GCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCAAATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCC CGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGTTTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGG LeuTrpIleLeuGlnAlaSerLeuLeuLysValProTyrPheValArgValGlnGlYLeu 241 CTTTGGATTCTTCAAGCCAGTTTGCTTAAAGTACCCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTT GAAACCTAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATGGGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAA LeuArgPheCysAlaLeuAlaArgLysMetIleGlyGlyHisTyrValG1nMetValile 301 CTCCGGTTCTGCGCGTTAGCGCGGAAGATGATCGGAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATC GAGGCCAAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGCCTCCGGTAATGCACGTTTACCAGTAG IleLysLeuGlyAlaLeuThrGlyThrTyrValTyrAsnHisLeuThrProLeuArgAsp 361 ATTAAGTTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTTATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGAC TAATTCAATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAAATATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTG Päällekkäisyys kloonin 7f kanssa TrpAlaHisAsnGlyLeuArgAspLeuAlaValAlaValGluProValValPheSerGln 421 TGGGCGCACAACGGCTTGCGAGATCTGGCCGTGGCTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAA ACCCGCGTGTTGCCGAACGCTCTAGACCGGCACCGACATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTT MetGluThrLysLeuIleThrTrpGly 481 ATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGC TACCTCTGGTTCGAGTAGTGCACCCCCCG

148 F1G. 24 Kloonin 14i DNA:n translaatio GluTyrValValLeULeuPheLeuLeuLeuAlaAspAlaArgValCysSerCysLeuTrp 1 GGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTICTGCTTGCAGACGCGCGCGTCTGCTCCTGCTTGT CCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCGCGCAGACGAGGACGAACA MetMetLeuLeuIleSerG1nAlaGluAlaAlaLeuG1uAsnLeuValIleLeuAsnAla 61 GGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGAACqTCGTAATACTTAATG CCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCTTGGAGCATTATGAATTAC AlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeuValSerPheLeuValPhePheCysPheAlaTrp 121 CAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCGTGTTCTTCTGCTTTGCAT GTCGTAGGGACCGGCCC'TGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGCACAAGAAGACGAAACGTA TyrLeuLysGlyLysTrpValProGlyAlaValTyrThrPheTyrGlyMetTrpProteu 181 GGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCTTCTACGGGATGTGGCCTC CCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGAAGATGCCCTACACCGGAG LeuLeuLeuLeuLeuA1aLeuProGlnArgAlaTyrAlaLeuAspThrGluVa1AlaAla 241 TCCTCCTGCTCCTGITGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGCTGGACACGGAGGTGGCCG AGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCGACCTGTGCCTCCACCGGC Päällekkäisyys kloonin llb kanssa-- SerCysGlyGlyValValLeuValGlyLeuMetAlaLeuThrLeuSer?roTyrTyrLys 301 CGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGACTCTGTCACCATATTAC.A GCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACTGAGAC.AGTGGTATAATGT ArgTyrIleSerTrpCysLeuTrpTrpLeuGln 361 AGCGCTATATCAGCTGGIGCTTGTGGTGGCTTCAGAA TCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCTT FIG. 25 Kloonin 39c DNA:n translaatio ProAlaProSerGlyCysProProAspSerAspAlaGluSerTyrSerSerMetProPro 1 CCAGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTATTCCTCCATGCCCCCC GGTCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGA4GCTGCGACTCAGGATAAGGAGGTACGGGGGG LeuGluGlyGluProGlyAspProAspLeuSerAspGlySerTrpSerThrValSerSer 61 CTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCATGGTCAACAGTCAGTAGT G ACCTCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTACCAGTTGTCAGTCATCA Päällekkäisyys kloonin 33g kanssa G lualaasnalagluaspvalvalcyscyssermetsertyrsertrpthrglyalaleu 121 GAGGCCAACGCGGAGGATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCCTACTCTTGGACAGGCGCACTC C TCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACGAGTTACAGGATGAGAACCTGTCCGCGTGAG V althrprocysalaalaglugluglnlysleuproileasnalaleuserasnserleu 181 GTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAACTGCCCATCAATGCACTGAGCAACTCGTTG C AGTGGGGCACGCGGCGCCTTCTTGTCTTTGACGGGTAGTTACGTGACTCGTTGAGCAAC L euarghishisasnleuvaltyrserthrthrserargseralacysglnargglnlys 241 CTACGTCACCACAATTTGGIGTATTCCACCACCTCACGCAGTGCTTGCCAAAGGCAGAAG G ATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCACGAACGGTTTCCGTCTTC L ysvalthrpheaspargleuglnvalleuaspserhistyrglnaspvalleulysglu 301 AAAGTCACATTTGACAGACTGCAAGTTCTGGACAGCCATTACCAGGACGTACTCAAGGAG T TTCAGTGTAAACTGTCTGACGTTCAAGACCTGTCGGTAATGGTCCTGCATGAGTTCCTC ValLysAlaAlaAlaSerLysValLysAlaAsnPhe 361 GTIAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTTC CAATTTCGTCGCCGCAGTTITCACTTCCGATTGAAG

149 FIG Kloonien 141/11b/7f/7e/8h/33c/40b/37b/35/36/81/32/33b/25c/14c/8f/33f/33g/39c DNA:oitten yhdistetty avoin lukualue G1uTyrVa1ValLeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspA1aArgVa1CysSerCysLeuTrp 1 GGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGCGCGTCTGCTCCTGCTTGT CCCTCATGCAGCAAGAGGAC.AAGGAAGACGAACGTCTGCGCGCGCAGACGAGGACGAACA MetMetLeuLeuIleSerGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsnLeuValIleLeuAsnAla 61 GGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGAACCTCGTAATACTTAATG CCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCTTGGAGCATTATGAATTAC AlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeWalSerPheLeuValPhePheCysPheA1aTrp 121 CAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCGTGTTCTTCTGCTTTGCAT GTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGCACAAGAAGACGAAACGTA TyrLeuLysGlyLysTrpValProGlyAlaValTyrThrPheTyrGlyMetTrpProLeu 181 GGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCTTCTACGGGATGTGGCCTC CCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGAAGATGCCCTACACCGGAG LeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuProGlnArgA1aTyrAlaLeuAspThrGluValAlaAla 241 TCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGCTGGACACGGAGGTGGCCG AGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCGACCTGTGCCTCCACCGGC -:-. SerCysGlyGlyValValLeuValGlyLeuMetAlaLeuThrLeuSerProTyrTyrLys 301 CGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGACTCTGTCACCATATTACA GCAGCAC.ACCGCC.ACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACTGAGAC.AGTGGTATAATGT ArgTyrIleSerTrpCysLeuTrpTrpLeuG1nTyrPheLeuThrArgValG1uAlaGln 361 AGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTCTGACCAGAGTGGAAGCGC TCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAGACTGGTCTCACCTTCGCG Leull svaltrp I leproproleuasnva L rgglyglyargaspalaval IleLeuLeu 421 AACTGC.ACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGCGCGACGCCGTCATCTTAC TTGACGTGCAC.ACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCMCCCCCGCGCTGCGGCAGTAGAATG MetCysAlaValHisProThrLeuValPheAspIleThrLysLetiLeuLeuAlaVa1Phe 481 TCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCAAATTGCTGCTGGCCGTCT AGTACACACGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGTTTAACGACGACCGGCAGA GlyProLeuTrpIleLeuGlnAlaSerLeuLeuLysValProTyrPheValArgValGln 541 TCGGACCCCTTTGGATTCTTAAGCCAGTTTGCTTAAAGTACCCTACTTTGTGCGCGTCC AGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATGGGATGAAACACGCGCAGG GlyLeuLeuArgPheCysAlaLeuAlaArgLysMetIleGlyGlyHisTyrValG1nMet 601 AAGGCCTTCTCCGGTTCTGCGCGTTAGCGCGGAAGATGATCGGAGGCCATTACGTGCAAA TTCCGGAAGAGGCCAAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGCCTCCGGTAATGCACGTTT valileilelysleuglyalaleuthrglythrtyrvaltyrasnhisleuthrproleu 661 TGGTCATCATTAAGTTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTTATAACCATCTCACTCCTC ACCAGTAGTAATTCAATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAATATTGGTAGAGTGAGGAG ArgAspTrpAlaHisAsnGlyLeuArgAspLeuAlaValAlaValGluProValValPhe 721 TTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGCGAGATCTGGCCGTGGCTGTAGAGCCAGTCGTCT AAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACGCTCTAGACCGGCACCGACATCTCGGTCAGCAGA SerG1nMetGluThrLysLeuI1eThrTrpG1yA1aAspThrAlaAlaCysGlyAspIle 781 TCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATACCGCCGCGTGCGGTGACA AGAGGGTTTACCTCTGGTTCGAGTAGTGCACCCCCCGTCTATGGCGGCGCACGCCACTGT IleAsnGlyLeuProValSerAlaArgArgGlyArgGluIleLeuLeuGlyProAlaAsp 841 TCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCCGCAGGGGCCGGGAGATACTGCTCGGGCC.AGCCG AGTAGTTGCCGAACGGACAAAGGCGGGCGTCCCCGGCCCkTATGACGAGCCCGGTCGGC GlyMetValSerLysGlyTrpArgLeuLeuAlaProIleThrAlaTyrAlaGlnG1nThr

150 901 ATGGAATGGTCTCCAAGGGGTGGAGGTTGCTGGCGCCCATCACGGCGTACGCCCAGCAGA TACCTTACCAGAGGTTCCCCACCTCCAACGACCGCGGGTAGTGCCGCATGCGGGTCGTCT ArgGlyLeuLeuGlyCysIleIleThrSerLeuThrGlyArgAspLysAsnG1nVa1G1u 961 CAAGGGGCCTCCTAGGGTGC,ATAATCACCAGCCTAACTGGCCGGGACAAAAACCAAGTGG GTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGTGGTCGGATTGACCGGCCCTGTTTTTGGTTCACC G1yG1uVa1GlnIleValSerThrAlaA1aG1nThrPheLeuAlaThrCysIleAsnGly 1021 AGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTGCTGCCCAAACCTTCCTGGCAACGTGCATCAATG TCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGACGACGGGTTTGGAAGGACCGTTGCACGTAGTTAC ValCysTrpThrValTyrHisG1yA1aGlyThrArgThrIleAlaSerProLysGlyPro 1081 GGGTGTGCTGGACTGTCTACCACGGGGCCGGAACGAGGACCATCGCGTCACCCAAGGGTC CCCACACGACCTGACAGATGGTGCCCCGGCCTTGCTCCTGGTAGCGCAGTGGGTTCCCAG ValIleGlnMetTyrThrAsnVlAspG1nAspLeuValGlyTrpProAlaProGlnG13, 1141 CTGTCATCCAGATGTATACCAATGTAGACCAAGACGTTGTGGGCTGGCCCGCTCCGCAAG GACAGTAGGTCTACATATGGTTACATCTGGTTCTGGAACACCCGACCGGGCGAGGCGTTC SerArgSerLeuThrProCysThreysGlySerSerAspLeuTyrLeuValThrArgHis 1201 GTAGCCGCTCATTGACACCCTGCACTTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGC CATCGGCGAGTAACTGTGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGGAAATGGACCAGTGCTCCG AlaAspValIleProValArgArgArgGlyAspSetrArgGlySerLeuLeuSerProArg 1261 ACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGGGGTGATAGCAGGGGCAGCCTGCTGTCGCCCC TGCGGCTACAGTAAGGGCACGCGGCCGCCCCACTATCGTCCCCGTCGGACGACAGCGGGG ProneSerTyrLeuLysaySerSerGlyGlyProLeuLeuCysProAlaG1pH/sAla 1321 GGCCCATTTCCTACTINGAAAGGCTCCTCGGGGGGTCCGCTGTTGTGCCCCGCGGGGCACG CCGGGTAAAGGATGAACTTTCCGAGGAGCCCCCCAGGCGACAACACGGGGCGCCCCGTGC. ValG ly I 1 epheargal aal avalcysthrargglyvalklalysalavalaspphei 1 e 1381 CCGTGGGCATATTTAGG=CGGTGTGCACCCGTGGAGTGGCTAAGGCGGTGGACTTTA GGCACCCGTATAAATCCCGGCGCCACACGTGGGCACCTCACCGATTCCGCCACCTGAAAT ProValGluAsnLeuGluThrThrMetArgSerPröValPheThrAspAsnSerSerPro 1441 TCCCTGTGGAGAACCTAGAGACAACCATGAGGTCCCCGGTGTTCACGGATAACTCCTCTC AGGGAC.ACCTCTTGGATCTCTGTTGGTACTCCAGGGGCCACAAGTGCCTATTGAGGAGAG PröValVa1ProanSerPheGinVa1AlaHisLeulasA1aProThrUySerGlytys 1501 CACCAGTAGTGCCCCAGAGCTTCCAGGTGGCTCACCTCCATGCTCCCACAGGCAGCGGCA GTGGTCATCACGGGGTCTCGAAGGTCCACCGWTGGAGGTACGAGGGTGTCCGTCGCCGT SerThrLysValProAlaAlaTyrAlaAlaGlnGlyTyrLysValLeuValLeuAsnPro 1561 AAAGCACCAAGGTCCCGGCTGCATATGCAGCTCAGGGCTATAAGGTGCTAGTACTCAACC TTTCGTGGTTCCAGGGCCGACGTATACGTCGAGTCCCGATATTCCACGATCATGAGTTGG SerValAlaAlaThrLeuGlyPheGlyAlaTyrMetSerLysAlaH1sGlyIleAspPro 1621 CCTCTGTTGCTGCAACACTGGGCTTTGGTGCTTACATGTCCAAGGCTCATGGGATCGATC GGAGACAACGACGTTGTGACCCGAAACCACGAATGTACAGGTTCCGAGTACCCTAGCTAG AsnIleArgThrGlyVa1ArgThrI1eThrThrGlySerProIleThrTyrSerThrTyr 1681 CTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCT G ATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTAATGGTGACCGTCGGIGGTAGTGCATGAGGTGGA G lylyspheleualaaspglyglycysserglyglyalatyraspileileilecysasp 1741 ACGGC.AAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCGGGOGGCGCTTATGACATAATAATTTGTG TGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCACGAGCCCCCCGCGAATACTGTATTATTAAACAC G lucyshisserthraspalathrserileleuglyileglythrvalleuaspg1nala 1801 ACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATCCATCTTGGGCATCGGCACTGTCCTTGACCAAG T GCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAGGTAGAACCCGTAGCCGTGACAGGAACTOGTTC G luthralaglyalaargleuvalvalleualathralathrproproglyservalthr 1861 CAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGTGCTCGCCACCGCCACCCCTCCGGGCTCCGTCA G TCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACACGAGCGGTGGCGGTGGGGAGGCCCGAGGCAGT FIG

151 ValProHisProAsnI1eGluG1uValAlaLeuSerThrThrGlyGluIleProPheTyr 1921 CTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGTTGCTCTGTCCACCACCGGAGAGATCCCTTTTT GACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCAACGAGACAGGTGG'TGGCCTCTCTAGGGAAAAA G1pLysAlaIleProLeuGluValIleLysG1yGlyArgHisLeuIlePheCysHisSer 1981 ACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAATCAAGGGGGGGAGACATCTCATCTTCTGTCATT TGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTAGTTCCCCCCCTCTGTAGAGTAGAAGACAGTAA LysLysLysCysAspGluLeuAlaAlaLysLeuValAlaLeuGlyIleAsnAlaValAla 2041 CAAAGAAGAAGTQCGACGAACTCGCCGCAAACTGGTCGCATTGGGCATCAATGCCGTGG GTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCGTTTCGACCAGCGTAACCCGTAGTTACGGCACC TyrTyrArgGlyLeuAspValSerValIleProThrSerGlyAspValValValValAla 2101 CCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGTCATCCCGACCAGCGGCGATGTTGTCGTCGTGG GGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCAGTAGGGCTGGTCGCCGCTACAACAGCAGCACC ThrAspAlaLeuMetThrGlyTyrThrG1yAspPheAspSerValIleAspCysAsnThr 2161 CAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATACCGGCGACTTCGACTCGGTGATAGACTGCAATA GTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATGGCCGCTGAAGCTGAGCCACTATCTGACGTTAT CysValThrG1nThrValAspPheSerLeuAspProThrPheThrIleGluThrIleThr 2221 CGTGWTCACCCAGACAGTCGATTTCAGCCTTGACCCTACCTTCACCATTGAGACAATCA GCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTCGGAACTGGGATGGAAGTGGTAACTCTGTTAGT LeuProGlflAspAlaVa1SerArgThrGlnArgArgGlyArgThrG1yArgG1pLysPro 2281 CGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCAGGACTGGCAGGGGGAAGC GCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGTCCTGACCGTCCCCCTTCG G1yI1eTyrArgPheValAlaProGlyGluArgProSerGlyMetPheAspSerSerVa CAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCGGCATGTTCGACTCGTCCG GTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGCCGTACAAGCTGAGCAGGC LeuCysGluCysTyrAspAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeuThrProAlaGluThrThr 2401 TCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGCTCACGCCCGCCGAGACTA AGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCGAGTGCGGGCGGCTCTGAT ValArgLeuArgAlaTyrMetAsnThrProGlyLeuProValCysGlnAspHisLeuGlu 2461 CAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCGTGTGCCAGGACCATCTTG GTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGCACACGGTCCTGGTAGAAC PheTrpG1uGlyVa1PheThrGlyLeuThrHisI1eAspAlaHisPheLeuSerG1nThr 2521 AATTTTGGGAGGGCGTCTITACAGGCCTCACTCATATAGATGCCCACTTTCTATCCCAGA TTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTACGGGTGAAAGATAGGGTCT LysG1nSerGlyG1uAsnLeuProTyrLeuValAlaTyrGlnA1aThrValCysAlaArg 2581 CAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACCAAGCCACCGTGTGCGCTA GTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGGTTCGGTGGCACACGCGAT AlaGlnAlaProProProSerTrpAspG1nMetTrpLysCysLeuIleArgLeuLysPro 2641 GGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGTGTTTGATTCGCCTCAAGC CCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCACAAACTAAGCGGAGTTCG ThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeuå1yAlaValGlnAsnGluIleThr 2701 CCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCGCTGTTCAGAATGAAATCA GGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGCGACAAGTCTTACTTTAGT LeuThrHisProValThrLysTyrIleMetThrCysMetSerAlaAspLeuGluValVal 2761 CCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGCATGTCGGCCGACCTGGAGGTCG G GGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACAGCCGGCTGGACCTCCAGC T hrserthrtrpvalleuvalglyglyvalleualaalaleualaalatyrcysleuser 2821 TCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTTTGGCCGCGTATTGCCTGT A GTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAAACCGGCGCATAACGGACA T hrglycysvalvalilevalg1yargvalvalleuserglylysproalaileilepro FIG. 26-3

152 2881 CAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATCATAC GTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGCCCTTCGGCCGTTAGTATG AspArgGluValLeUTyrArgGluPheAspGluMetGluGluCysSerGlnHisLeuPro 2941 CTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTAC GACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTGAATG TyrIleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeu 3001 CGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCC GCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGG G1nThrAlaSerArgGlnAlaGluValIleAlaProAlaValGlnThrAsnTrpG1nLys 3061 TGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTGTCCAGACCAACTGGCAAA ACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGACAGGTCTGGTTGACCGTTT LeuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsnPheIleSerGlyIleGlnTyrLeuAla 3121 AACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCAGTGGGATACAATACTTGG TTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAÅGTAGTCACCCTATGTTATGAACC GlyLeuSerThrLeuProGlyAsnProAlaIleAlaSerLeuMetAlaPheThrAlaAla 3181 CGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTC,ATTGATGGCTTTTACAGCTG GCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTAACTACCGAAAATGTCGAC ValThrSerProLeuThrThrSerG1nThrLeuLeuPheAsnIleLeuGlyGlyTrpVal 3241 CTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCAACATATTGGGGGGGTGGG GACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGTTGTATAACCCCCCCACCC AlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAlaAlaThrAlaPheValGlyAlaGlyLeuAlaGly 3301 TGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTGTGGGCGCTGGCTTAGCTG ACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAACACCCGCGACCGAATCGAC AlaAlalleGlySerValGlyLeuGlyLysValLeulleAsplleLeuAlaGlyTyrGly 3361 GCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAGACATCCTTGCAGGGTATG CGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATCTGTAGGAACGTCCCATAC AlaGlyValAlaGlyAlaLeuValAlaPheLysIleMetSerGlyGluValProSerThr 3421 GCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGAGCGGTGAGGTCCCCTCCA CGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACTCGCCACTCCAGGGGAGGT GluAspLeuValAsnLeuLeuProAlaIleLeuSerProGlyAlaLeuValValGlyVal 3481 CGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCGGAGCCCTCGTAGTCGGCG GCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGCCTCGGGAGCATCAGCCGC Va1CysAlaAlaIleLeuArgArgHisValGlyProGlyGluGlyAlaValG1nTrpMet 3541 TGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCGAGGGGGCAGTGCAGTGGA ACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGCTCCCCCGTCACGTCACCT AsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArgGlyAsnHisValSerProThrHisTyrValPro 3601 TGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTTCCCCCACGCACTACGTGC ACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAAGGGGGTGCGTGATGCACG GluSerAspAlaAlaAlaArgValThrAlaIleLeuSerSerLeuThrValThrGlnLeu 3661 CGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCACTGCCATACTCAGCAGCCTCACTGTAACCCAGC GCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTGACGGTATGAGTCGTCGGAGTGACATTGGGTCG LeuArgArgLeuHisG1nTrpIleSerSerGluCysThrThrProCysSerGlySerTrp 3721 TCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCTCGGAGTGTACCACTCCATGCTCCGGTTCCT AGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTCACATGGTGAGGTACGAGGCCAAGGA LeuArgAspIleTrpAspTrpIleCysGluValLeuSerAspPheLysThrTrpLeuLys 3781 GGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGTTGAGCGACTTTAAGACCTGGCTAA CCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACAATCGCTGAAATTCTGGACCGATT AlaLysLeuMetProGlnLeuProGlyIleProPheValSereysGlnArgGlyTYrLys 3841 AAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGGGATCCCCTTTGTGTCCTGCCAGCGCGGGTATA TTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGAAACACAGGACGGTCGCGCCCATAT FIG. 26-4

153 GlyValTrpArgValAspGlyIleMetHisThrArgCysHisCysGlyAlaGluIleThr 3901 AGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCATGCACACTCGCTGCCACTGTGGAGCTGAGATCA TCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTACGTGTGAGCGACGGTGACACCTCGACTCTAGT GlyHisValLysAsnGlyThrMetArgIleValGlyProArgThrCysArgAsnMetTrp 3961 CTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAGGATCGTCGGTCCTAGGACCTGCAGGAACATGT GACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTCCTAGCAGCCAGGATCCTGGACGTCCTTGTACA SerGlyThrPheProIleAsnAlaTyrThrThrGlyProCysThrProLeuProAlaPro 4021 GGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCTACACCACGGGCCCCTGTACCCCCCTTCCTGCGC CCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCCCGGGGACATGGGGGGAAGGACGCG AsnTyrThrPheAlaLeuTrpArgValSerAlaGluGluTyrValGluIleArgGlnVal 4081 CGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTCTGCAGAGGAATATGTGGAGATAAGGCAGG GCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTCTCCTTATACACCTCTATTCCGTCC GlyAspPheHisTyrValThrGlyMetThrThrikspAsnLeuLysCysProCysG1nVal 4141 TGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTATGACTACTGACAATCTCAAATGCCCGTGCCAGG - ACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATACTGATGACTGTTAGAGTTTACGGGCACGGTCC ProSerProGluPhePheThrGluLeuAspGlyValArgLeuHisArgPheAlaProPro 4201 TCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAATTGGACGGGGTGCGCCTACATAGGTTTGCGCCCC AGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTAACCTGCCCCACGCGGATGTATCCAAACGCGGGG CysLysProLeuLeuArgGluGluValSerPheArgValGlyLeuHisGluTyrPrdVal 4261 CCTGCAAGCCCTTGCTGCGGGAGGAGGTATCATTCAGAGTAGGACTCCACGAATACCCGG GGACGTTCGGGAACGACGCCCTCCTCCATAGTAAGTCTCATCCTGAGGTGCTTATGGGCC GlySerGlnLeuProCysG1uProGluProAspValAlaValLeuThrSerMetLeuThr 4321 TAGGGTCGCAATTACCTTGCGAGCCCGAACCGGACGTGGCCGTGTTGACGTCCATGCTCA ATCCCAGCGTTAATGGAACGCTCGGGCTTGGCCTGCACCGGCACAACTGCAGGTACGAGT AspP roserh 1811 et'hral aglualaal aglyargarg Le ual aargglyserpropro 4381 C'TGATCCCTCCCATATAACAGCAGAGGCGGCCGGGCGAAGGTTGGCGAGGGGATCACCCC GACTAGGGAGGGTATATTGTCGTCTCCGCCGGCCCGCTTCCAACCGCTCCCCTAGTGGGG SerValAlaSerSerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSerLeuLysAlaThreysThr 4441 CCTCTGTGGCCAGCTCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCATCTCTCAAGGCAACTTGCA GGAGACACCGGTCGAGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTAGAGAGTTCOGTTGAACGT AlaAsnHisAspSerProAspA1aGluLeuIleG1uAlaAsnLeuLeuTrpArgGlnGlu 4501 CCGCTAACCATGACTCCCCTGATGCTGAGCTCATAGAGGCCAACCTCCTATGGAGGCAGG GGCGATTGGTACTGAGGGGACTACGACTCGAGTATCTCCGGTTGGAGGATACCTCCGTCC MetGlyG1yAsnIleThrArgValGluSerGluAsnLysValValIleLeuAspSerPhe 4561 AGATGGGCGGCAACATCACCAGGGTTGAGTCAGAAAACAAAGTGGTGATTCTGGACTCCT TCTACCCGCCGTTGTAGTGGTCCCAACTCAGTCTTTTGTTTCACCACTAAGACCTGAGGA AspProLeuValAlaGluGluAspGluArgGluIleSerValProAlaGluIleLeuArg 4621 TCGATCCGCTTGTGGCGGAGGAGGACGAGCGGGAGATCTCCGTACCCGCAGAAATCCTGC AGCTAGGCGAACACCGCCTCCTCCTGCTCGCCCTCTAGAGGCATGGGCGTCTTTAGGACG LysSerArgArgPheAlaGlnAlaLeuProValTrpAlaArgProAspTyrAsnProPro 4681 GGAAGTCTCGGAGATTCGCCCAGGCCCTGCCCGTTTGGGCGCGGCCGGACTATAACCCCC CCTTCAGAGCCTCTAAGCGGGTCCGGGACGGGCAAACCCGCGCCGGCCTGATATTGGGGG LeuValGluThrTrpLysLysProAspTyrGluProProValValHisGlyCysProLeu 4741 CGCTAGTGGAGACGTGGAAAAAGCCCGACTACGAACCACCTGTGGTCCATGGCTGTCCGC GCGATCACCTCTGCACCTTTTTCGGGCTGATGCTTGGTGGACACCAGGTACCGACAGGCG ProProProLysSerProProValProProProArgLysLysArgThrValValLeuThr 4801 TTCCACCTCCAAAGTCCCCTCCTGTGCCTCCGCCTCGGAAGAAGCGGACGGTGGTCCTCA AAGGTGGAGGTTTCAGGGGAGGACACGGAGGCGGAGCCTTCTTCGCCTGCCACCAGGAGT GluSerThrLeuSerThrAiaLeuAlaGluLeuklaThrArgSerPheGlYSerSerSer FIG. 26-5

154 4861 CTGAATCAACCCTATCTACTGCCTTGGCCGAGCTCGCCACCAGAAGCTTTGGCAGCTCCT GACTTAGTTGGGATAGATGACGGAACCGGCTCGAGCGGTGGTCTTCGAAACCGTCGAGGA ThrSerGlyI1eThrGlyAspAsnThrThrThrSerSerGluProAlaProSerGlyCys 4921 CAACTTCCGGCATTACGGGCGACAATACGACAACÄTCCTCTGAGCCCGCCCCTTCTGGCT GTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGTTATGCTGTTGTAGGAGACTCGGGCGGGGAAGACCGA ProPraAspSerAspAlaG1uSeiTyrSerSerMetProProLeuGluGlyGluProGly 4981 GCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTATTCCTCCATGCCCCCCCTGGAGGGGGAGCCTG CGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGATAAGGAGGTACGGGGGGGACCTCCCCCTCGGAC AspProAspLeuSerAspGlySerTrpSerThrValSerSerG1uAlaAsnAlaGluAsp 5041 GGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCATGGTCAACGGTCAGTAGTGAGGCCAACGCGGAGG CCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTACCAGTTGCCAGTCATCACTCCGGTTGCGCCTCC ValVa1CysCysSerMetSerTyrSerTrpThrGlyAlaLeuValThrProCysAlaAla 5101 ATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCTTACTCTTGGACAGGCGCACTCGTCACCCCGTGCGCCG TACAGCACACGACGAGTTACAGAATGAGAACCTGTCCGCGTGAGCAGTGGGGCACGCGGC augluglnlysleupro/leasnalaleuserasnserleuleuarghishisasnleu 5161 CGGAAGAACAGAAACTGCCCATCAATGCACTAAGCAACTCGTTGCTACGTCACCACAATT GCCTTCTTGTCTTTGACGGGTAGTTACGTGATTCGTTGAGCAACGATGCAGTGGTGTTAA ValTyrSerThrThrSerArgSerAlaCysGlnArgGlnLysLyaValThrPheAspArg 5221 TGGTGTATTCCACCACCTCACGCAGTGCTTGCCAAAGGCAGAAGAAAGTCACATTTGACA ACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCACGAACGGTTTCCGTCTTCTTTCAGTGTAAACTGT LeuGlnValLeuAspSerHisTyrGlnAspValLeuLysGluValLysAlaAlaAlaSer 5281 GACTGCAAGTTCTGGACAGCCATTACCAGGACGTACTCAAGGAGGTTAAAGCAGCGGCGT CTGACGTTCAAGACCTGTCGGTAATGGTCCTGCATGAGTTCCTCCAATTTCGTCGCCGCA LysValLysAlaAsnLeu 5341 CAAAAGTGAAGGCTAACTTG GTTTTCACTTCCGATTGAAC FIG

155 FIG. 2 7 Kloonin 12f DNA:n translaatio IlePheLysI1eArgMetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeuGluAlaA1aCysAsn 1 CCATATTTAAAATCAGGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCA GGTATAAATTTTAGTCCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGT TrpThrArgglyGluArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeu 61 ACTGGACGCGGGGCGAACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGT TGACCTGCGCCCCGCTTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCA LeuLeuThrThrThrG1nTrpG1nValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeu 121 TACTGCTGACCACTACACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCT ATGACGACTGGTGATGTGTdACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGA SerThrGlyLeuIleHisLeuHisG1nAsnI1eValAspValG1nTyrLeuTyrGlyVal 181 TGTCCACCGGCCTCATCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGG ACAGGTGGCCGGAGTAGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCC GlySerSerIleAlaSerTrpAlaIleLysTrpGluTyrValValLeuLeuPheLeuLeu 241 TGGGGTCAAGCATCGCGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTC ACCCCAGTTCGTAGCGCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAG LeuAlaAspAlaArgValCysSerCysLeuTrpMetMetLeuLeuIleSerGlnAlaGlu 301 TGCTTGCAGACGCGCGCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGG ACGAACGTCTGCGCGCGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCC Päällekkäisyys kloonin 14i kanssa AlaAlaLeuGluAsnLeuValIleLeuAsnAlaAlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeu 361 AGGCGGCTTTGGAGAACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTC TCCGCCGAAACCTCTTGGAGCATTATGAATTACpTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAG Val 421 TTGTATC AACATAG

156 FIG. 28 Kloonin 35f DNA:n translaatio Päällekkäisyys kloonin 39ckanssa LeuLysGluValLysAlaAlaAlaSerLysValLysAlaAsnLeuLeuSerVa1GluGlu 1 TGCTCAAGGAGGTTAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTTGCTATCCGTAGAGG ACGAGTTCCTCCAATTTCGTCGCCGCAGTTTTCACTTCCGATTGAACGATAGGCATCTCC AlaCysSerLeuThrProProHisSerAlaLysSerLysPheGlyTyrGlyAlaLysAsp 61 AAGCTTGCAGCCTGACGCCCCCACACTCAGCCAAATCCAAGTTTGGTTATGGGGCAAAAG TTCGAACGTCGGACTGCGGGGGTGTGAGTCGGTTTAGGTTCAAACCAATACCCCGTTTTC ValArgCysHisAlaArgLysAlaValThrHisIleAsnSerValTrpLysAspLeuLeu 121 ACGTCCGTTGCCATGCCAGAAAGGCCGTAACCCACATCAACTCCGTGTGGAAAGACCTTC TGCAGGCAACGGTACGGTCTTTCCGGCATTGGGTGTAGTTGAGGCACACCTTTCTGGAAG G1uAspAsnValThrProIleAspThrThrI1eMetAlaLysAsnGluValPheCysVal 181 TGGAAGACAATGTAACACCAATAGACACTACCATCATGGCTAAGAACGAGGTTTTCTGCG ACCTTCTGTTACATTGTGGTTATCTGTGATGGTAGTACCGATTCTTGCTCCAAAAGACGC G1nProGluLysGlyGlyArgLysProAlaArgLeuIleValPheProAspLeuGlyVal 241 TTCAGCCTGAGAAGGGGGGTCGTAAGCCAGCTCGTCTCATCGTGTTCCCCGATCTGGGCG AAGTCGGACTCTTCCCCCCAGCATTCGGTCGAGCAGAGTAGCACAAGGGGCTAGACCCGC ArgValCysGluLysMetAlaLeuTyrAspValValThrLysLeuProLeuAlaValMet 301 TGCGCGTGTGCGAAAAGATGGCTTTGTACGACGTGGTTACAAAGCTCCCCTTGGCCGTGA ACGCGCACACGCTTTTCTACCGAAACATGCTGCACCAATGTTTCGAGGGGAACCGGCACT GlySerSerTyrGlyPheGlnTyrSerProGlyGlnArgValGluPheLeuValGlnAla 361 TGGGAAGCTCCTACGGATTCCAATACTCACCAGGACAGCGGGTTGAATTCCTCGTGCAAG ACCCTTCGAGGATGCCTAAGGTTATGAGTGGTCCTGTCGCCCAACTTAAGGAGCACGTTC TrpLysSerLysLysThrProMetGlyPheSrTyrAspThrArgCysPheAspSerThr 21 CGTGGAAGTCCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCA GCACCTTCAGGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTATGGGCGACGAAACTGAGGT ValThrGluSerAspIleArgThrGluGluAla 481 CAGTCACTGAGAGCGACATCCGTACGGAGGAGGCA - GTCAGTGACTCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGT

157 F I G. 2 9 Kloonin 19g DNA:n translaatio GluPheLeuValGlnAlaTrpLysSerLysLysThrProMetGlyPheSerPyrAspThr 1 GAATTCCTCGTGCAAGCGTGGAAGTCCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGATACC CTTAAGGAGCACGTTCGCACCTTCAGGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTATGG Päällekkäisyys kloonin 35f kanssa ArgCysPheAspSerThrValThrGluSerAspIleArgThrGluGluAlaIleTyrGln 61 CGCTGCTTTGACTCCACAGTCACTGAGAGCGACATCCGTACGGAGGAGGCAATCTACCAA GCGACGAAACTGAGGTGTCAGTGACTCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGTTAGATGGTT CysCysAspLeuAspProGlnAlaArgValAlaIleLysSerLeuThrGluArgLeuTyr 121 TGTTGTGACCTCGACCCCCAAGCCCGCGTGGCCATCAAGTCCCTCACCGAGAGGCTTTAT ACAACACTGGAGCTGGGGGTTCGGGCGCACCGGTAGTTCAGGGAGTGGCTCTCCGAAATA ValGlyGlyProLeuThrAsnSerArgGlyGluAsnCysGlyTyrArgArgCysArgAla 181 GTTGGGGGCCCTCTTACCAATTCAAGGGGGGAGAACTGCGGCTATCGCAGGTGCCGCGCG CAACCCCCGGGAGAATGGTTAAGTTCCCCCCTCTWACGCCGATAGCGTCCACGGCGCGC SerGlyValLeuThrThrSerCysGlyAsnThrLeuThrCysTyr/leLysAlaArgAla 241 AGCGGCGTACTGACAACTAGCTGTGGTAACACCCTCACTTGCTAC,ATCAAGGCCCGGGCA TCGCCGCATGACTGTTGATCGACACCATTGTGGGAGTGAACGATGTAGTTCCGGGCCCGT AlaCysArgAlaAlaGlyLeuGlnAspCysTh.rMetLeuValCysGlyAspAspLeuVal 301 GCC'TGTCGAGCCGCAGGGCTCCAGGACTGCACCATGCTCGTGTGTGGCGACGACTTAGTC CGGACAGCTCGGCGTCCCGAGGTCCTGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAATCAG ValIleCysGluSerAlaGlyValGlnGluAspAlaAla 361 GTTATCTGTGAA.AGCGCGGGGGTCCAGGAGGACGCGGCGAG CAATAGACACTTTCGCGCCCCCAGGTCCTCCTGCGCCGCTC

158 F I G. 30 Kloonin 26g DNA:n translaatio GlyGlyGluAsnCysGlyTyrArgArgCysArgAlaSerGlyValLeuThrThrSerCys 1 GGGGGGGAGAACTGCGGCTATCGCAGGTGCCGCGCAAGCGGCGTACTGACAACTAGCTGT CCCCCCCTCTTGACGCCGATAGCGTCCÄCGGCGCGTTCGCCGCATGACTGTTGATCGACA G1yAsnThrLeuThrCysTyrIleLysAlaArgAlaAlaCysArgA1aAlaGlyLeuGln 61 GGTAACACCCTCACTTGTTACATCAAGGCCCGAGCAGCCTGTCGAGCCGCAGGGCTCCAG CCATTGTGGGAGTGAACAATGTAGTTCCGGGCTCGTCGGACAGCTCGGCGTCCCGAGGTC Päällekkäisyys kloonin 19g kanssa AspCysThrMetLeuValCysGlyAspAspLeuValValIleCysGluSerAlaGlyVal 121 GACTGCACCATGCTCGTGTGTGGCGACGACTTAGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGGGTC CTGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAATCAGCAATAGACACTTTCGCGCCCCCAG GinGluAspAlaAlaSerLeuArgAlaPheThrGluAlaMetThrArgTyrSerAlaPro 181 CAGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTeACGGAGGCTATGACCAGGTACTCCGCCCCC GTCCTCCTGCGCCGCTCGGACTCTCGGAAGTGCCTCCGATACTGGTCCATGAGGCGGGGG ProGlyAspProProG1nProG1uTyrAspLeuGluLeuIleThrSerCysSerSerAsn 241 CCTGGGGACCCCCCACAACCAGAATACGACTTGGAGCTCATAACATCATGCTCCTCCAAC GGACCCCTGGGGGGTGTTGGTCTTATGCTGAACCTCGAGTATTGTAGTACGAGGAGGTTG ValSerValAlaHisAspG1yA1aG1yLysArgVa1TyrTyrLeuThrArgAspProThr 301 GTGTCAGTCGCCCACGACGGCGCTGGAAAGAGGGTCTACTACCTCACCCGTGACCCTACA CACAGTCAGCGGGTGCTGCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGTGGGCACTGGGATGT ThrProLeuAlaArgAlaA1aTrpGluThrAlaArgHisThrProValAsnSerTrpLeu 361 ACCCCCCTCGCGAGAGCTGCGTGGGAGACAGCAAGACACACTCCAGTCAATTCCTGGCTA TGGGGGGAGCGCTCTCGACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTCAGTTAAGGACCGAT G1yAsnIleIleMetPheA1aProThrLeuTrpAla 421 GGCAACATAATCATGTTTGCCCCCACACTGTGGGCG CCGTTGTATTAGTACAAACGGGGGTGTGACACCCGC F I G. 31 Kloonin 15c DNA:n translaatio GlyAlaGlyLysArgValTyrTyrLeuThrArgAspProThrThrProLeuAlaArgAla 1 CGGCGCTGGAAAGAGGGTCTACTACCTCACCCGTGACCCTACAACCCCCCTCGCGAGAGC GCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGTGGGCACTGGGATGTTGGGGGGAGCGCTCTCG Päällekkäisyys kloonin 26g kanssa AlaTrpGluThrA1aArgHisThrProValAsnSerTrpLeuGlyAsnIleIleMetPhe 61 TGCGTGGGAGACAGCAAGACACACTCCAGTCAATTCCTGGCTAGGCAACATAATCATGTT ACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTCAGTTAAGGACCGATCCGTTGTATTAGTACAA AlaProThrLeuTxpAlaArgMetIleLeuMetThrHisPhePheSerValLeuIleAla 121 TGCCCCCACACTGTGGGCGAGGATGATACTGATGACCCATTTCTTTAGCGTCCTTATAGC ACGGGGGTGTGACACCCGCTCCTACTATGACTACTGGGTAAAGAAATCGCAGGAATATCG ArgAspG1nLeuG1uG1nAlaLeuAspCysGluIleTyrGlyA1aCysTyrSerIleGlu 181 CAGGGACCAGCTTGAACAGGCCCTCGATTGCGAGATCTACGGGGCCTGCTACTCCATAGA GTCCCTGGTCGAACTTGTCCGGGAGCTAACGCTCTAGATGCCCCGGACGATGAGGTATCT ProLeuAspLeuProProllelleGlnArgLeu 241 ACCACTTGATCTACCTCCAATCATTCAAAGACTC TGGTGAACTAGATGGAGGTTAGTAAGTTTCTGAG

159 FIG, 32-1 Kloonien 12f - 15e DNA:oitten yhdistetty avoin lukualue IlePheLysIleArgMetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeuGluAlaAlaCysAsn 1 CCATATTTAAAATCAGGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCA GGTATAAATTTTAGTCCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGT TrpThrArgGlyGluArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeu 61 ACTGGACGCGGGGCGAACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGT TGACCTGCGCCCCGCTTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCA LeuLeuThrThrThrG1nTrpG1nValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeu 121 TACTGCTGACCACTACACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCT ATGACGACTGGTGATGTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGA SerThrGlyLeuIleHisLeuHisGlnAsnIleValAspValG1nTyrLeuTyrGlyVal 181 TGTCCACCGGCCTCATCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGG ACAGGTGGCCGGAGTAGGIGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCC GlySerSerIleAlaSerTrpAlaIleLysTrpGluTyrValValLeuLeuPheLeuLeu 241 TGGGGTCAAGCATCGCGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTC ACCCCAGTTCGTAGCGCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAG LeuAlaAspAlaArgValCysSerCysLeuTrpMetMetLeuLeuIleSerGlnAlaGlu 301 TGCTTGCAGACGCGCGCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGG ACGAACGTCTGCGCGCGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCC A1aA1aLeuGluAsnLeuValIleLeuAsnAlaAlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeu 361 AGGCGGCTTTGGAGAACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTC TCCGCCGAAACCTCTTGGAGCATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAG Va 1S er PheLeuVa1 Phe PheCy s PheA 1 a Trp TyrLeuLy sg lylystrpva 1ProG ly 421 TTGTATCCTTCCTCGTGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCG AACATAGGAAGGAGCACAAGAAGACGAAACGTACCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGC Al avaltyrthrphetyrglymettrpproleuleuleuleuleuleualaleuprogln 481 GAGCGGTCTACACCTTCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCC CTCGCCAGATGTGGAAGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGG ArgAlaTyrAlaLeuAspThrGluVa la laal asercysglyg1 yvalvalleuva 1G 1 y 541 AGCGGGCGTACGCGCTGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCG TCGCCCGCATGCGCGACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGC LeuMetAlaLeuThrLeuSerProTyrTyrLysArgTyrIleSerTrpCysLeuTrpTrp 601 GGTTGATGGCGCTGACTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGT CCAACTACCGCGACTGAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCA LeuGlnTyrPheLeuThrArgValGluAlaGlnLeuHisValTrplleProProLeuAsn 661 GGCTTCAGTATTTTCTGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCA CCGAAGTCATAAAAGACMGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGT ValArgGlyG1yArgAspAlaVa1IleLeuLeuMet8ysAlaValHisProThrLeuVa1 721 ACGTCCGAGGGGGGCGCGACGCCGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGG TGCAGGCTCCCCCCGCGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACACGACATGTGGGCTGAGACC PheAspIleThrLysLeuLeuLeuAlaValPheGlyProLeuTrpIleLeuGlnAlaSer 781 TATTTGACATCACCAAATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCA ATAAACTGTAGTGGTTTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGT LeuLeuLysValProTyrPheValArgValGlnGlyLeuLeuArgPheCysAlaLeuAla 841 GTTTGCTTAAAGTACCCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTTCTCCGGTTCTGCGCGTTAG CAAACGAATTTCATGGGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAAGAGGCCAAGACGCGCAATC ArgLysMetIleGlyGlyHisTyrValG1nMetValIleIleLysLeuGlyAlaLeuThr 901 CGCGGAAGATGATCGGAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATCATTAAGTTAGGGGCGCTTA GCGCCTTCTACTAGCCTCCGGTAATGCACGTTTACCAGTAGTAATTCAATCCCCGCGAAT

160 GlyThrTyrValTyrAsnHisLeuThrProLeuArgAspTrpAlaHisAsnGlyLeuArg 961 CTGGCACCTATGTTTATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGC GACCG'TGGATACAAATATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACG AspLeuAlaValAlaValGluProValValPheSerG1nMetGluThrLysLeuIleThr 1021 GAGATCTGGCCGTGGCTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCA. CTCTAGACCGGCACCGACATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTTTACCTCTGGTTCGAGTAGT TrpG1yAlaAspThrAlaAlaCysGlyAspIleIleAsnGlyLeuProValSerAlaArg 1081 CGTGGGGGGCAGATACCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCC GCACCCCCCGTCTATGGCGGCGCACGCCACTGTAGTAGTTGCCGAACGGACAAAGGCGGG ArgGlyArgGluIleLeuLeuGlyProAlaAspGlyMetValSerLysGlyTrpArgLeu 1141 GCAGGGGCCGGGAGATACTGCTCGGGCCAG-CCGATGGAATGGTCTCCAAGGGGTGGAGGT CGTCCCCGGCCCTCTATGACGAGCCCGGTCGGCTACCTTACCAGAGGTTCCCCACCTCCA LeuAlaProIleThrAlaTyrAlaGlnGlnThrArgGlyLeuLeuGlyCysIleIleThr 1201 TGCTGGCGCCCATCACGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTAGGGTGCATAATCA ACGACCGCGGGTAGTGCCGCATGCGGGTCGTCTGTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGT SerLeuThrGlyArgAspLYsAsnG1nValGluGlyGluValG,lnIleValSerThrAla 1261 CCAGCCTAACTGGCCGGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTG GGTCGGATTGACCGGCCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGAC AlaG1nThrPheLeuAlaThrCysIleAsnGlyValCysTrpThrValTyrHisGlyAla 1321 CTGCCCAAACCTTCCTGGCAACGTGCATCAATGGGGTGTGCTGGACTGTCTACCACGGGG GACGGGTTTGGAAGGACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACCTGACAGATGGTGCCCC G1yThrArgThrIleAlaSerProLysGlyProVa1IleGlnMetTyrThrAsnValAsp 1381 CCGGAACGAGGACCATCGCGTCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATGTAG GGCCTTGCTCCTGGTAGCGCAGTGGGTTCCCAGGACAGTAGGTCTACATATGGTTACATC GlnAspLeuValGlyTrpProAlaProGlnGlySerArgSerLeuThrProCysThrCys 1441 ACCAAGACCTTGTGGGCTGGCCCGCTCCGCAAGGTAGCCGCTCATTGACACCCTGCACTT TGGTTCTGGAACACCCGACCGGGCGAGGCGTTCCATCGGCGAGTAACTGTGGGACGTGAA GlySerSerAspLeuTyrLeuValThrArgHisAlaAspValIleProValArgArgArg 1501 GCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGC CGCCGAGGAGCCTGGAAATGGACCAGTGCTCCGTGCGGCTACAGTAAGGGCACGCGGCCG GlyAspSerArgGlySerLeuLeuSerProArgProIleSerTyrLeuLysGlySerSer 1561 GGGGTGATAGCAGGGGCAGCCTGCTGTCGCCCCGGCCCATTTCCTACTTGAAAGGCTCCT CCCCACTATCGTCCCCGTCGGACGACAGCGGGGCCGGGTAAAGGATGAACTTTCCGAGGA GlyGlyProLeuLeuCysProAlaGlyHisAlaValGlyIlePheArgAlaAlaValCys 1621 CGGGGGGTCCGCTGTTGTGCCCCGCGGGGCACGCCGTGGGCATATTTAGGGCCGCGGTGT GCCCCCCAGGCGACAACACGGGGCGCCCCGTGGGCACCCGTATAAATCCCGGCGCCACA ThrArgGlyValAlaLysAlaValAspPheIleProValGluAsnLeuGluThrThrMet 1681 GCACCCGTGGAGTGGCTAAGGCGGTGGACTTTATCCCTGTGGAGAACCTAGAGACAACCA CGTGGGCACCTCACCGATTCCGCCACCTGAAATAGGGACACCTCTTGGATCTCTGTTGGT ArgSerProValPheThrAspAsnSerSerProProValValProGlnSerPheGlnVal 1741 TGAGGTCCCCGGTGTTCACGGATAACTCCTCTCCACCAGTAGTGCCCCAGAGCTTCCAGG ACTCCAGGGGCCACAAGTGCCTATTGAGGAGAGGTGGTCATCACGGGGTCTCGAAGGTCC AlaHisLeuHisAlaProThrGlySerGlyLysSerThrLysValProAlaAlaTyrAla 1801 TGGCTCACCTCCATGCTCCCACAGGCAGCGGCAAAAGCACCAAGG TCCCGGC TGCATATG ACCGAGTGGAGGTACGAGGGTGTCCGTCGCCGTPTTCGTGGTTCCAGGGCCGACGTATAC AlaGlnGlyTyrLysValLeuValLeuAsnProSerValAlaAlaThrLeuGlyPheGly 1861 CAGCTCAGGGCTATAAGGTGCTAGTACTCAACCCCTCTGTTGCTGCAACACTGGGCTTTG GTCGAGTCCCGATATTCCACGATCATGAGTTGGGGAGACAACGACGTTGTGACCCGAAAC AlaTytMetSerLysAlaHisGlyIleAspProAsnIleArgThrGlyValArgThrIle FIG. 32-2

161 1921 GTGCTTACATGTCCAAGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAA CACGAATGTACAGGTTCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTT ThrThrGlySerProIleThrTyrSerThrTyrGlyLysPheLeuAlaAspGlyGlyCys 1981 TTACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGT AATGGTGACCGTCGGGGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCA SerGlyGlyAlaTyrAspIleIleIleCysAspGluCysHisSerThrAspAlaThrSer 2041 GCTCGGGGGGCGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACAT CGAGCCCCCCGCGAATACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTA I1eLeuGlyIleGlyThrValLeuAspG1nAlaGluThrA1aGlyAlaArgLeuVa1Va CCATCTTGGGCATCGGCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTG GGTAGAACCCGTAGCCGTGAC.AGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAAC LeuAlaThrA1aThrProProGlySerVa1ThrValProHisProAsnIleG1uG1uVa TGCTCGCCACCGCCACCCCTCCGGGCTCCGTCAC TGCCCCATCCCAACATCGAGGAGG ACGAGCGGTGGCGGTGGGGAGGCCCGAGGCAGTGAACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCC AlaLeuSerThrThrGlyGluIleProPheTyrGlyLysAlaIleProLeuGluValIle 2221 TTGCTCTGTCCACCACCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAA AACGAGACAGGTGGTGGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATT LysGlyGlyArgHisLeuIlePheCysHisSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAla 2281 TCAAGGGGGGGAGACATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCG AGTTCCCCCCCTCTGTAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGC LysLeuValAlaLeuGlylleAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAspValSerVal 2341 CAAAGCTGGTCGCATTGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCG GTTTCGACCAGCGTAACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGC I lep rothrserglyaspva 1ValValValAlaThrAspAlaLeuMetThrGlyTyrThr 2401 TCATCCCGACCAGCGGCGATGTTGTCGTCG TGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATA AGTAGGGCTGGTCGCCGCTACAACAGCAGCACCG TTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATAT GlyAspPheAspSerValIleAspCysAsnThrCysValThrG1nThrValAspPheSer 2461 CCGGCGACTTCGACTCGGTGATAGACTGCAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCA GGCCGCTGAAGCTGAGCCACTATCTGACGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGT LeuAspProThrPheThrIleGluThrIleThrLeuProGlnAspAlaValSerArgThr 2521 GCCTTGACCCTACCTTCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCA CGGAACTGGGATGGAAGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGT GlnArgArgGlyArgThrGlyArgGlyLysProGlyneTyrArgPheValAlaProGly 2581 CTCAACGTCGGGGCAGGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGG GAGTTGCAGCCCCGTCCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCC G1uArgProSerGlyMetPheAspSerSerValLeuCysGluCysTyrAspAlaGlyCys 2641 GGGAGCGCCCCTCCGGCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCT CCCTCGCGGGGAGGCCGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGA AlaTrpTyrGluLeuThrProAlaGluThrThrValArgLeuArgAlaTyrMetAsnThr 2701 GTGCTTGGTATGAGCTCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACA CACGAACCATACTCGAGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGT ProGlyLeuProValCysGinAspHisLeuG1uPheTrpGluGlyVa1PheThrG1yLeu 2761 CCCCGGGGCTTCCCGTGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCC GGGGCCCCGAAGGGCACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGG ThrHisIleAspAlaHisPheLeuSerG1nThrLysG1nSerGlyGluAsnLeuProTyr 2821 TCACTCATATAGATGCCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTT AGTGAGTATATCTACGGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAA LeuValAlaTyrGlnAlaThrValCysAlaArgAlaG1nAlaProProProSe: TrpAsp 2881 ACCTGGTAGCGTACCAAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATO;TGGG TGGACCATCGCATGGTTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCC r% "

162 GlnMetTrpLysCysLeuneArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeu 2941 ACCAGATGTGGAAGTGTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGC TGGTCTACACCTTCACAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACG TyrArgLeuGlyAlaValGlnAsnGluIleThrLeuThrHisProValThrLysTyrIle 3001 TATACAGACTGGGCGCTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACA ATATGTCTGACCCGCGACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGT MetThreysMetSerAlaAspLeuGluValValThrSerThrTrpValLeuValGlyGly 3061 TCATGACATGCATGTCGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCG AGTACTGTACGTACAGCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGC ValLeuAlaAlaLeuAlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCysValValIleValGlyArg 3121 GCGTCCTGGCTGCTTTGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCA CGCAGGACCGACGAAACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGT ValValLeuSerGlyLysProAlaIleIleProÅspArgGluValLeuTyrArgGluPhe 3181 GGGTCGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGT CCCAGCAGAACAGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCA AspGluMetGluGluCysSerGlnHisLeuProTyrIleGluGlnGlyMetMetLeuAla 3241 TCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCG AGCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGC GluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArgGlnAlaGluVal 3301 CCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGG GGCTCGTCAAGTTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCC IleAlaProAlaValG1nThrAsnTrpG1nLysLeuGluThrPheTrpA1aLysHiäMet 3361 TTATCGCCCCTGCTGTCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATA AATAGCGGGGACGACAGGTCTGGITGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTAT TrpAsnPheIleSerGlyIleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnPro 3421 TGTGGAACTTCATCAGTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACC ACACCTTGAAGTAGTCACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGG Ala IleAlaSerLeuMetAlaPheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGln 3481 CCGCCATTGCTTCATTGATGGCTTTTACAGCTGC'TGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCC GGCGGTAACGAAGTAACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGG ThrLeuLeuPheAsnIleLeuGlyGlyTrpValAlaAlaGlnLeuAlaAlaProG1yAla 3541 AAACCCTCCTCTTCAACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTG TTTGGGAGGAGAAGTTGTATAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCAC AlaThrAlaPheVa1GlyAlaGlyLeuAlaGlyAlaAlaIleGlySerValGlyLeuGly 3601 CCGCTACTGCCTTTGTGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGG GGCGATGACGGAAACACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACC LysValLeuileAsplleLeuidaGlyTyrGlyA1aGlyValAlaGlyAlaLeuValAla 3661 GGAAGGTCCTCATAGACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGG CCTTCCAGGAGTATCTGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACC PheLyslleMetSerGlyGluValProSerThrGluAspLeuValAsnLeuLeuProAla 3721 CATTCAAGATCATGAGCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCG GTAAGTTCTAGTACTCGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGC IleLeuSerProGlyAlaLeuValValGlyValValCysAlaAlaIleLeuArgArgHis 3781 CCATCCTCTCGCCCGGAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGC GGTAGGAGAGCGGGCCTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCG Va1GlyProGlyGluGlyAlaValG1nTrpMetAsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArg 3841 ACGTTGGCCCGGGCGAGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCC TGCAACCGGGCCCGCTCCCCCG TCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGG GlyAsnHisValSerProThrHisTyrValProGluSerAspAlaAlaAlaArgValThr FIC; 32-4

163 3901 GGGGGAACCATGTTTCCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCA CCCCCTTGGTACAAAGGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGT AlaIleLeuSerSerLeuThrValThrGlnLeuLeuArgArgLeuHisG1nTrpIleSer 3961 CTGCCATACTCAGCAGCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAA GACGGTATGAGTCGTCGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATT SerGluCysThrThrProCysSerG1ySerTrpLeuArgAspIleTrpAspTrpIleCys 4021 GCTCGGAGTGTACCACTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATAT CGAGCCTCACATGGTGAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATA GluValLeuSerAspPheLysThrTrpLeuLysAlaLysLeuMetProGlnLeuProGly 4081 GCGAGGTGTTGAGCGACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTG CGCTCCACAACTCGCTGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGAC IleProPheVa1SerCysG1nArgUyTyrLysGlyValTrpArgVa1AspG1yI1eMet 4141 GGATCCCCTTTGTGTCCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCA CCTAGGGGAAACACAGGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGT HisThrArgCysHisCysGlyAlaGluIleThrGlyHisValLysAsnG1yThrMetArg 4201 TGCACACTCGCTGCCACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACA'TGTCAAAAACGGGACGATGA ACGTGTGAGCGACGGTGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACT IleValGlyProArgThrCysArgAsnMetTrpSerGlyThrPheProIleAsnAlaTyr 4261 GGATCGTCGGTCCTAGGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCT CCTAGCAGCCAGGATCCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGA ThrThrGlyProCysThrProLeuProAlaProAsnTyrThrPheAl aleutrpargval 4321 ACACCACGGGCCCCTG TACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGG TGTGGTGCCCGGGGACATGGGGGGAAGGACGCGGC'TTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCC SerAlaGluG1uTyrVa1G1uIleArgG1nVa1GlyAspPheHisTyrValThrGlyMet 4381 TGTCTGCAGAGGAATATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTA ACAGACGTCTCCTTATACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCAT ThrThrAspAsnLeuLysCysProCysG1nValProSerProGluPhePheThrGluLeu 4441 TGACTACTGACAATCTCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAAT ACTGATGACTGTTAGAGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTA AspGlyValArgLeuHisArgPheAlaProProCysLysProLeuLeuArgGluGluVal 4501 TGGACGGGGTGCGCCTACATAGGTTTGCGCCCCCCTGCAAGCCCTTGCTG_CGGGAGGAGG ACCTGCCCCACGCGGATGTATCCAAACGCGGGGGGACGTTCGGGAACGACGCCCTCCTCC SerPheArgVa1GlyLeuHisGluTyrProVa1G1ySerG1nLeuProCysGluProGlu 4561 TATCATTCAGAGTAGGACTCCACGAATACCCGGTAGGGTCGCAATTACCTTGCGAGCCCG ATAGTAAGTCTCATCCTGAGGTGCTTATGGGCCATCCCAGCGTTAATGGAACGCTCGGGC ProAspValAlaValLeuThrSerMetLeuThrAspProSerHisileThrAlaGluAla 4621 AACCGGACGTGGCCGTGTTGACGTCCATGCTCACTGATCCCTCCCATATAACAGCAGAGG TTGGCCTGCACCGGCACAACTGCAGGTACGAGTGACTAGGGAGGGTATATTGTCGTCTCC AlaGlyArgArgLeuA1aArgGlySerProProSerValAlaSerSerSerAlaSerGln 4681 CGGCCGGGCGAAGGTTGGCGAGGGGATCACCCCCCTCTGTGGCCAGCTCCTCGGCTAGCC GCCGGCCCGCTTCCAACCGCTCCCCTAGTGGGGGGAGACACCGGTCGAGGAGCCGATCGG LeuSerAlaProSerLeuLysAlaThrCysThrAlaAsnHisAspSerProAspAlaGlu 4741 AGCTATCCGCTCCATCTCTCAAGGCAACTTGCACCGCTAACCATGACTCCCCTGATGCTG TCGATAGGCGAGGTAGAGAGTTCCGTTGAACGTGGCGATTGGTACTGAGGGGACTACGAC LeuIleGluAlaAsnLeuLeuTrpArgGlnGluMetGlyGlyAsnIleThrArgValGlu 4801 AGCTCATAGAGGCCAACCTCCTATGGAGGCAGGAGATGGGCGGCAACATCACCAGGGTTG TCGAGTATCTCCGGTTGGAGGATACCTCCGTCCTCTACCCGCCGTTGTAGTGGTCCCAAC SerGluAsnLysVa1ValIleLeuAspSerPheAspProLeuVa1AlaG1uGluAspGlu 4861 AGTCAGAAAACAAAGTGGTGATTCTGGACTCCTTCGATCCGCTTGTGGCGGAGGAGGACG TCAGTCTTTTGTTTCACCACTAAGACCTGAGGAAGCTAGGCGAACACCGCCTCCTCCTGC

164 ArgGluIleSerValProAlaGluIleLeuArgLysSerArgArgPheAlaGlnAlaLeu 4921 AGCGGGAGATCTCCGTACCCGCAGAAATCCTGCGGAAGTCTCGGAGATTCGCCCAGGCCC TCGCCCTCTAGAGGCATGGGCGTCTTTAGGACGCCTTCAGAGCCTCTAAGCGGGTCCGGG ProValTrpAlaArgProAspTyrAsnProProLeuValGluThrTrpLysLysProAsp 4981 TGCCCGTTTGGGCGCGGCCGGACTATAACCCCCCGCTAGTGGAGACGTGGAAAAAGCCCG ACGGGCAAACCCGCGCCGGCCTGATATTGGGGGGCGATCACCTCTGCACCTTTTTCGGGC TyrGluProProValValHisGlyCysProLeuProProProLysSerProProValPro 5041 ACTACGAACCACCTGTGGTCCATGGCTGTCCGCTTCCACCTCCAAAGTCCCCTCCTGTGC TGATGCTTGGTGGACACCAGGTACCGACAGGCGAAGGTGGAGGTTTCAGGGGAGGACACG ProProArgLysLysArgThrValValLeuThrGluSerThrLeuSerThrAlaLeuA1a 5101 CTCCGCCTCGGAAGAAGCGGACGGTGGTCCTCACTGAATCAACCCTATCTACTGCCTTGG GAGGCGGAGCCTTCTTCGCCTGCCACCAGGAGTGACTTAGTTGGGATAGATGACGGAACC GluLeuAlaThrArgSerPheGlySerSerSerThrSerGlyIleThrGlyAspAsnThr 5161 CCGAGCTCGCCACCAGAAGCTTTGGCAGCTCCTCAACTTCCGGCATTACGGGCGACAATA GGCTCGAGCGGTGGTCTTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGTTAT ThrThrSerSerGluProAlaProSerGlyCysProProAspSerAspAlaGluSerTyr 5221 CGACAACATCCTCTGAGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCT GCTGTTGTAGGAGACTCGGGCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGA SerSerMetProProLeuGluGlyGluProGlyAspProAspLeuSerAspGlySerTrp 5281 ATTCCTCCATGCCCCCCCTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCAT TAAGGAGGTACGGGGGGGACCTCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTA SerThrValSerSerGluAlaAsnAlaGluAspValVa1CysCysSerMetSerTyrSer 5341 GGTCAACGGTCAGTAGTGAGGCCAACGCGGAGGATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCTTACT CCAGTTGCCAGTCATCACTCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACGAGTTACAGAATGA TrpThrGlyAlaLeuValThrProCysA1aA1aG1uGluGlnLysLeuProIleAsnAla 5401 CTTGGACAGGCGCACTCGTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAACTGCCCATCAATG GAACCTGTCCGCGTGAGCAGTGGGGCACGCGGCGCCTTCTTGTCTTTGACGGGTAGTTAC LeuSerAsnSerLeuLeuArgHisHisAsnLeuValTyrSerThrThrSerArgSerAla 5461 CACTAAGCAACTCGTTGCTACGTCACCACAATTTGGTGTATTCCACCACCTCACGCAGTG GTGATTCGTTGAGCAACGATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCAC CysGlnArgGlnLysLysValThrPheAspArgLeuG1nValLeuAspSerHisTyrGln 5521 CTTGCCAAAGGCAGÅAGAAAGTCACATTTGACAGACTGCAAGTTCTGGACAGCCATTACC GAACGGTTTCCGTCTTCTTTCAGTGTAAACTGTCTGACGTTCAAGACCTGTCGGTAATGG AspValLeuLysG1uValLysAlaAlaAlaSerLysValLysAlaAsnLeuLeuSerVal 5591 AGGACGTACTCAAGGAGGTTAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTTGCTATCCG TCCTGCATGAGTTCCTCCAATTTCGTCGCCGCAGTTTTCACTTCCGATTGAACGATAGGC GluGluAlaCysSerLeuThrProProHisSerAlaLysSerLysPheGlyTyrGlyAla 5641 TAGAGGAAGCTTGCAGCCTGACGCCCCCACACTCAGCCAAATCCAAGTTTGGTTATGGGG ATCTCCTTCGAACGTCGGACTGCGGGGGTGTGAGTCGGTTTAGGTTCAAACCAATACCCC LysAspValArgCysHisAlaArgLysAlaValThrHisIleAsnSerValTrpLysAsp CAAAAGACG TCCGTTGCCATGCCAGAAAGGCCGTAACCCACATCAACTCCGTGTGGAAAG GTTTTCTGCAGGCAACGGTACGGTCTTTCCGGCATTGGGTGTAGTTGAGGCACACCTTTC LeuLeuGluAspAsnValThrProIleAspThrThrIleMetAlaLysAsnGluValPhe 5761 ACCTTCTGGAAGACAATGTAACACCAATAGACACTACCATCATGGCTAAGAACGAGGTTT TGGAAGACCTTCTGTTACATTGTGGTTATCTGTGATGGTAGTACCGATTCTTGCTCCAAA CysVa1G1nProGluLysGlyGlyArgLysProAlaArgLeuIleValPheProAspLeu 5821 TCTGCGTTCAGCCTGAGAAGGGGGGTCGTAAGCCAGTCGTCTCATCGTGTTCCCCGATC AGACGCAAGTCGGACTCTTCCCCCCAGCATTCGGTCGAGCAGAGTAGCACAAGGGGCTAG G1 yvalargvalcysglulysmetalaleutyraspvalvalthrlysleuproleuala FIG. 32-6

165 5881 TGGGCGTGCGCGTGTGCGAAAAGATGGCTTTGTACGACGTGGTTACAAAGCTCCCCTTGG ACCCGCACGCGCACACGCTTTTCTACCGAAACATGCTGCACCAATGTTTCGAGGGGAACC ValMetGlySerSerTyrGlyPheGlnTyrSerProGlyGlnArgValGluPheLeuVal 5941 CCGTGATGGGAAGCTCCTACGGATTCCAATACTCACCAGGACAGCGGGTTGAATTCCTCG GGCACTACCCTTCGAGGATGCCTAAGGTTATGAGTGGTCCTGTCGCCCAACTTAAGGAGC G1nAlaTrpLysSerLysLysThrProMetG1yPheSerTyrAspThrArgCysPheAsp TGCAAGCGTGGAAGTCCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGATACCCGCTGCTTTG ACGTTCGCACCTTCAGGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTATGGGCGACGAAAC SerThrValThrGluSerAspIleArgThrGluGluAlaIleTyrGlnCysCysAspLeu ACTCCACAGTCACTGAGAGCGACATCCGTACGGAGGAGGCAATCTACCAATGTTGTGACC TGAGGTGTCAGTGACTCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGTTAGATGGTTACAACACTGG AspProG1nAlaArgValAlaIleLysSerLeuThrGluArgLeuTyrValG1yGlyPro TCGACCCCCAAGCCCGCGTGGCCATCAAGTCCCTCACCGAGAGGCTTTATGTTGGGGGCC AGCTGGGGGTTCGGGCGCACCGGTAGTTCAGGGAGTGGCTCTCCGAAATACAACCCCCGG LeuThrAsnSerArgGlyGluAsnCysGlyTyrArgArgCysArgAlaSerG1yValLeu CTCTTACCAATTCAAGGGGGGAGAACTGCGGCTATCGCAGGTGCCGCGCGAGCGGCGTAC GAGAATGGTTAAGTTCCCCCCTCTTGACGCCGATAGCGTCCACGGCGCGCTCGCCGCATG ThrThrSerCysGlyAsnThrLeuThrCysTyrIleLysAlaArgA1aAlaCysArgAla TGACAACTAGCTGTGGTAACACCCTCACTTGCTACATCAAGGCCCGGGCAGCCTGTCGAG ACTGTTGATCGACACCATTGTGGGAGTGAACGATGTAGTTCCGGGCCCGTCGGACAGCTC A1aG1yLeuGlnAspCysThrMetLeuValCysGlyAspAspLeuValValI1eCysGlu CCGCAGGGCTCCAGGACTGCACCATGCTCGTGTGTGGCGACGACTTAGTCGTTATCTGTG GGCGTCCCGAGGTCCTGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAATCAGCAATAGACAC SerAlaGlyValGlnGluAspAlaAlaSerLeuArgAlaPheThrGluAlaMetThrArg AAAGCGCGGGGGTCCAGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCA TTTCGCGCCCCCAGGTCCTCCTGCGCCGCTCGGACTCTCGGAAGTGCCTCCGATACTGGT TyrSerAlaProProG1yAspProProGlnProG1uTyrAspLeuG1uLeuIleThrSer GGTACTCCGCCCCCCCTGGGGACCCCCCACAACCAGAATACGACTTGGAGCTCATAACAT CCATGAGGCGGGGGGGACCCCTGGGGGGTGTTGGTCTTATGCTGAACCPCGAGTATTGTA CysSerSerAsnValSerValAlaHisAspGlyAlaGlyLysArgValTyrTyrLeuThr CATGCTCCTCCAACGTGTCAGTCGCCCACGACGGCGCTGGAAAGAGGGTCTACTACCTCA GTACGAGGAGGTTGCACAGTCAGCGGGTGCTGCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGT ArgAspProThrThrProLeuAlaArgAlaAlaTrpGluThrAlaArgHisThrProVa1 CCCGTGACCCTACAACCCCCCTCGCGAGAGCTGCGTGGGAGACAGCAAGACACACTCCAG GGGCACTGGGATGTTGGGGGGAGCGCTCTCGACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTC AsnSerTrpLeuGlyAsnIleIleMetPheAlaProThrLeuTrpAlaArgMetIleLeu TCAATTCCTGGCTAGGCAACATAATCATGTTTGCCCCCACACTGTGGGCGAGGATGATAC AGTTAAGGACCGATCCGTTGTATTAGTACAAACGGGGGTGTGACACCCGCTCCTACTATG MetThrHisPhePheSerValLeuIleAlaArgAspG1nLeuGluGlnAlaLeuAspCys TGATGACCCATTTCTTTAGCGTCCTTATAGCCAGGGACCAGCTTGAACAGGCCCTCGATT ACTACTGGGTAAAGAAATCGCAGGAATATCGGTCCCTGGTCGAACTTGTCCGGGAGCTAA GluIleTyrGlyAlaCysTyrSerI1eG1uProLeuAspLeuProProIleI1eGlnArg GCGAGATCTACGGGGCCTGCTACTCCATAGAACCACTTGATCTACCTCCAATCATTCAAA CGCTCTAGATGCCCCGGACGATGAGGTATCTTGGTGAACTAGATGGAGGTTAGTAAGTTT Leu GACTC CTGAG FIG. 32-7

166 F1( ånlitys Kaistanumero Sirlpanssiviitenumero Infektiotyyppi Näytepäivä (pv) (0 = tartutuspäivä) ALT (alaniiniaminotransferaasitaso seerumissa)pm /M1 1 1 NANB NANB NANB HANS 154 N/A 5 2 NANB NANB NANB NANB 138 N/A 9 3 NANB NANB NAND NANB NANB NANB NANB 83 N/A NANB 140 N/A HAV HAv HAV 40 i HAv HAv -8 N/A 22 6 HAv NAV HAV 129 N/A 26 7 HAv HAV HAv NAV 139 N/A 30 8 HAV HAV HAv HAv HBv -290 N/A 35 9 HBv HBV HBV HBv (varasto) (varasto) HBV HBV HBV Heli (varasto) (varasto) HBV HBv

167 SIMPANSSIT v irmassoak 6z1 "oma SI,ir~~ 91 11, ~ ~1 leell~ 1.4~- :- 11~01 en cos, sz 0 OPI te 1C1 ineekgalibm- SS E" c 9 ~2w 651 PL ele CS SOZ ilegookop zs 41~~111 lz 9 1L11~ IQ 0 7 re) re) SIMPANSSIT CIZ 691 1/, SOZ :61:C) SOL IL CI -4/// PS1 61 0, L 6 0 A i=4 1 A SLI ZZ 0

168 FICk 3 4 SELITYS Kaista- Potilaan numero viitenumero Diagnoosi ALT-taso Im4/m1) NANB NANB NANB 14 NANB 79 NANB 26 NANB 78 NANB 87 NANB 25 SANB 60 NANB 13 NANB 298 NANB 101 NANB 474 NANB 318 NANB 20 NANB 163 NANB 44 NANB 50 NANB ti/a NANB N/A NANB N/A Normaali Normaali Normaali ~naali ~naali ~naali Naamaa' Normaali Normaali Normaali Akuutti HAV Akuutti HAV Akuutti HAV Akuutti HAV Akuutti HAV Akuutti HAV Akuutti HAV Akuutti HAV, TbiplWa HBV (anti-hbsag+ve; anti-h8cag+ve) (anti-hbsaq+ve; anti-hbcag+ve) (anti-hbsag+ve; anti-hbcag+ve) (anti-hbsag+ve; anti-hbsag+ve) N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N / A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 1 Jaksottaisia seeruzninäytteitä analysoitiin näistä potilaista.

169 FIG FIG ~1 dir;k4u~ sissolffik togioroag qemeil~ e111Pidaf 4.111».41~Q ~o~ 25

170 FIG. 35 SphI Hcor u lai* 1 ind3 7 sti " URA3 coi 439 mai 1113 ind BamhI 1519 Sphl 1706 ali 1795 Xbal Hind IR tet PvuI u pab24 Hind Ecorl 9023 LEU2-d amp Ncol 8484 Ecorl 8260 KpnI u -IR 2u sti 4753 I 4879 ClaI 7774 PvuI 7483 HpaI 7248 ai 6267 cori 5505 ClaI 5530 cori 5565 ind3 5669

171 F I G SOD-C100-tuusiopolypeptidin030H-pää SOD- COOHM--sovitin-----)(NANBHpolypeptidi> AlaCysGlyValIleGlyIleAlaGlnAsnLeuGlyIleArgAspAlaHisPheLeuSer 1 GCTTGTGGTGTAATTGGGATCGCCCAGAATTTGGGAATTCGGGATGCCCACTTTCTATCC CGAACACCACATTAACCCTAGCGGGTCTTAAACCCTTAAGCCCTACGGGTGAAAGATAGG > >>>>>>>>>>>>>>>>>>>> GinThrLysG1nSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAlaTyrGlnAlaThrValCys 61 CAGAC.AAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACCAAGCCACCGTGTGC GTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGGTTCGGTGGCACACG AlaArgAlaGlnAlaProProProSerTrpAspG1nMetTrpLyseysLeuIleArgLeu 121 GCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGTGTTTGATTCGCCTC CGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCACAAACTAAGCGGAG LysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeuGlyAlaValGlnAsnGlu 181 AAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCGCTGTTCAGAATGAA TTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGCGACAAGTCITACTT IleThrLeuThrHisProValThrLysTyrIleMetThrCysMetSerAlaAspLeuGlu 241 ATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGCATGTCGGCCGACCTGGAG TAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACAGCCGGCTGGACCTC Va 1Va 1 ThrSerThrTrpValLeuValGlyGlyVa 1LeuAlaAlaLeuAlaAlaTyrCys 301 GTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTTTGGCCGCGTATTGC CAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAAACCGGCGCATAACG LeuSerThrGlyCysValValIleValGlyArgValValLeuSerGlyLysProAlaIle 361 CTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGICGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATC GACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGCCCTTCGGCCGTTAG I1eProAspArgGluValLeuTyrArgGluPheAspGluMetGluGluCysSerGlnHis 421 ATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCAC TATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTG LeuProTyr I leglug1nglymetmetleualagluglnphelysglnlysalaleug ly 481 TTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGC AATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCGTCTTCCGGGAGCCG- LeuLeuG1nThrAlaSerArgGlnAlaGluValIleAlaProAlaValG1nThrAsnTrp 541 CTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTGTCCAGACCAACTGG GAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGACAGGTCTGGTTGACC G1nLysLeuGluThrPheTrpA1aLysHisMetTrpAsnPheIleSerGlyIleGlnTyr 601 CAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCAGTGGGATAC,AATAC GTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGTCACCCTATGTTATG LeuAl ag lyleuserthrleuprog 1 yas n P roal a I 1 ealaserleumetalaphethr 661 TTGGCGGGCTTG TCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCATTGATGGCTTTTACA AACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTAACTACCGAAAA%T AlaAlaVa1ThrSerProLeuThrThrSerG1nThrLeuLeuPheAsnIleLeuGlyGly 721 GCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCAACATATTGGGGGGG CGACGACAG'TGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGTTGTATAACCCCCCC TrpValAlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAlaAlaThrhlaPheValGlyAlaGlyLeu 781 TGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTGTGGGCGCTGGCTTA ACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAACACCCGCGACCGAAT AlaGlyAlaAlaIleGlySerVa1GlyLeuGlyLysValLeuIleAspIleLeaAlaGlY 841 GCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAGACATCCTTGCAGGG

172 CGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATCTGTAGGAACGTCCC TyrGlyAlaGlyValAlaGlyAlaLeuValAlaPheLysIleMetSerGlyGluValPro 901 TATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGAGCGGTGAGGTCCCC ATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACTCGCCACTCCAGGGG SerThrGluAspLeuValAsnLeuLeuProA1aIleLeuSerProGlyAlaLeuValVal 961 TCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCGGAGCCCTCGTAGTC AGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGCCTCGGGAGCATCAG G1yVa1Vt1CysAlaAlaIleLeuArgArgHisValGlyProGlyGluGlyAlallalGls 1021 GGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCGAGGGGGCAGIGCAG CCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGCTCCCCCGTCACGTC <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<NANBHM---extra TrpMetAsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArgGlyAsnHislIalSerProValHisHis 1081 TGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTTCCCCAGTCCATCAT ACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAAGGGGTCAGGTAGTA ] LysArgOP 1141 AAGCGTTGACGCTCCCTACGGGTGGACTGTGGAGAGAC.AGGGC.ACTGCTAAGGCCCAAAT TTCGCAACTGCGAGGGATGCCC.ACCTGAC.ACCTCTCTGTCCCGTGACGATTCCGGGIITTA 1201 CTCAGCCATGCATCGAGGGGTACAATCCGTATGGCCAACAACTAGCGCGTACGTAAAGTC GAGTCGGTACGTAGCTCCCCATGTTAGGCATACCGGTTGTTGATCC.,CGC.ATGCATTTCAG 1261 TCCTTTCTCGATGGTCCATACCTTAGATGCGTTAGCATTAATCCGAATTC AGGAAAGAGCTACCAGGTATGGAATCTACGCAATCGTAATTAGGCTTAAG FIG. 36-2

173 ""11 I 2 FIG. 37a 2 3 FIG. 37 b '- FIG t:--.k",',' _ -' ,-.. 2,--.., r- - 7-,..?" :å.z... 7 :,'- go..,,_.. '.'Z.1.4'.»S. jg** - >".:-. _.,_.. 'F ''',a ik ' t 2",','...,4,.., ' -...

174 FIG. 38

175 I A B C FIG. 40 A B C A B C I I 2 3 FIG. 41a FIG. 41b

176 HCV FIG Kloonien 14i-39C yhdistetyn avoimen lukualueen koodaaman HCVpolypeptidin ja Dengue-flaviviruksen (MNWVD1) ei-rakenneproteiinin välinen homologia EYVVLLFULADARVCSCLWMMLLISOAEAALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFA MNWVD1 HCV MNWVD1 HCV MNWVD1 AVSFVTLITGNMSFRDLGRVMVMVGATMTDDIGMGVTYLALLAAFKVRPTFAAGLLLRKL WYLKGKWPGAVYTFYGMWPM ALPQRAALDTEVAAS CGGVVLVGI24ALTLS PYY TSKELMMTTIGIVLLSOSTIPETILELTDALALGMMVUMVRKMEKYOLAVTIMAILCVP KRYISWCLWWLOYFLTRVEAQLHVWIPPLNVRGGRDAVILLMCAVHPTLVFDITKLLLAV :.. : NAVILONAWKVSCTILAVVSVSPLFLTSSQOKADWIPLALTIKGLNPTAIF-LTTLSRTN 250 : HCV FGPLWILOASLLKVPYF-VRVOGLLRF-CALARKMIGGHYVOMVIIKLGALTGTYVYNHL.. : : MNWVD1 KKRSWPLNEAIMAVGMVS I LASSLLICND I PMTGPLVAGGLLTVCYV-LTGRSADT"F:RA ' HCV TPLRDWAHNGLRDLAVAVEPVVFSOMETKLITWGADTAACGDIINGLPVSARRGREILLG MNWVD1 ÅDI5i-Wii)6ÅEISGåSiiLSI.H;i- SiKilää6TIlgiIRTGLÅTISG---Li HCV MNWVD1 HCV MNWVD1 HCV _ PADGMVSKGWRILAPITAYAQQTRGLLGCIITSLTGRDKNOVEGEVQrVSTAAQTFLATC VSIPifäAAWYLWEVICKQRAGVLWDVPSPPPVGKAELEDGAYRIKOKGILGYSQIGAGVY INGVCWTVYHGAGTRTIASPKGPVIOMYTNVDQDLV----GWPAPQGSRSLTPCTCGSSD.... ::.. KEGTFHTMWHVTRGAVLMHKGKRIEPSWADVKKDLVSCGGGWKLEGEWKEGEEVQVLALE LYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLIJSPRPISYLKGSSGGPLLCPAGHAVGIFRAAVCTRGV MNWVD1 PGKNiRAI KPGLFkil:1--ÄTiäViiipiSPGii;G;iiDKKGic1515GLYG;zålIVTRG HCV MNWVD AKAVDFIPVENLETTMRSPVFTDNSSPPVVPQSFQVAHLHAPTGSGKS--TKVPAAYAAQ....:..:... AYVSAIAQTEK SIEDNPEIEDDIFRK---RKLTIMDLHPGAGKTKRYLPAIVRGAIKR E

177 HCV MNWVD1 HCV MNWVD1 HCV MNWVD1 HCV MNWVD1 HCV MNWVD1 GYKVLVLNPS--VAATLGFGAYMSKAHGIDPNIRTGVRTITTGSPITYSTYGKFLADGGC.. GLRTLILAPTRVVAAEMEEALRGLPIRYOTPAIRAEHTGREiVDLMCHÄTFTMA- PV SGGAYDIIICDECHSTDATSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTVPHPFEEV..X..:: :: : ::..::. :....: :... :::::::. : : v. RVPNYNLIIMDEAHFTDPASIAARGYISTRVE-MGEAAGIFMTATPPGSRD-PFPOSNAP f ALSTTGEIPFYGKAIPLEVIXGGRHLIFCHSKKXCDELAAXLVALGINAVAYYRGLDVSV IÅDEEREIPERSWSSGHEMVTDFKGKTVWFVPSIXAGNDTAACUMNGKXVTOLSRKTFD 770 7S IPTSGD~WIMMGYTGDFDSVIDCNTCVTOTVDFSLDPTFTIETITLPQDAVSRT SEYVKTRTNDWNFVVTTDISEMGANFKAERVIDPRRCMXPVILTDGEERVILAGPMPVTH OHHGHTGRGKPGIYRFVAPGERPSGMFDSSVLCECYDAGCAWYELTPAETTVRLRAYMNT SS FIG. 42-2

178 FIG. 43 SATTUMANVARAISTEN NÄYTTEIDEN JAKAANTUMA C100-3 antigeeni-elisa Prekliininen välinesarja 416ng ClCq(KuoppA, 2 t' 37 C, 20u( NÄYTE 637 n= g nil"ti i t i t )3.0 OD 492nm

179 I=I 4 4; Kahdella ELISAmenetelmällä tutkittujen sattumanvaraisten verenluovuttajanäytteiden optisten tiheyksien jakaantuma C100-3 antigeeni-elisa; monoklonaalinen hepatitis 3, MoAD, vastaan polyklonaalinen omoab= 1056 eue Poly = JAKAAATUMA _ I t t- I 1 I 1' >3.0 OD 492nm

180 FIG. 45 Nimi Yhteinen sekvenssi 5 ' AAGCTTGATCGAATTC Vaihteleva sekvenssi CGATCTTGC CGATCCTGC CGATCATGC CGATCGTGC CGAAGTTGC CGAAGCTGC AGATCTTGC AGATCCTGC AGATCATGC AGATCGTGC AGAAGTTGC AGAAGCTGC CGATCTTGT CGATCCTGT CGATCATGT CGATCGTGT CGAAGTTGT CGAAGCTGT AGATCTTGT AGATCCTGT AGATCATGT AGATCGTGT AGAAGTTGT AGAAGCTGT CGCTCTTGC CGCTCCTGC CGCTCATGC CGCTCGTGC CGCAGTTGC CGCAGCTGC CGCTCTTGT CGCTCCTGT CGCTCATGT CGCTCGTGT CGCAGTTGT CGCAGCTGT

181 FIG Kloonin k9-1 DNA:n translaatio GlyCysProGluArgLeuAlaSerCysArgProLeuThrAspPheAspG1nGlyTrpGly 1 CAGGCTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGACCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGG GTCCGACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGCTGGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCC ProIleSerTyrA1aAsnGlySerGlyProAspG1nArgProTyrCysTrpHisTyrPro 61 GCCCTATCAGTTATGCCAACGGAAGCGGCCCCGACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACC CGGGATAGTCAATACGGTTGCCTTCGCCGGGGCTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGG ProLysProCysGlyIleValProAlaLysSerValCysGlyProValTyrCysPheThr 121 CCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGAAGAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCA GGGGTTTTGGAACGCCATAACACGGGCGCTTCTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGT ProSerProValValVa1GlyThrThrAspArgSerGlyAlaProThrTyrSerTrpGly 181 CTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGG GAGGGTCGGGGCACCACCACCCTTGCTGGCTGTCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCC I GluAsnAspThrAspValPheValLeuAsnAsnThrArgProProLeuGlyAsnTrpPhe 241 GTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGT CACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCA GlyCysThrTrpMetAsnSerThrGlyPheThrLysValCysGlyAlaProProCysVal 301 TCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTG AGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAGTGGT=CACGCCTCGCGGAGGAACAC IleGlyG1yAlaGlyAsnAsnThrLeuHisCysProThrAspCysPheArgLysHisPro 361 TCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATC AGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAG AspAlaThrTyrSerArgCysGlySerGlyProTrpIleThrProArgCysLeuValAsp 421 CGGACGCCACATACTCTCGGTGCGGCTCCGGTCCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCG GCCTGCGGTGTATGAGAGCCACGCCGAGGCCAGGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGC TyrProTyrArgLeuTrpHisTyrProCysThrIleAsnTyrThrIlePheLysIleArg 481 ACTACCCGTATAGGCTTTGGCATTATCCTTGTACCATCAACTACACTATATTTAAAATCA TGATGGGCATATCCGAAACCGTAATAGGAACATGGTAGTTGATGTGATATAAATTTTAGT MetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeuGluAlaAlaCysAsnTrpThrArgGlyGlu 541 GGATGTACGTGGGAGGGGTCGAGCACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCG CCTACATGCACCCTCCCCAGCTCGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGC ArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeuLeuLeuThrThrThr 601 AACGTTGCGATCTGGAAGATAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTA TTGCAACGCTAGACCTTCTATCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGAT GlnTrpG1nValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIle 661 CACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTGCCAGCCTTGTCCACCGGCCTCA GTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGACGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGT Päällekkäisyys kloonien 12f:n-15e DNA:oittenyhdistetyn avoimen likualueenkmissa-- HisLeuHisGlnAsnIleValAspValGlnTyrLeuTyrGlyValGlySerSerIleAla 721 TCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCG AGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGC SerTrpAlaIleLysTrpGluTyrValValLeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAlaArg 781 CGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTCCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGC GCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAGGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTSCGCG

182 VaLCysSerCysLeuTrpMetMetLeuLeuIleSerGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsn 841 GCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAAGCGGCTTTGGAGA CGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTTCGCCGAAACCTCT LeuValIleLeuAsnAlaAlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeuValSerPheLeuVal 901 ACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCG TGGAGCATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGC PhePheCysPheAlaTrpTyrLeuLysGlyLysTrpValProGlyAlaValTyrThrPhe 961 TGTTCTT.CTGCTTTGCATGGTATCTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCT ACAAGAAGACGAAACGTACCATAGACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGA TyrGlyMetTrpProLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuProGlnArgAlaTyrAlaLeu 1021 TCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGC AGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCG AspThrGluValAlaAlaSerCysGlyGlyValValLeuValGlyLeuMetAlaIeuThr 1081 TGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTAA ACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGATT LeuSerProTyrTyrLysArgTyrIleSerTrpCysLeuTrpTrpLeuG1nTyrPheLeu 1141 CTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTC GAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAG ThrArgValGluAlaGlnLeuHisValTrpIleProProLeuAsnValArgGlyGlyArg 1201 TGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGC ACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCG AspAlaValIleLeuLeuMetCysAlaValHisProThrLeuValPheAspIleThrLys 1261 GCGACGCTGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCA CGCTGCGACAGTAGAATGAGTACACACGACAT-GTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGT LeuLeuLeuAlaValPheGlyProLeuTrpIleLeuGlnAla 1321 AATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCAG TTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGTC FIG. 46-2

183 FIG Kloonien K e DNA:oitten yhdistetty avoin lukualue GlyCysProGluArgLeuAlaSerCysArgProLeuThrAspPheAspG1nGlyTrpGly 1 CAGGCTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGACCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGG GTCCGACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGCTGGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCC ProIleSerTyrAlaAsnGlySerGlyProAspG1nArgProTyrCysTrpHisTyrPro 61 GCCCTATCAGTTATGCCAACGGAAGCGGCCCCGACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACC CGGGATAGTCAATACGGTTGCCTTCGCCGGGGCTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGG ProLysProCysGlyIleValProAlaLysSerValCysG1yProValTyrCysPheThr 121 CCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGWAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCA GGGGTTTTGGAACGCCATAACACGGGCGCTTCTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGT ProSerProValValValGlyThrThrAspArgSerGlyAlaProThrTyrSerTrpGly 181 CTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGG GAGGGTCGGGGCACCACCACCCTTGCTGGCTGTCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCC GluAsnAspThrAspValPheValLeuAsnAsnThrArgProProLeuGlyAsnTrpPhe 241 GTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGT CACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCA GlyCysThrTrpMetAsnSerThrGlyPheThrLysValCysGlyAlaProProCysVa1 301 TCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTG AGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAGTGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACAC IleGlyGlyAlaGlyAsnAsnThrLeuHisCysProThrAspCysPheArgLysHisPro 361 TCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATC AGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAG AspAlaThrTyrSerArgCysGlySerGlyProTrpIleThrProArgeysLeuValAsp 421 CGGACGCCACATACTCTCGGTGCGGCTCCGGTCCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCG GCCTGCGGTGTATGAGAGCCACGCCGAGGCCAGGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGC TyrProTyrArgLeuTrpHisTyrProCysThrIlehsnTyrThrIlePheLysIleArg 481 ACTACCCGTATAGGCTTTGGCATTATCCTTGTACCATCAACTACACCATATTTAAAATCA TGATGGGCATATCCGAAACCGTAATAGGAACATGGTAGTTGATGTGGTATAAATTTTAGT MetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeuGluAlaAlaCysAsnTrpThrArgGlyGlu 541 GGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCG CCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGC ArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSerG1uLeuSerProLeuLeuLeuThrThrThr 601 AACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTA TTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGAT GlnTrpG1nValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIle 661 CACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCTTGTCCACCGGCCTCA GTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGT HisLeuHisGlnAsnI1eValAspValG1nTyrLeuTyrGlyValGlySerSerIleAla 721 TCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCG AGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGC SerTrpAlaIleLysTrpGluTyrValValLeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAlaArg 781 CGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGC GCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCG ValCysSerCysLeuTrpMetMetLeuLeuIleSerGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsn 841 GCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGA CGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCT LeuVa1I1eLeuAsnAlaAlaSerLeuAlaGlyThrHisG1yLeuValSerPheLeuVal 901 ACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCG TGGAGCATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGC

184 PhePheCysPheAlaTrpTyrLeuLysGlyLysTrpvalProGlyAlaValTyrThrPhe 961 TGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCT ACAAGAAGACGAAACG TACCATAAACTTCC CATTCACC CACGGGCC TCGCCAGATGTGGA TyrGlyMetTrpProLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuProGlnArgAlaTyrAlaLeu 1021 TCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGC AGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCG AspThrG1uValAlaA1aSerCysGlyGlyValValLeuValGlyLeuMetAlaLeuThr 1081 TGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGA ACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACT LeuSerProTyrTyrLysArgTyrIleSerTrpCysLeuTrpTrpLeuG1nTyrPheLeu 1141 CTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTC GAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAG ThrArgValG1uAlaGlnLeuHisValTrpIleProProLeuAsnValArgGlyGlyArg 1201 TGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGC ACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCG AspAlaVal I leleuleumetcysal alfa 1H1 sprothrleuvalpheasp I lethrlys 1261 GCGACGCCGTCATCTTACTCATGTGTGCTG TACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCA CGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACACGACATGTGGGC TGAGACCATAAACTGTAGTGGT LeuLeuLeuAlaVa1PheGlyProLeuTrpIleLeuGlnAlaSerLeuLeuLysValPro 1321 AATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCAGTTTGCTTAAAGTAC TTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATG TyrPheValArgValGlnGlyLeuLeuArgPheCysAlaLeuAlaArgLysMetIleGly 1381 CCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTTCTCCGGTTCTGCGCGTTAGCGCGGAAGATGATCG GGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAAGAGGCCAAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGC GlyHisTyrValG1nMetValIleIleLysLeuGlyAlaLeuThrGlyThrTyrValTyr 1441 GAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATCATTAAGTTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTT CTCCGGTAATGCACGTTTACCAGTAGTAATTCAATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAAA AsnHisLeuThrProLeuArgAspTrpAlaHisAsnGlyLeuArgAspLeuAlaValAla 1501 ATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGCGAGATCTGGCCGTGG TATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACGCTCTAGACCGGCACC ValGluProValVa1PheSerG1nMetGluThrLysLeuIleThrTrpGlyAlaAspThr 1561 CTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATA GACATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTTTACCTCTGGTTCGAGTAGTGCACCCCCCGTCTAT AlaAlaCysGlyAsp/leIleAsnGlyLeuProValSerAlaArgArgGlyArgGluIle 1621 CCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCCGCAGGGGCCGGGAGA GGCGGCGCACGCCACTGTAGTAGTTGCCGAACGGACAAAGGCGGGCGTCCCCGGCCCTCT LeuLeuGlyProAlaAspGlyMetValSerLysGlyTrpArgLeuLeuA1aProIleThr 1681 TACTGCTCGGGCCAGCCGATGGAATGGTCTCCAAGGGGTGGAGGTTGCTGGCGCCCATCA ATGACGAGCCCGGTCGGCTACCTTACCAGAGGTTCCCCACCTCCAACGACCGCGGGTAGT AlaTyrAlaGlnG1nThrArgGlyLeuLeuGlyCysIleIleThrSerLeuThrGlyArg 1741 CGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTAGGGTGCATAATCACCAGCCTAACTGGCC GCCGCATGCGGGTCGTCTGTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGTGGTCGGATTGACCGG AspLysAsnG1nVa1G1uG1yG1uValGlnIleVa1SerThrAlaAlaG1nThrPheLeu 1801 GGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTGCTGCCCAAACCTTCC CCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGACGACGGGTTTGGAAGG AlaThrCysIleAsnGlyVa1CysTrpThrValTyrHisGlyAlaGlyThrArgThrI1e 1861 TGGCAACGTGCATCAATGGGGTGTGCTGGACTGTCTACCACGGGGCCGGAACGAGGACCA ACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACCTGACAGATGGTGCCCCGGCCTTGC41`CCTGGT AlaSerProLysGlyProValIleGlnMetTyrThrAsnValAspG1nAspLeuValGly FIG. 47-2

185 1921 TCGCGTCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATGTAGACCAAGACCTTGIGG AGCGCAGTGGGTTCCCAGGACAGTAGGTCTACATATGGTTACATCTGGTTCTGGAACACC TrpProAlaProGlnGlySerArgSerLeuThrProCysThrCysG1ySerSerAspLeu 1981 GCTGGCCCGCTCCGCAAGGTAGCCGCTCATTGACACCCTGCACTTGCGGCTCCTCGGACC CGACCGGGCGAGGCGTTCCATCGGCGAGTAACTGTGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGG TyrLeuValThrArgHisAlaAspValI1eProValArgArgArgGlyAspSerArgGly 2041 TTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGGGGTGATAGCAGGG AAATGGACCAGTGCTCCGTGCGGCTACAGTAAGGGCACGCGGCCGCCCCACTATCGTCCC SerLeuLeuSerProArgProIleSerTyrLeuLysG1ySerSerGlyGlyProLeuLeu 2101 GCAGCCTGCTGTCGCCCCGGCCCATTTCCTACTTGAAAGGCTCCTCGGGGGGTCCGCTGT CGTCGGACGACAGCGGGGCCGGGTAAAGGATGAACTTTCCGAGGAGCCCCCCAGGCGACA CysProAlaGlyHisAlaVa1G1yI1ePheArgAlaAlaValCysThrArgGlyVa1A1a 2161 TGTGCCCCGCGGGGCACGCCGTGGGCATATTTAGGGCCGCGGTGTGCACCCGTGGAGTGG ACACGGGGCGCCCCGTGCGGCACCCGTATAAATCCCGGCGCCACACGTGGGCACCTCACC LysAlaValAspPheIleProValGluAsnLeuGluThrThrMetArgSerProValPhe 2221 CTAAGGCGGTGGACTTTATCCCTGTGGAGAACCTAGAGACAACCATGAGGTCCCCGGTGT GATTCCGCCACCTGAAATAGGGACACCTCTTGGATCTCTGTTGGTACTCCAGGGGCCACA ThrAspAsnSerSerProProValValProGlnSerPheGlnValAlaHisLeuHisAla 2281 TCACGGATAACTCCTCTCCACCAGTAGTGCCCCAGAGCTTCCAGGTGGCTCACCTCCATG AGTGCCTATTGAGGAGAGGTGGTCATCACGGGGTCTCGAAGGTCCACCGAGTGGAGGTAC ProThrGlySerGlyLysSerThrLysValProAlaAlaTyrAlaAlaGlnGlyTyrLys 2341 CTCCCACAGGCAGCGGCAAAAGCACCAAGGTCCCGGCTGCATATGCAGCTCAGGGCTATA GAGGGTGTCCGTCGCCGTTTTCGTGGTTCCAGGGCCGACGTATACGTCGAGTCCCGATAT ValLeuValLeuAsnProSerValAlaAlaThrLeuGlyPheGlyAlaTyrMetSerLys 2401 AGGTGCTAGTACTCAACCCCTCTGTTGCTGCAACACTGGGCTTTGGTGCTTACATGTCCA TCCACGATCATGAGTTGGGGAGACAACGACGTTGTGACCCGAAACCACGAATGTACAGGT AlaHisG1y/1eAspProAsn/leArgThrGlyValArgThrIleThrThrGlySerPro 2461 AGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCC TCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTAATGGTGACCGTCGG IleThrTyrSerThrTyrGlyLysPheLeuAlaAspGlyGlyCysSerGlyGlyAlaTyr 2521 CCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCGGGGGGCGCTT GGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCACGAGCCCCCCGCGAA AspIleIleIleCysAspGluCysHisSerThrAspAlaThrSerIleLeuGlyIleGly 2581 ATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATCCATCTTGGGCATCG TACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAGGTAGAACCCGTAGC ThrValLeuAspG1nA1aGluThrAlaGlyX1aArgLeuValValLeuAlaThrAlaThr 2641 GCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGTGCTCGCCACCGCCA CGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACACGAGCGGTGGCGGT ProProG1ySerValThrValProHisProAsnIleGluGluValAlaLeuSerThrThr 2701 CCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGTTGCTCTGTCCACCA GGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCAACGAGACAGGTGGT GlyGluIleProPheTyrGlyLysAlaIleProLeuGluValIleLysGlyGlyArgHis 2761 CCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAATCAAGGGGGGGAGAC GGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTAGTTCCCCCCCTCTG LeuIlePheCysHisSerLysLysLysCysAspG1uLeuAlaA1aLysLeuValA1aLeu 2821 ATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGCAAAGCTGGTCGCAT TAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCGTTTCGACCAGCGTA G1yI1eAsnAlaVa1AlaTyrTyrArgGlyLeuAspVa1SerValIleProThrSerGly 2881 TGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGTCATCCCGACCAGCG. ACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCAGTAGGGCTGGTCGC d 7 -

186 AspValValValvalAlaThrAspAlaLeuMetThrGlyTyrThrGlyAspPheAspSer 2941 GCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATACCGGCGACTTCGACT CGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATGGCCGCTGAAGCTGA ValIleAspCysAsnThrCysValThrG1nThrValAspPheSerLeuAspProThrPhe 3001 CGGTGATAGACTGCAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCAGCCTTGACCCTACCT GCCACTATCTGACGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTCGGAACTGGGATGGA ThrIleGluThrIleThrLeuProGlnAspAlaValSerArgThrGlnArgArgGlyArg 3061 TCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCA AGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGT ThrG1yArgG1yLysProG1yIleTyrArgPheValAlaProGlyGluArgProSerGly 3121 GGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCG CCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGC MetPheAspSerSerValLeuCysG].uCysTyrAspAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeu 3181 GCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGC CGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCG ThrProAlaGluThrThrValArgLeuArgAlaTyrMetAsnThrProGlyLeuProVal 3241 TCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCG AGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGC CysGlnAspHisLeuGluPheTrpGluGlyValPheThrGlyLeuThrHisIleAspAla 3301 TGTGCCAGGACCATCTTGAATTTIGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATG ACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTAC HisPheLeuSerG1nThrLysG1nSerGlyG1uAsnLeuProTyrLeuVa1AlaTyrGln 3361 CCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACC GGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGG AlaThrValCysAlaArgAlaGlnAlaProProProSerTrpAspG1nMetTrpLysCys 3421 AAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGT TTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCA LeuIleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeuGlyAla 3481 GTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCG CAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGC Va1G1nAsnGluIleThrLeuThrHisProValThrLysTyrIleMetThrCysMetSer 3541 CTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGCATGT GACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACA AlaAspLeuGluValValThrSerThrTrpValLeuValGlyGlyValLeuAlaAlaLeu 3601 CGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTT GCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAA AlaAlaTyrCysLeuSerThrG1yCysValValIleValGlyArgValValLeuSerGly 3661 TGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCG ACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGC LysProAlaIleIleProAspArgGluValLeuTyrArgGluPheAspGluMetGluGlu 3721 GGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAG CCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTC CysSerGlnHisLeuProTyrIleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGlnPheLysGln 3781 AGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGC TCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCG LysAlaLeuGlyLeuLeuG1nThrA1aSerArgG1nAlaGluValIleAlaProA1aVal 3841 AGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTG TCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTICCAATAGCGGGa\CGAC GlnThrAsnTrpG1nLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsnPheIleSer FIG. 47-4

187 3901 TCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCA AGGTCTGGT1GACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGT GlyIleGln:yrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnProAlaIleA1aSerLeu 3961 GTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCAT CACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTA MetAlaPheThrA1aAlaValThrSerProLeuThrThrSerG1nThrLeuLeuPheAsn 4021 TGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCA ACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGT IleLeuGlyGlyTrpValAlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAlaAlaThrAlaPheVal 4081 ACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTG TGTATAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAAC GlyAlaGlyLeuAlaG1yAlaAlaIleGlySerValGlyLeuGlyLysValLeuneAsp 4141 TGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAG ACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATC IleLeuAlaGlyTyrG1yAlaGlyValAlaGlyAlaLeuValAlaPheLysIleMetSer A201 ACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGA TGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCCTCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACT GlyGluValProSerThrGluAspLeuValAsnLeuLeuProAlaIleLeuSerProGly 4261 GCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCG CGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGC AlaLeuValValGlyValValCysAlaAlaIleLeuArgArgHisValGlyProGlyGlu 4321 GAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCG CTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGC GlyAlaValG1nTrpMetAsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArgGlyAsnHisValSer 4381 AGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTT TCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAA ProThrHisTyrValProGluSerAspAlaAlaAlaArgValThrA1aI1eLeuSerSer 4441 CCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCACTGCCATACTCAGCA GGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTGACGGTATGAGTCGT LeuThrValThrG1nLeuLeuArgArgLeuHisG1nTrpIleSerSerGluCysThrThr 4501 GCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCTCGGAGTGTACCA CGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTCACATGGT ProCysSerG1ySerTrpLeuArgAspIleTrpAspTrpIleCysGluValLeuSerAsp 4561 CTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGTTGAGCG GAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACAACTCGC PheLysThrTrpLeuLysAlaLysLeuMetgroGlnLeuProGlyIleProPheValSer 4621 ACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGGGATCCCCTTTGTGT TGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGAAACACA CysGlnArgGlyTyrLysGlyValTrpArgValAspGlyIleMetHisThrArgCysHis 4681 CCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCATGCACACTCGCTGCC GGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTACGTGTGAGCGACGG CysGlyAlaG1uIleThrGlyHisValLysAsnGlyThrMetArgIleValGlyProArg 4741 ACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAGGATCGTCGGTCCTA TGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTCCTAGCAGCCAGGAT ThrCysArgAsnMetTrpSerGlyThrPheProIleAsnAlaTyrThrThrG1yProCys 4801 GGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCTACACCACGGGCCCCT CCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCIGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCCCGGGGA ThrProLeuProA1aProAsnTyrThrPheAlaLeuTrpArgValSerAlaGluGluTyr 4861 GTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTCTGCAGAGGAAT CATGGGGGGAAGGACGCGGCTI`GATGTGCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTCTCCTTA FIG 47.5