!11,11)11111,

Transkriptio

1 !11,11)11111, (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats SUOMI - FINLAND (FI) PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (51) Kv.Ik.7 - Int.k1.7 C12N 15/39, 15/12, 15/52, 15/86 (21) Patenttihakemus - Patentansökning (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P US P (73) Haltija - Innehavare 1 Baxter Aktiengesellschaft, Industriestrasse 67, 1221 Wien, ITÄVALTA, (AT) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Dorner,Friedrich, Peterlinigasse 17, 1238 Wien, ITÄVALTA, (AT) 2 Scheiflinger,Friedrich, Raiffeisenstrasse 15, 2304 Orth/Donau, ITÄVALTA, (AT) 3 Falkner,Falko-GOnter, 2304 Mannsdorf, ITÄVALTA, (AT) 4 Pfleiderer,Michael, 2285 Breitstetten 19, ITÄVALTA, (AT) (74) Asiamies - Ombud: Kolster Oy Ab Iso Roobertinkatu 23, Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä modifioidun selkärankaispoxviruksen molekylaariseksi kloonaamiseksi, modifioitu virus, sen DNA ja sen käyttö Förfarande för framställning av molekylär kloning av ett modifierat chordopoxvirus, modifierat virus, dess DNA och dess användning (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer WO A 91/11519 (C12N 15/57), J. Gen. Virol. vol. 67, 1986, p , TIBTECH 8, 1990, p (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksintö koskee menetelmää modifioidun eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruksen tuottamiseksi suoraan molekyylikloonaamalla modifioitu DNA-molekyyli, joka käsittää modifioidun sytoplasma-dna-virusgenomin. Keksinnön mukainen menetelmä käsittää vaiheet, joissa (I) solunulkoisissa olosuhteissa modifioidaan DNA-molekyyliä, joka käsittää ensimmäisen sytoplasma-dna-virusgenomin, modifioidun DNA-molekyylin tuottamiseksi, joka käsittää modifioidun sytoplasma-dna-virusgenomin; (II) modifioitu DNA-molekyyli viedään ensimmäiseen isäntäsoluun, joka pakkaa modifioidun DNA-molekyylin tarttuviin virioneihin; ja (III) isäntäsolusta otetaan talteen virioneja, jotka käsittävät modifioidun virusgenomin. Isäntäsolu tartutetaan avustajaviruksella, joka ilmennetään modifioidun virusgenomin pakkaamiseksi tarttuviin virioneihin. Keksinnössä kuvataan esimerkkejä modifioidun rokkovirusgenomin pakkaamisesta käyttäen avustajarokkovirusta samasta tai toisesta suvusta. Keksintö koskee myös uusia rokkovirusvektoreita avointen lukualueiden suoraksi molekyylikloonaamiseksi vektorissa yksittäiseen restriktioentsyymipilkkomiskeskukseen. Yhdessä mallirokkovirusvektorissa avoin lukualue kopioidaan promoottorilla, joka sijaitsee vektori-dna:ssa ylävirtaan monikloonauskeskuksesta, joka käsittää useita yksittäisiä pilkkomiskeskuksia.

2 Uppfinningen avser ett förfarande för framställning av ett modifierat eukaryotiskt, cytoplasmiskt DNA-virus genom direkt molekylär kloning av en modifierad DNA-molekyl som omfattar ett modifierat, cytoplasmiskt DNA-virusgenom. Förfarandet enligt uppfinningen omfattar steg, vid vilka man (I) under extracellulära förhållanden modifierar en DNA-molekyl, vilken omfattar ett första cytoplasmiskt DNA-virusgenom, för biidande av en modifierad DNA-molekyl som omfattar det modifierade, cytoplasmiska DNA-virusgenomet; (II) inför den modifierade DNA-molekylen i en första värdcell, vilken packar den modifierade DNA-molekylen i infektiösa virioner; och (III) ur värdcellen tillvaratager virioner som omfattar det modifierade virusgenomet. Värdcellen infekteras med ett hjälpvirus, vilket exprimeras för packning av det modifierade virusgenomet i infektiösa virioner. Exempel för packning av modifierat koppvirusgenom med ett hjälpkoppvirus av samma eller annat släkte beskrivs även. Uppfinningen avser även nya koppvirusvektorer för direkt molekylär kloning av öppna läsramar in på en restriktionsenzymspjälkningsplats, vilken är unik i vektorn. I en koppvirusmodellvektor transkriberas den öppna läsramen genom en promoter, vilken ligger i vektor DNA:et uppströms från en multipel kloningsplats, vilken omfattar ett flertal unika spjälkningsställen.

3 Menetelmä modifioidun selkärankaispoxviruksen molekylaariseksi kloonaamiseksi, modifioitu virus, sen DNA ja sen käyttö 5 Esillä oleva keksintö koskee isäntäsolun sytoplasmassa replikoituvien eukaryoottisten DNA-virusten modifioituja genomeja. Spesifisemmin keksintö koskee menetelmää modifioidun chordopox- s.o. selkärankaispoxviruksen tuottamiseksi suoraan molekyylikloonaamalla modifioitu selkäran- 10 kaispoxvirusgenomi. Modifioitu DNA-virusgenomi tuotetaan modifioimalla solunulkoisissa olosuhteissa puhdistettua DNA-molekyyliä, joka käsittää sytoplasma-dna-virusgenomin. Modifioitu DNA-molekyyli pakataan sitten tarttuviin virioineihin avustajasytoplasma-dna-viruksella tartutetussa so- 15 lussa. Esillä olevan keksinnön edullisessa suoritusmuodossa halutun geenin käsittävä vieras-dna-fragmentti insertoidaan suoraan selkärankaispoxviruksen DNA:han virusgenomissa ainutlaatuiseen restriktioendonukleaasipilkkomiskohtaan, ja modifioitu virus-dna pakataan virioneihin transfektoimalla 20 avustajapoxviruksella tartutettuihin soluihin. Keksintö koskee myös modifioitua selkärankaispoxvirusta ja DNAmolekyyliä sekä viruksen käyttöä. Eukaryoottien sytoplasma-dna-viruksiin kuuluu erilaisia selkärankaisissa ja hyönteisissä tavattuja poxviruk- 25 sia ja iridoviruksia. Yhdistelmä-DNA-genomin käsittäviä poxviruksia on käytetty erilaisten insertoitujen geenien ilmentämiseksi. Tällaisia poxviruksia voidaan käyttää esimerkiksi biologisesti aktiivisten polypeptidien tuottamiseksi soluviljelmissä sekä rokoteantigeenien kuljettamisek- 30 si suoraan eläimen tai ihmisen immuunijärjestelmään. Yhdistelmä-DNA-iridovirusgenomien rakentamista vierasgeenien ilmentämiseksi ei ilmeisesti ole dokumentoitu geenimanipulaatiota koskevassa kirjallisuudessa. Tavanomaiset tekniikat vierasgeenejä käsittävien 35 yhdistelmä-dna-poxvirusgenomien rakentamiseksi perustuvat osittain DNA-yhdistymiseen in vivo (solunsisäisesti). So-

4 2 lunsisäisen DNA-yhdistämisen käyttöä kuvasivat ensin "merkkipelastus"-menetelmänä, jossa käytetään virus-dna:n subgenomifragmentteja, Sam ja Dumbell, Ann.Virol. (Institut Pasteur) 132E (1981) 135. Nämä kirjoittajat osoittivat, että 5 lämpötilalle herkkä,vaccinia-virusmutantti voitiin "pelastaa" solunsisäisellä DNA-yhdistämisellä kaniinipoxviruksen subgenomi-dna-fragmenttiin. Heidän käyttämiään menetelmiä solunsisäiseksi DNA-yhdistämiseksi käytetään edelleen nykyään. 10 Ei-poxvirus- ("vieras"-) geenejä käsittävien yhdistelmä-dna-vaccinia-virusten rakentamista kuvasivat sittemmin Panicali ja Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) ; Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) ; sekä kuvattiin US- 15 patenttijulkaisussa nro Spesifisemmin olemassa oleva tekniikka yhdistelmä-dna-poxvirusten tuottamiseksi käsittää kaksi vaihetta. Ensiksi valmistetaan DNAfragmentti, jossa on homologisia alueita vierasgeeniä ympäröivään poxvirusgenomiin nähden. Vaihtoehtoisesti rakenne- 20 taan "insertio"-plasmidi vierasgeenin DNA-yhdistämisellä in vitro (solunulkoisesti) plasmidiin. Tämä plasmidi käsittää lyhyitä virus-dna-sekvenssejä, jotka ovat homologisia siihen poxvirusgenomialueeseen nähden, johon geeni lopulta halutaan insertoida. Vierasgeeni insertoidaan plasmidiin koh- 25 taan, jota sivuavat virus-dna-sekvenssit, ja tyypillisesti alavirtaan poxviruspromoottorista, joka kontrolloi insertoidun geenin transkriptiota. Toisessa vaiheessa insertioplasmidi viedään isäntäsoluihin, jotka on tartutettu kohdepoxviruksella. Geeni insertoidaan sitten epäsuorasti rokk- 30 virusgenomiin käyttämällä solunsisäistä DNA-yhdistämistä homologisten virussekvenssien poxvirusgenomissa sekä vierasgeenin käsittävän plasmidiosan välillä. Saatu yhdistelmä-dna-genomi replikoituu sitten tuottaen tarttuvia poxviruksia. 35 Täten kunkin nimenomaisen geenin insertointi poxvirusgenomiin on tähän asti edellyttänyt nimenomaista

5 3 plasmidia, joka käsittää geenin sivuamia virussekvenssejä, jotka on valittu halutulle insertiokohdalle. Vaikeutena tässä lähestymistavassa on, että tarvitaan uusi insertioplasmidi kullekin yhdistelmä-dna-poxvirukselle. Kukin plas- 5 midi on rakennettava käyttäen solunulkoisia DNA-yhdistämismenetelmiä, sitä on vahvistettava bakteerisolussa ja se on sitten työläästi eristettävä ja huolellisesti puhdistettava ennen sen lisäämistä poxviruksella tartutettuun isäntäsoluun. 10 Toinen olemassa olevaan metodiikkaan liittyvä ongelma tässä suhteessa on yhdistelmä-dna-genomien alhainen saanto, mikä saattaa edellyttää satojen yksittäisten virusten seulomisen yhden halutun yhdistelmä-dna-tuotteen löytämiseksi. Alhainen saanto on yksittäisten solunsisäisten 15 DNA-yhdistymistapahtumien alhaisen taajuuden funktio, jolloin tähän lisänä tulee edellytys monista tämän kaltaisista tapahtumista insertioplasmidin integraatioon virusgenomiin pääsemiseksi. Tuloksena valtaosa solunsisäisillä DNAyhdistämismenetelmillä tuotetuista virusgenomeista on kan- 20 tagenomeja, joista puuttuu vierasgeeni. Tämän vuoksi on usein välttämätöntä viedä poxvirusgenomiin selektiivinen merkkigeeni minkä tahansa muun halutun sekvenssin ohella, jotta vaadittavat harvinaiset yhdistelmä-dna-tuotteet voitaisiin vaikeuksitta todeta ilman, että eristettyjä DNA- 25 tuotteita lukuisista yksittäisistä virusklooneista joudutaan karakterisoimaan. Eukaryoottisten sytoplasma-dna-virusten puhdistetut DNA:t eivät kykene replikoitumaan, kun ne viedään alttiisiin isäntäsoluihin käyttäen menetelmiä, jotka käynnistävät 30 tartuntoja virus-dna:illa, jotka replikoituvat tumassa. Tämä sytoplasma-dna-virusten DNA:iden tartutuskyvyn puute on seurausta siitä, että virusspesifisen RNA-polymeraasin, joka normaalisti on tarttuvien virionien sisällä, on käynnistettävä viruksen transkriptio tartutetuissa soluissa. 35 Poxvirus-DNA:n "reaktivaatio", jossa genomi-dna, joka oli inaktivoidussa, ei-tartutuskykyisessä poxvirus-

6 4 hiukkasessa, pakattiin tarttuviin virioneihin kanssatartuttamalla elinkelpoisella avustajapoxviruksella, on tunnettu vuosikymmeniä. Katso esimerkiksi Fenner ja Woodroofe, Virology 11 (1960) V Sam ja Dumbell osoitti- 5 vat, että eristetty, ei-tarttuva genomi-dna ensimmäisestä poxviruksesta voitiin pakata tarttuviin poxvirusvirioneihin soluissa, jotka oli tartutettu toisella, geneettisesti erilaisella poxviruksella. Sam ja Dumbell, Ann.Virol. (Institut Pasteur) 132E (1981) 135. Tämä paljaan poxvirus-dna:n 10 pakkaus osoitettiin ensin transfektoimalla ei-modifioitu DNA, joka käsitti ensimmäisen villityyppiortopoxvirusgenomin ja oli eristetty virioneista tai tartutetuista soluista, soluihin, jotka on tartutettu toisella luonnollisesti esiintyvällä ortopoxvirusgenomilla. Kuitenkaan hete- 15 rologista pakkaamista, eli DNA:n yhdestä poxvirussuvusta (ortopox, esimerkiksi) käyttäen toisen suvun (esim. lintupox) elinkelpoisia virioneja, ei ole toistaiseksi osoitettu. Solunsisäisen DNA-yhdistämisen käytöstä yhdistelmä- 20 DNA-poxvirusgenomin rakentamiseksi, joka ilmentää eipoxvirusgeenejä, raportoitiin vähän sen jälkeen, kun Sam ja Dumbell ensimmäisen kerran raportoivat paljaan poxvirus- DNA:n solunsisäisestä pakkaamisesta poxvirusvirioneihin sekä merkkipelastuksesta solunsisäisellä DNA-yhdistämisellä 25 DNA-fragmentteja käyttäen. Katso Panicali ja Paoletti; 1982; Mackett et al., Oleellisessa kirjallisuudessa seuraavalta vuosikymmeneltä ei kuitenkaan ilmeisesti dokumentoida suoraa molekyylikloonausta eli minkä tahansa eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruksen, etenkin poxviruksen, 30 modifioidun genomin rakentamista yksinomaan solunulkoista geenimanipulaatiota käyttäen. Kirjallisuudesta ei edes löydy todisteita, että olisi laajalti tunnustettu mitään etua, joka mandollisesti saataisiin tällaisella suoran kloonauksen lähestymistavalla. Päin vastoin arvovaltaisessa tut- 35 kielmassa on sanottu, että suora molekyylikloonaus ei ole käytännöllistä poxvirusten geenimanipulaation yhteydessä,

7 5 koska poxvirus-dna ei ole tarttuva. F. Fenner, R. Wittek ja K.R. Dumbell, "The Poxviruses", Academic Press, Muutkin alalla työskentelevät ovat samoin vähätelleet poxvirus- DNA:iden endonukleolyyttistä pilkkomista ja uudelleenliga- 5 tointia, vaikka ovatkin myöntäneet pelastusmandollisuuden yhdistelmä-dna-poxvirusgenomin käsittävällä eristetyllä tarttuvalla virus-dna:lla. Katso esimerkiksi Mackett ja Smith, J. Gen. Virol. 67 (1986) Lisäksi tuoreissa katsauksissa tuodaan esiin väittämä, jonka mukaan 10 ainoa toteuttamiskelpoinen tapa yhdistelmä-dna-poxvirusgenomin rakentamiseksi on menetelmillä, jotka edellyttävät solunsisäistä DNA-yhdistämistä. Katso Miner ja Hruby, Tibtech 8 (1990) 20-25, ja Moss ja Flexner, Ann.Rev.Immunol. 5 (1987) Tämän vuoksi esillä olevan keksinnön päämäärä on antaa käyttöön menetelmä modifioitujen genomien rakentamiseksi eukaryoottisista sytoplasma-dna-viruksista, etenkin poxviruksista, joka menetelmä ohittaa edellä mainitut rajoitukset, jotka liittyvät tavanomaisiin solunsisäiseen 20 DNA-yhdistämiseen perustuviin tekniikoihin. Esillä olevan keksinnön toinen päämäärä on antaa käyttöön sytoplasma-dna-virusgenomin rakennustekniikoita, joilla saadaan oleellisesti korkeampia saantoja yhdistelmä- DNA-tuotteita kuin olemassa olevalla metodiikalla. 25 Tämän keksinnön edelleen seuraava päämäärä on antaa käyttöön menetelmiä sytoplasma-dna-viruksen genomin modifioimiseksi suoraan modifioimalla genomivirus-dna:ta ja solunsisäisesti pakkaamalla modifioitu virus-dna virioneihin avustajavirusfunktioiden avulla. 30 Tämän keksinnön seuraava päämäärä on antaa käyttöön menetelmiä sytoplasma-dna-viruksen genomin rakentamiseksi, joilla menetelmillä tuotetaan yhdessä yhdistelmä-dnareaktiovaiheessa modifioituja genomeja, joissa vieras-dnasegmentti on insertoitu kummassakin kandesta mandollisesta 35 suuntauksesta, sekä modifioituja genomeja, joissa on vieras-dna-segmentin monia insertioita.

8 6 Tämän keksinnön edelleen seuraava päämäärä on antaa käyttöön modifioituja DNA-molekyylejä, jotka soveltuvat vierasgeenien suoraan molekyylikloonaukseen modifioituun sytoplasma-dna-virusgenomiin, ja jotka käsittävät kaksi 5 osaa genomivirus-dna:ta, jotka on tuotettu pilkkomalla sekvenssispesifisellä endonukleaasilla kohdassa, joka on virusgenomissa ainutlaatuinen. Tämän keksinnön edelleen seuraava päämäärä on antaa käyttöön sytoplasma-dna-virus, etenkin poxvirus, jonka ge- 10 uomia on modifioitu ja joka käsittää vieras-dna:n insertoituna sekvenssispesifisen endonukleaasin ainutlaatuiseen pilkkomiskohtaan. Tämän keksinnön seuraava päämäärä on antaa käyttöön plasmideja, jotka helpottavat geenikasettien rakentamista 15 ja siirtämistä sytoplasma-dna-virukseen, etenkin poxvirukseen, käyttäen suoraa molekyylikloonausta. Näiden ja muiden päämäärien saavuttamiseksi esillä olevan keksinnön yhden näkökohdan mukaan annetaan käyttöön menetelmä modifioidun eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruk- 20 sen tuottamiseksi suoraan molekyylikloonaamalla modifioitu DNA-molekyyli, joka käsittää modifioidun sytoplasma-dnavirusgenomin. Keksinnön mukainen menetelmä käsittää vaiheet, joissa (I) modifioidaan solunulkoisissa olosuhteissa puhdistettua DNA-molekyyliä, joka käsittää ensimmäisen sy- 25 toplasma-dna-virusgenomin, modifioidun DNA-molekyylin tuottamiseksi, joka käsittää modifioidun virusgenomin; (II) modifioitu DNA-molekyyli viedään ensimmäiseen isäntäsoluun, joka pakkaa modifioidun DNA-molekyylin tarttuviin virioneihin; ja (III) ensimmäisestä isäntäsolusta otetaan talteen 30 tarttuvia virioneja, jotka käsittävät modifioidun virusgenomin. Tämän menetelmän yhden suoritusmuodon mukaan vaihe, jossa DNA-molekyyliä modifioidaan solunulkoisissa olosuhteissa, käsittää vaiheen, jossa DNA-molekyyliä pilkotaan 35 sekvenssispesifisellä endonukleaasilla. Toisen suoritusmuodon mukaan vaihe, jossa DNA-molekyyliä modifioidaan, käsit-

9 7 tää vaiheen, jossa ensimmäinen DNA-sekvenssi insertoidaan ensimmäiseen virusgenomiin. Edullisesti tämä ensimmäinen DNA-sekvenssi insertoidaan ensimmäiseen genomiin sekvenssispesifisen endonukleaasin pilkkomiskohtaan. Huomattakoon, 5 että kuvattaessa tässä nimeltä nimenomaista sekvenssispesifistä endonukleaasia, kuten bakteerirestriktioentsyymiä, tuo nimi samoin merkitsee mainitun nukleaasin kaikkia mandollisia isoskitsomeerejä. Mandollisesti vaiheesee, jossa DNA-molekyyliä modi- 10 fioidaan tämän menetelmän mukaan, käsittää niinikään vaiheen, jossa käytetään fosfataasia fosfaattiryhmän poistamiseksi DNA-segmentin päästä, joka on tuotettu pilkkomalla DNA-molekyyliä sekvenssispesifisellä endonukleaasilla. Tämän menetelmän joissakin suoritusmuodoissa ensim- 15 mäinen virusgenomi on vaccinia-virusgenomi ja ainutlaatuinen kohta on pilkkomiskohta bakteerirestriktioendonukleaasille NotI tai bakteerirestriktioendonukleaasille SmaI. Ensimmäinen genomi saattaa niinikään käsittää toisen DNAsekvenssin, joka ei luonnollisesti esiinny eukaryoottisessa 20 sytoplasma-dna-virusgenomissa, jolloin tämä toinen DNAsekvenssi käsittää ainutlaatuisen pilkkomiskohdan. Esimerkiksi ensimmäinen genomi voi olla siipikarjapoxvirusgenomi, joka käsittää Escherichia coli -B-galaktosidaasigeenisekvenssin, ja ainutlaatuinen kohta on pilkkomiskohta baktee- 25 rirestriktioendonukleaasille NotI, joka sijaitsee tuossa geenissä. Tämän menetelmän muissa muodoissa ensimmäinen DNAsekvenssi insertoidaan ensimmäiseen virusgenomiin ensimmäisen pilkkomiskohdan ensimmäiselle sekvenssispesifiselle en- 30 donukleaasille ja toisen pilkkomiskohdan toiselle sekvenssispesifiselle endonukleaasille väliin. Mandollisesti ensimmäinen ja toinen pilkkomiskohta ovat molemmat ainutlaatuisia ensimmäisessä virusgenomissa. Tämän keksinnön mukaisen menetelmän muiden suori- 35 tusmuotojen mukaan ainakin osa ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka insertoidaan ensimmäiseen genomiin, on promoot-

10 8 torin transkriptiokontrollissa. Tämä promoottori saattaa sijaita ensimmäisessä DNA-sekvenssissä, joka insertoidaan ensimmäiseen virusgenomiin. Vaihtoehtoisesti promoottori sijaitsee modifioidussa virusgenomissa ylävirtaan ensimmäi- 5 sestä DNA-sekvenssistä, joka insertoidaan ensimmäiseen genomiin. Joissakin tapauksissa promoottoria käyttää RNApolymeraasi, jota koodittaa modifioitu virusgenomi. Tämä promoottori saattaa samoin soveltua modifioitavan eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruksen transkription käynnis- 10 tykseen RNA-polymeraasin toimesta. Tietyissä menetelmissä promoottori käsittää modifikaation eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruksen luonnollisesti esiintyvästä promoottorista. Vaihe, jossa DNA-molekyyliä modifioidaan tämän keksinnön mukaisella menetelmällä, saattaa käsittää vaiheen, 15 jossa ensimmäisestä genomista poistetaan DNA-sekvenssi. Vaihtoehtoisesti tämä vaihe käsittää vaiheen, jossa ensimmäisessä genomissa substituoidaan DNA-sekvenssi. Menetelmä ensimmäisen virusgenomin modifioimiseksi saattaa myös käsittää vaiheen, jossa ensimmäinen isäntäsolu 20 tartutetaan toisella eukaryoottisella sytoplasma-dnaviruksella, joka käsittää toisen genomin, joka ilmennetään modifioidun virusgenomin pakkaamiseksi tartuttaviin virioneihin. Edullisesti vaihe, jossa modifioitu DNA-molekyyli viedään ensimmäiseen isäntäsoluun, suoritetaan noin tunnin 25 kuluttua vaiheesta, jossa ensimmäinen isäntäsolu tartutetaan toisella eukaryoottisella sytoplasma-dna-viruksella. Tämän menetelmän yhdessä muunnoksessa ensimmäinen isäntäsolu valitaan siten, että toisen genomin ilmennys ensimmäisessä isäntäsolussa ei tuota tarttuvia virioneja, 30 jotka käsittävät toisen virusgenomin. Esimerkiksi kun modifioitu virusgenomi on modifioitu vaccinia-virusgenomi ja toinen genomi on siipikarjapoxvirusgenomi, valittu ensimmäinen isäntäsolu on nisäkässolu. Menetelmän virusgenomin modifioimiseksi joissakin 35 muodoissa vaihe, jossa modifioidun virusgenomin käsittävät tarttuvat virionit otetaan talteen, käsittää vaiheen, jossa

11 9 toinen isäntäsolu tartutetaan ensimmäisen isäntäsolun tuottamilla tarttuvilla virioneilla. Tämä suoritetaan sellaisissa olosuhteissa, että toisen genomin ilmennys toisessa isäntäsolussa ei tuota tarttuvia virioneja, jotka käsittä- 5 vät toisen genomin. Esimerkiksi kun modifioitu virusgenomi on modifioitu vaccinia-virusgenomi, toinen genomi voi olla siipikarjapoxvirusgenomi, ja toinen isäntäsolu on nisäkässolu. Vaihtoehtoisesti modifioitu virusgenomi käsittää funktionaalisen isäntäaluegeenin, joka on edellytys tarttu- 10 vien virionien tuottamiseksi toisessa isäntäsolussa, ja toisesta genomista puuttuu tuo funktionaalinen isäntäaluegeeni. Tätä havainnollistaa tapaus, jossa modifioitu virusgenomi on modifioitu vaccinia-virusgenomi, joka käsittää funktionaalisen isäntäaluegeenin, joka on edellytys tarttu- 15 vien virionien tuottamiseksi ihmissolussa, ja toinen isäntäsolu on ihmissolu. Tämän menetelmän muissa muodoissa modifioitu virusgenomi käsittää selektiivisen merkkigeenin, toisesta genomista puuttuu tuo selektiivinen merkkigeeni ja vaihe, jossa 20 toinen isäntäsolu tartutetaan, suoritetaan olosuhteissa, jotka valikoivat genomin suhteen, joka ilmentää tuon selektiivisen merkkigeenin. Edullisesti selektiivisen merkkigeenin ilmentäminen toisessa isäntäsolussa tuottaa toiselle isäntäsolulle resistenssin sytotoksiselle lääkkeelle, joka 25 on läsnä tartutuksen aikana tasolla, joka on riittävä valikointiin genomin suhteen, joka ilmentää selektiivisen merkkigeenin. Esillä olevan keksinnön toisen näkökohdan mukaan käyttöön annetaan modifioitu eukaryoottinen sytoplasma-dna- 30 virus, joka tuotetaan suoraan molekyylikloonaamalla modifioitu virusgenomi menetelmillä, joista edellä esitetään yhteenveto. Esillä olevan keksinnön edelleen seuraava näkökohta koskee modifioitua eukaryoottista sytoplasma-dna-virusta, 35 joka käsittää modifioidun virusgenomin, jolloin tuo modifoitu virusgenomi käsittää: (I) ensimmäisen genomin ensim-

12 1 0 mäisestä eukaryoottisesta sytoplasma-dna-viruksesta. Tämä ensimmäinen genomi käsittää pilkkomiskohdan sekvenssispesifiselle endonukleaasille ja tämä pilkkomiskohta on ainutlaatuinen kohta ensimmäisessä genomissa. Modifioitu ge- 5 nomi käsittää edelleen (II) ensimmäisen DNA-sekvenssin insertoituna ainutlaatuiseen kohtaan ensimmäisessä genomissa. Keksinnön tämän näkökohdan pääasiallisen suoritusmuodon mukaan ensimmäinen DNA-sekvenssi ei luonnollisesti esiinny eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruksen genomissa. 10 Joissakin edullisissa tapauksissa ensimmäinen genomi on vaccinia-virusgenomi ja ainutlaatuinen kohta on pilkkomiskohta bakteerirestriktioendonukleaasille, joka valitaan NotI:n ja SmaI:n muodostamasta ryhmästä. Ensimmäinen genomi voi käsittää toisen DNA-sek- 15 venssin, joka ei luonnollisesti esiinny eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruksen genomissa, jolloin tuo toinen DNAsekvenssi käsittää ainutlaatuisen pilkkomiskohdan. Yhdessä esimerkissä ensimmäinen genomi on siipikarjapoxvirusgenomi, joka käsittää toisen DNA-sekvenssin Escherichia coli 20 galaktosidaasigeenille ja ainutlaatuinen kohta tuossa geenissä on pilkkomiskohta bakteerirestriktioendonukleaasille NotI. Joissakin tämän keksinnön mukaisissa modifioiduissa viruksissa ainakin osa mainitusta ensimmäisestä DNA- 25 sekvenssistä, joka insertoidaan ainutlaatuiseen kohtaan, on promoottorin transkriptiokontrollissa. Tämä promoottori sijaitsee ensimmäisessä DNA-sekvenssissä, joka insertoidaan ensimmäiseen genomiin. Joissakin tapauksissa ensimmäinen genomi on poxvirusgenomi ja promoottori käsittää poxvirus- 30 promoottorin, joko luonnollisesti esiintyvän poxviruspromoottorin tai sen modifikaation. Esillä olevan keksinnön edelleen seuraava näkökohta koskee modifioitua eukaryoottista sytoplasma-dna-virusta, joka käsittää modifioidun virusgenomin, jossa modifioitu 35 virusgenomi käsittää (I) ensimmäisen genomin ensimmäisestä eukaryoottisesta sytoplasma-dna-viruksesta. Tämä ensimmäi-

13 11 nen genomi käsittää ensimmäisen pilkkomiskohdan ensimmäiselle sekvenssispesifiselle endonukleaasille ja toisen pilkkomiskohdan toiselle sekvenssispesifiselle endonukleaasille. Nämä molemmat pilkkomiskohdat ovat ainutlaatuisia 5 kohtia ensimmäisessä genomissa. Modifioitu genomi tässä modifioidussa viruksessa käsittää edelleen (II) ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka on insertoitu ensimmäiseen genomiin ensimmäisen ainutlaatuisen kohdan ja toisen ainutlaatuisen kohdan väliin. Tämän modi- 10 fioidun viruksen joissakin muodoissa ensimmäinen DNAsekvenssi ei esiinny luonnollisesti eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruksen genomissa. Joissakin tapauksissa ensimmäinen genomi käsittää toisen DNA-sekvenssin, joka ei esiinny luonnollisesti eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruk- 15 sen genomissa, ja tuo toinen DNA-sekvenssi käsittää ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka on insertoitu ensimmäisen ainutlaatuisen kohdan ja toisen ainutlaatuisen kohdan väliin. Esimerkiksi tämä modifioitu virus voi käsittää ensimmäisen genomin, joka on vaccinia-virusgenomi, ja sekä ensimmäinen 20 ainutlaatuinen kohta että toinen ainutlaatuinen kohta on pilkkomiskohta bakteerirestriktioendonukleaasille, joka valitaan NotI:n, SmaI:n, Apal:n ja RsrII:n muodostamasta ryhmästä. Edelleen seuraava esillä olevan keksinnön mukainen 25 modifioitu eukaryoottinen sytoplasma-dna-virus käsittää modifioidun virusgenomin, joka käsittää (I) ensimmäisen genomin ensimmäisestä eukaryoottisesta sytoplasma-dna-viruksesta. Tämä ensimmäinen genomi käsittää ensimmäisen DNAsekvenssin, ja tämä ensimmäinen DNA-sekvenssi käsittää 30 pilkkomiskohdan sekvenssispesifiselle endonukleaasille, joka kohta on ainutlaatuinen kohta tässä modifioidussa virusgenomissa. Tämä tämän modifioidun viruksen genomi käsittää edelleen (II) promoottorin, joka sijaitsee siten, että DNAsekvenssi, joka on insertoitu virusgenomissa ainutlaatui- 35 seen kohtaan, on promoottorin transkriptiokontrollissa. Tietyissä muodoissa tästä ensimmäisestä DNA-sekvenssistä

14 12 puuttuu luennanaloituskodoni promoottorin ja ainutlaatuisen insertiokohdan välistä. Tämä ensimmäinen DNA-sekvenssi voi olla sekvenssi, joka ei luonnollisesti esiinny eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruksen genomissa. Tästä modifioidusta 5 viruksesta esimerkki on virus, jossa ensimmäinen genomi on vaccinia-virusgenomi, ja ensimmäinen DNA-sekvenssi käsittää monikloonauskohdan, joka käsittää pilkkomiskohdat bakteerirestriktioendonukleaaseille NotI, SmaI, ApaI ja RsrII. Esillä olevan keksinnön edelleen seuraava näkökohta 10 koskee tämän keksinnön mukaista modifioitua eukaryoottista sytoplasma-dna-virusta, jossa ensimmäinen sekvenssi modifioidussa virusgenomissa (kiinnostava insertoitu sekvenssi) ilmennetään isäntäsolussa, mikä johtaa proteiinin tuotantoon. 15 Toisen näkökohdan mukaan esillä oleva keksintö koskee myös DNA-molekyyliä, joka käsittää esillä olevan keksinnön mukaisen modifioidun viruksen modifioidun virusgenomin. Erityisesti tämän DNA-molekyylin jotkut muodot käsittävät yhden pään eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruksen 20 modifioidusta virusgenomista, jossa (I) tuo pää modifioidusta virusgenomista käsittää DNA-sekvenssin, joka ei luonollisesti esiinny eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruksen genomissa. Tässä DNA-molekyylissä (II) modifioitu virusgenomi käsittää pilkkomiskohdan sekvenssispesifiselle endo- 25 nukleaasille, joka kohta on ainutlaatuinen kohta modifioidussa virusgenomissa; ja (III) DNA-molekyylissä on pää, joka on homologinen päähän nähden, joka muodostuu pilkkomalla ainutlaatuinen kohta modifioidussa virusgenomissa sekvenssispesifisellä endonukleaasilla. 30 Tämän DNA-molekyylin joissakin muodoissa DNAsekvenssi, joka ei esiinny luonnollisesti eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruksen genomissa, käsittää pilkkomiskohdan sekvenssispesifiselle endonukleaasille, joka kohta on ainutlaatuinen kohta modifioidussa virusgenomissa. 35 Tämän keksinnön edelleen seuraava näkökohta koskee pakkausta eukaryoottisen sytoplasma-dna-viruksen modifioi-

15 13 dun virusgenomin suoraksi molekyylikloonaamiseksi, joka pakkaus käsittää: (I) tämän keksinnön mukaisia puhdistettuja DNA-molekyylejä; (II) DNA-ligaasin; ja (III) puskuri- ja reagenssiliuoksia, jotka soveltuvat DNA-segmenttien liga- 5 toimiseksi yhteen modifioidun DNA-molekyylin valmistamiseksi, joka käsittää modifioidun virusgenomin. Yhdessä muodossa tämä pakkaus käsittää edelleen plasmidin, joka käsittää geeni-ilmennyskasetin, jota sivuavat kohdat pilkkomiselle sekvenssispesifisellä endonukleaasilla, jotka kohdat sopi- 10 vat tuon kasetin insertointiin ainutlaatuiseen pilkkomiskohtaan modifioidussa virusgenomissa, jota koodittaa pakkauksen DNA-molekyyli. Pakkaus voi edelleen käsittää ensimmäisen isäntäsolun ja toisen viruksen, joka soveltuu modifioidun virusgenomin pakkaukseen tarttuviin virioneihin. 15 Seuraavan näkökohdan mukaan tämä keksintö koskee plasmidia, joka käsittää DNA-segmentin, jossa on pilkkomiskohta bakteerirestriktioendonukleaasille NotI kummassakin päässä. Tässä plasmidissa tämä DNA-segmentti käsittää sekvenssispesifisen endonukleaasipilkkomiskohdan, joka on ai- 20 nutlaatuinen plasmidissa. Esimerkki tästä plasmidista kuviossa 1.3 esitetyn mukaisesti on nimeltään pn2 ja se käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 1. Tässä plasmidissa DNAsegmentti voi edelleen käsittää selektiivisen merkkigeenin poxviruspromoottorin transkriptiokontrollissa. Esimerkiksi 25 tällaisia plasmideja ovat plasmidit nimeltä pn2-gpta, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 2, ja pn2-gptb, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 3. Toinen keksinnön mukainen plasmidi sisältää DNAsegmentin, joka käsittää edelleen poxviruspromoottorin, jo- 30 ka on operatiivisesti kytketty DNA-sekvenssiin, joka käsittää restriktioendonukleaasipilkkomiskohdan. Täten tähän pilkkomiskohtaan insertoitu DNA-segmentti on tämän promoottorin transkriptiokontrollissa. Esimerkkejä ovat plasmidit nimeltä pal-s2, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 35 11, ja pa2-s2, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 12. Esimerkki tällaisesta plasmidista, joka käsittää edel-

16 14 leen selektiivisen merkkigeenin erillisen poxviruspromoottorin kontrollissa, on plasmidi pn2gpt-s4, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 14. Edelleen seuraava plasmidi käsittää poxvirusgeno- 5 mista segmentin, joka käsittää tuon poxviruksen tymidiinikinaasigeenin. Tätä tymidiinikinaasigeeniä on modifioitu aktiivisen tymidiinikinaasin ilmennyksen estämiseksi, kuten plasmideissa nimeltä phindj-2, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 4, ja phindj-3, joka käsittää sek- 10 venssin sekvenssitunnusnro 5. Toinen plasmidi käsittää poxviruspromoottorin, joka on operatiivisesti kytketty luennanaloituskodoniin. Tätä aloituskodonia seuraa välittömästi toinen restriktioendonukleaasipilkkomiskohta, joka on sopivasti sijoitettu sal- 15 limaan avoimen lukualueen luenta, joka alue on insertoitu tuohon toiseen restriktioendonukleaasipilkkomiskohtaan. Esimerkkejä tästä plasmidista ovat plasmidit nimeltä pal- S1, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 9, ja pa2- S1, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 10, sekä 20 plasmidi pn2gpt-s3a, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 13. Yksi nimenomainen tätä tyyppiä oleva plasmidi käsittää edelleen DNA-sekvenssin, joka koodittaa ihmisen protrombiinia, jolloin tämä DNA-sekvenssi on operatiivises- 25 ti kytketty poxviruspromoottoriin ja aloituskodoniin kuten esitetään kuviossa 5.1 plasmidilla nimeltään plasmidi pa1s1-pt, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 15. Seuraava plasmidi käsittää edelleen DNA-sekvenssin, joka koodittaa ihmisen plasminogeenia ja jossa on luen- 30 nanaloituskodoni, jolloin tämä DNA-sekvenssi on operatiivisesti kytketty poxviruspromoottoriin. Kuten esitetään kuviossa 5.2, tästä esimerkkejä ovat plasmidit, jotka on saatu pn2gpt-s4:stä, kuten pn2gpt-gpg, joka koodittaa ihmisen glu-plasminogeenia ja käsittää sekvenssin sekvenssitunnusn- 35 ro 17, ja pn2gpt-lpg, joka koodittaa lys-plasminogeenia ja käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 18.

17 15 Edelleen seuraava tämän keksinnön mukainen plasmidi kuten edellä käsittää edelleen DNA-sekvenssin, joka koodittaa ihmisen immuunikatoviruksen (HIV:n) gp160:ta ja jossa on luennanaloituskodoni ja joka on operatiivisesti kytketty 5 poxviruspromoottoriin kuten esitetään kuviossa 5.4 plasmidilla pn2gpt-gp160, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 19. Lopuksi toinen plasmidi käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa ihmisen von Willebrand -tekijää kuten esitetään kuviossa 6.2, jolloin esimerkki on nimeltään plasmidi 10 pvwf, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 20. Jotkut tämän keksinnön mukaiset plasmidit käsittävät sekvenssispesifisen endonukleaasipilkkomiskohdan, joka on ainutlaatuinen poxvirusgenomissa. Esimerkkejä esitetään kuviossa 4.3, mukaan lukien pao, joka käsittää sekvenssin 15 sekvenssitunnsunro 6, pal, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 7, ja pa2, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 8. Toinen plasmidi käsittää modifioidun EcoRI-K-fragmentin vaccinia-virus-dna:sta, josta K1L-isäntäaluegeeni on 20 poistettu kuten esitetään kuviossa 8.1. Kaksi esimerkkiä ovat pecok-dhr, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 21, ja pdhr-gpt, joka käsittää sekvenssin sekvenssitunnusnro 22. Esillä olevan keksinnön muut päämäärät, ominais- 25 piirteet ja edut tulevat ilmeisiksi seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta. Huomattakoon kuitenkin, että yksityiskohtainen kuvaus ja spesifiset esimerkit vaikkakin edustavat keksinnön edullisia suoritusmuotoja esitetään ainoastaan havainnollistamismielessä, koska erilaisia muutok- 30 sia ja modifikaatioita, jotka pysyttelevät keksinnön hengen ja kattavuuden puitteissa, tulee tämän yksityiskohtaisen kuvauksen nojalla alan ammattilaisille ilmeisiksi. Kuviossa 1.1 esitetään merkkigeenien ilmennys modifioiduilla poxvirusgenomeilla, jotka on tuotettu reaktivoi- 35 uralla paljas poxvirus-dna. Esitetään hopealla värjätty polyakryyliamidigeeli proteiineista, jotka on tuotettu paka-

18 16 tuilla viruksilla (vppg#1-vppg#8) ja villityyppi- (WT-) virusverrokeilla tartutettujen solujen viljelmäsupernatantteihin. Ylempi nuoli osoittaa plasminogeenimerkkinauhaa, ja alempi nuoli pääasiallisen eritetyn 35 K -vaccinia- 5 merkkiproteiinin nauhaa. Vyöhykkeet 1 ja 9, merkkiproteiineja; vyöhykkeet 2 ja 10, ihmisen plasminogeenistandardi (10 ng); vyöhyke 3, vaccinia-yhdistelmä-dna-vpgd (pakatun DNA:n lähde); vyöhykkeet 4-7 ja 11-14, vppg#1-8; vyöhykkeet 8 ja 15, villityyppivaccinia- (WR WT). 10 Kuvio 1.2 on kaaviokuva, joka esittää poxvirusgenomien suoraa kloonausta, jotka käsittävät geenikasetin merkkigeenin (E. coli -gpt-geenin) ilmentämiseksi vacciniaviruspromoottorin kontrollissa. Kuvio 1.3 on kaaviokuva plasmidien (pn2-gpta ja 15 pn2-gptb) rakentamisesta, jotka ovat prekursoreita geeniilmennyskasettien rakentamiseksi insertoimalla promoottori ja avoin lukualue. Tällaiset kasetit on suunniteltu suoraan molekyylisiirtoon vaccinia-virusvektoreihin käyttäen ainutlaatuistä insertiokohtaa ja valikoitavaa merkkigeeniä 20 (gpt), jota ohjaa vaccinia-viruspromoottori. MCS = monikloonauskohta. P7.5 = promoottori vaccinia--7.5k-polypeptidigeenille; Pll = promoottori vaccinia--11k-polypeptidigeenille. Nuolet osoittavat transkription promoottoreista suunnan. 25 Kuviosta 1.4 ilmenee, että poxvirusgenomit, jotka on tuotettu suoralla molekyylikloonauksella, sisältävät gpt-merkkigeenikasetin insertoituna ainutlaatuiseen (NotI) pilkkomiskohtaan, minkä osoittavat Southern blot -analyysit plakeista puhdistetuista virus-dna:ista, joita on pilkottu 30 HindIII-endonukleaasilla, käyttäen gpt-geenikoetinta. Vyöhyke 1, merkki-dna:t (HindIII:lla pilkottu fagi-lambda- DNA); vyöhykkeet 2 ja 3, villityyppivaccinia-virus- (WR-) DNA, jotka on leikattu HindIII:lla (500 ja vastaavasti 100 ng); vyöhykkeet 4-9, DNA:t soluista, jotka on tartutettu 35 plakeilla, jotka on merkitty ; vyöhykkeet 10-12, DNA:t soluista, jotka on tartutettu plakeilla

19 Nuolet osoittavat merkin restriktiofragmenttien kokoja kiloemäspareina. Kuvio 1.5 esittää edelleen modifioitujen poxvirus- DNA:iden rakenteita käyttäen Southern blot -määrityksiä No- 5 ti:llä pilkotuista DNA:ista soluista, jotka on tartutettu erilaisilla isolaateilla ja hybridisoitu gpt-geeni-koettimeen. Vyöhyke 1, merkki-dna:t (HindIII:lla pilkottu fagilambda-dna); vyöhyke 2, vaccinia-villityyppi- (WT-) DNA, jota on pilkottu NotI:llä (50 ng); vyöhykkeet 3-8, DNA:t 10 soluista, jotka on tartutettu yhdistelmä-dna-plakeilla nimeltä ; vyöhykkeet 9-11, DNA:t soluista, jotka on tartutettu plakeilla Kuvio 1.6 esittää DNA:iden villityyppi- (WT-) vaccinia-viruksesta ja modifioidusta kloonista (vp7) vertailua 15 käyttäen DNA-fragmenttien etidiumbromidivärjäystä, jotka on pilkottu mainituilla restriktioendonukleaaseilla ja erotettu agaroosigeelissä. Vyöhykkeet 1 ja 2, NotIpilkkomistuotteet WT:stä ja vp7:stä; vyöhykkeet 3 ja 4, HindIII-pilkkomistuotteet WT:stä ja vp7:stä; vyöhykkeet 5 20 ja 6, HindIII:lla ja NotI:llä yhteisesti pilkotut tuotteet WT:stä ja vp7:stä; vyöhykkeet 7 ja 8, PstIpilkkomistuotteet WT:stä ja vp7:stä; vyöhykkeet 9 ja 10, PstI:llä ja NotI:llä yhteisesti pilkotut tuotteet WT:stä ja vp7:stä; vyöhykkeet 11 ja 12, SalI-pilkkomistuotteet WT:stä 25 ja vp7:stä; vyöhyke 13, merkki-dna:t (ligatoitu ja HindIIIpilkottu fagi-lambda-dna; ja fagi-0x, joka on pilkottu HaeIII:11a). Nuolet vasemmalla osoittavat fragmenttikokoja (kiloemäspareissa) NotI:llä pilkotussa vaccinia--wt:stä; nuolet oikealla, merkkejä. Huomattakoon, että vyöhykkeet 1 30 ja 2 sisältävät noin 10 kertaa vähemmän DNA:ta kuin muut vyöhykkeet. Kuvio 1.7 esittää Southern blot -määritystä geelistä, joka esitetään kuviossa 1.6, käyttäen gpt-geenikoetinta. Nuolet osoittavat merkkikokoja. 35 Kuvio 1.8 esittää Southern blot -analyysejä tartutetuista soluista saaduista vaccinia-virus-dna:ista, jotka

20 18 on pilkottu NotI:llä ja hybridisoitu vaccinia-viruskoettimeen. Vyöhykkeet 1-4, DNA:t soluista, jotka on tartutettu plakeilla Al - A4; vyöhykkeet 5-8, plakit Cl - C4; vyöhykkeet 9-12, plakit El - E4; vyöhyke 13, vacci- 5 nia--wt-dna; vyöhyke 14, DNA ei-tartutetuista CV-1- isäntäsoluista; vyöhyke 15, merkki-dna:t (HindIII-pilkottu fagi-lambda-dna; ja fagi-0x, joka on pilkottu HaeIII:11a). Kuviossa 1.9 esitetään Southern blot samoista näytteistä kuin geelissä, joka esitetään kuviossa 1.8, käyttäen 10 gpt-geenikoetinta. Vyöhykkeet 1-12 kuten kuviossa 1.8; vyöhyke 13, DNA ei-tartutetuista CV-1-isäntäsoluista; vyöhyke 14, vaccinia--wt-dna; vyöhyke 15, merkki-dna:t (HindIII-pilkottu fagi-lambda-dna; ja fagi-0x, jota on pilkottu HaeIII:11a). 15 Kuvio 1.10 esittää Southern blot -määritystä samoista virus-dna:ista kuin geelissä kuviossa 1.8, restriktiopilkottuina PstI:llä, käyttäen gpt-geenikoetinta. Vyöhykkeet 1-12 kuten kuviossa 1.8; vyöhyke 13, DNA eitartutetuista CV-1-isäntäsoluista; vyöhyke 14, vaccinia-- 20 WT-DNA; vyöhyke 15, merkki-dna:t (HindIII-pilkottu fagilambda-dna; ja fagi-0x, joka on pilkottu HaeIII:11a) Kuviossa 1.11 esitetään kaavio vaccinia-virus- DNA:iden modifioiduille PstI-"C"-fragmenteille ennustettu rakenne, joka käsittää gpt-geenikasetin yhden tai kaksin- 25 kertaisen insertion. P = PstI- ja N = NotI-pilkkomiskohdat. Numerot osoittavat vastaavien PstI-fragmenttien kokoja; lihavan tyypin numerot osoittavat fragmentteja, joiden odotetaan hybridisoituvan gpt-geenikoettimeen. Nuolet osoittavat gpt-geenin (800 ep) transkription suuntaa vaccinia-virus- 30 promoottorista (300 ep). Kuvio 2.1 esittää analyysejä yhdistelmä-dnalintupox- (siipikarjapox-, FP-) genomeista, jolloin pilkottiin restriktioendonukleaasilla NotI ja erotus suoritettiin FIGE:llä 1-%:isessa agaroosigeelissä. Vyöhyke 5, merkki 35 (fagi-lambda-hindiii-fragmentit, ei-pilkottu fagi-lambda ja vaccinia--wr); vyöhykkeet 1 ja 2, siipikarjapoxvirus-

21 19 HP1.441-DNA, ei-pilkottu ja pilkottu NotI:llä; vyöhykkeet 3 ja 4, yhdistelmäsiipikarjapoxvirus-f-tk2a-dna, ei-pilkottu ja pilkottu NotI:llä. Kuvio 2.2 esittää vierasgeenejä ilmentävien siipi- 5 karjapoxvirusten rakentamista suoralla molekyylikloonauksella. Geeni-ilmennyskasetti, joka koostuu E. coli -gptgeenistä poxviruspromoottorin (P) kontrolloimana, ligatoidaan siipikarjapoxviruksen (f-tk2a) oikeaan ja vasempaan DNA-varteen (ra ja vastaavasti la), jotka on saatu pilkko- 10 maila NotI:llä. Pakkaus suoritetaan käyttäen siipikarjapoxavustajavirusta (kanta HP2) kananpojan alkion sidekudosmuodostussoluissa. Kuvio 3.1 esittää menetelmää modifioitujen poxvirusten rakentamiseksi solunulkoisella genomimanipulaatiolla 15 ja solunsisäisellä pakkaamisella. Geenikasetti, joka koostuu gpt-geenistä vaccinia-viruspromoottorin kontrolloimana, ligatoidaan "oikeaan varteen" (ra) ja "vasempaan varteen" (la) vaccinia-virus-dna:sta, jota on pilkottu ainutlaatuisessä kohdassa endonukleaasilla SmaI. Pakkaus suoritetaan 20 siipikarjapoxavustajavirusta (kanta HP1.441) käyttäen kananpojan alkion sidekudosmuodostussoluissa. P1 = promoottori vaccinia-virusgeenille, joka koodittaa 7,5 kda:n polypeptidiä. Kuviossa 3.2 esitetään, että rakennetut vaccinia- 25 virusgenomit, jotka on pakattu käyttäen siipikarjapoxavustajavirusta, sisältävät odotetun insertin ainutlaatuisessä SmaI-pilkkomiskohdassa, Southern blot -analyyseillä määritettynä. Tartutetuista soluista eristetty kokonais-dna pilkottiin HindIII:11a, ja siirtokopio hybridisoitiin gpt- 30 geenikoettimeen. Vyöhykkeet 1-8, DNA:t soluista, jotka oli tartutettu plakeilla nimeltä F F12.9; vyöhykkeet 9-13, plakit F F13.5; vyöhykkeet 14 ja 15, HindIIIpilkottu DNA, joka eristettiin ei-tartutetuista soluista, ja vastaavasti soluista, jotka oli tartutettu vaccinia-- 35 (WR-villityyppi-) viruksella; vyöhyke 16, merkit (HindIII-

22 20 pilkottu fagi-lambda-dna). DNA vyöhykkeessä 8 ei hybridisoidu, koska virusisolaatti nro F12.9 ei replikoidu. Kuviossa 3.3 esitetään kaaviohahmotelma modifioitujen vaccinia-virusgenomien odotetuille rakenteille, joissa 5 on geenikasetti insertoituna ainutlaatuiseen SmaI-kohtaan, etenkin virusten modifioidut HindIII-"A"-fragmentit, joissa on yksin- ja kaksinkertaisia insertointeja. H = HindIII- ja S = SmaI-restriktioendonukleaasipilkkomiskohdat. Numerot osoittavat HindIII-fragmenttien kokoja, jolloin lihavalla 10 merkityt osoittavat fragmentteja, joiden odotetaan hybridisoituvan gpt-geenikoettimeen. gpt-geenikasetti koostuu vaccinia-viruspromoottorista (koko noin 300 ep), jota sisäinen HindIII-kohta erottaa gpt-sekvensseistä (noin 800 ep). Nuolet osoittavat gpt-geenin transkription suunnan. 15 Kuviossa 4.1 esitetään kaaviokuva vaccinia-virusvektorin vdtk rakentamiseksi, jossa on modifioitu tymidiinikinaasi- (tk-) geeni. WR-WT = vaccinia-viruksen (VV) villityypin (WT) Western Reserve - (WR-) kanta. Paneelissa A esitetään menetelmä käyttäen vain vaccinia-virusgenomin 20 suoraa molekyylimodifikaatiota, mukaan lukien ei-toivottujen NotI- ja SmaI-kohtien deleetio. Paneelissa B esitetään vaihtoehtoinen lähestymistapa NotI-kohdan poistamiseksi käyttäen merkkipelastustekniikoita vaccinia-viruksen ja modifioidun plasmidin kanssa. Paneelissa C esitetään vaihto- 25 ehtoinen menetelmä SmaI-kohdan deletoimiseksi merkkipelastuksella. Kuvio 4.2 esittää vaccinia-virusvektorin (vdtk) rakentamista, jossa tymidiinikinaasi- (tk-) geeni on korvattu monikloonauskohdalla. Nuoli osoittaa vaccinia-virus-tk- 30 geenin (VV-tk) transkription käynnistymistä ja suuntaa HindIII-J-fragmentissa, joka on kloonattu plasmidiin phind-j- 1. tk-geeni korvattiin kuten on esitetty ja lopullista plasmidia phindj-3 käytettiin modifioidun HindIII-Jfragmentin insertoimiseksi vaccinia-virukseen. 35 Kuviossa 4.3 esitetään plasmidien (pal ja pa2) rakentaminen, jotka ovat prekursoreita geeni-ilmennyskaset-

23 21 tien rakentamiseksi, insertoimalla promoottori ja avoin lukualue. Tällaiset kasetit sopivat suoraan molekyylisiirtoon vaccinia-virusvektoriin vdtk käyttäen suunnattua (pakotettua) kloonausta. 5 Kuviossa 4.4 esitetään plasmidien (pal-s1 ja pa2- S1) rakentaminen, jotka käsittävät geeni-ilmennyskasetteja, jotka sopivat avointen lukualueiden liittämiseen synteettiseen poxviruspromoottoriin (S1) ja luennanaloituskodoniin. Kasetit on suunniteltu suoraan molekyylisiirtoon vaccinia- 10 virusvektoriin vdtk pakotetulla kloonauksella. Sl-promoottori esiintyy eri tavalla suuntautuneena näissä kandessa plasmidissa, minkä osoittavat nuolet, jotka osoittavat transkriptiosuunnat. Kuviossa 4.5 esitetään plasmidien (pal-s2 ja pa2-15 S2) rakentaminen, jotka käsittävät geeni-ilmennyskasetteja, jotka sopivat avointen lukualueiden, joissa jo on luennanaloituskodoni, liittämiseen synteettiseen poxviruspromoottoriin (S2) ennen suoraa molekyylisiirtoa vacciniavirusvektoriin vdtk pakotetulla kloonauksella. S2-promoot- 20 tori esiintyy eri tavalla suuntautuneena näissä kandessa plasmidissa, minkä osoittavat transkription suunnat osoittavat nuolet. Kuviossa 4.6 esitetään plasmidien pn2-gpta ja pn2- gptb rakentaminen. 25 Kuviossa 4.7 esitetään plasmidien (pn2gpt-s3a ja pn2gpt-s4) rakentaminen, jotka käsittävät geeni-ilmennyskasetteja, jotka sopivat avoimen lukualueen, josta joko puuttuu (S3A) tai jossa on (S4) luennanaloituskodoni, liittämiseen synteettiseen promoottoriin (S3A tai vastaavasti 30 S4) ennen suoraa molekyylisiirtoa ainutlaatuiseen kohtaan vaccinia-virusvektorissa vdtk. Lyhenteet ovat kuten kuviossa 1.3. Kuviossa 5.1 esitetään geeni-ilmennyskasettiplasmidin (pa1s1-pt) rakentaminen ihmisprotrombiinin ilmen- 35 tämiseksi vaccinia-virusvektorissa vdtk. Lyhenteet ovat kuten kuviossa 1.3. Nuolet osoittavat transkription suunnan.

24 22 Kuviossa 5.2 esitetään geeni-ilmennyskasetti-plasmidin (pn2gpt-gpg) rakentaminen ihmisen glu-plasminogeenin ilmentämiseksi vaccinia-virusvektorissa vdtk. S4 = synteettinen poxviruspromoottori; muut lyhenteet ovat kuten kuvi- 5 ossa 1.3. Kuviossa 5.3 esitetään geeni-ilmennyskasettiplasmidin (pn2gpt-lpg) rakentaminen ihmisen lys-plasminogeenin ilmentämiseksi vaccinia-virusvektorissa vdtk. Lyhenteet ovat kuten kuviossa Kuviossa 5.4 esitetään geeni-ilmennyskasetti-plasmidin (pn2gpt-gp160) rakentaminen ihmisvirusantigeenin (HIV-gp160) ilmentämiseksi vaccinia-virusvektorissa vdtk. Lyhenteet ovat kuten kuviossa 1.3. Kuviossa 5.5 esitetään lähestymistapa modifioitujen 15 suoralla molekyylikloonauksella valmistettujen vacciniavirusten seulomiseksi sillä perusteella, että samanaikaisesti insertoidaan merkkigeeni (E. coli -lacz-geeni), joka tuottaa visuaalisesti erilaisen fenotyypin ("sininen" plakki verrattuna normaaleihin "valkeisiin" plakkeihin viruk- 20 sista, joista puuttuu lacz-geeni). Kuviossa 5.6 esitetään plasmidien ptzs4-lacza ja ptzs4-laczb rakentaminen. Kuviossa 6.1 esitetään vaccinia-virusvektorin (vs4) rakentaminen suuntaavan pääkloonauskohdan ollessa voimak- 25 kaan myöhäisvaccinia-viruspromoottorin (S4) kontrollissa. Kuviossa 6.2 esitetään modifioidun vaccinia-viruksen (vvwf) rakentaminen von Willebrand -tekijän ilmentämiseksi avoimen lukualueen suoralla molekyyli-insertoinnilla vaccinia-virusvektoriin vs4. vwf = von Willebrand -tekijä- 30 cdna. Nuoli osoittaa transkription suunnan S4-promoottorista. Kuviossa 7.1 esitetään lisätyn DNA:n määrän vaikutus vaccinia-virus-dna:n pakkaukseen siipikarjapoxavustajaviruksella nisäkäs- (CV-1-) soluihin, joissa siipikarjapox- 35 virus ei täysin replikoidu. Viisi viljelmää tartutettiin siipikarjapoxviruksella ja transfektoitiin sitten maini-

25 23 tuilla määrillä vaccinia-virus-dna:ta. Ensimmäinen sarake esittää viljelmää, johon ei ole lisätty DNA:ta tai siipikarjapoxvirusta, ja viides sarake viljelmää, johon ei ole lisätty DNA:ta mutta joka on tartutettu siipikarjapoxviruk- 5 sella. Kuviossa 8.1 esitetään vaccinia-viruksen (vdhr) rakentaminen, joka soveltuu käytettäväksi avustajaviruksena, jossa on isäntäaluemutaatioita, jotka estävät replikaation joissakin ihmissolulinjoissa. hr-geeni = isäntäaluegeeni, 10 joka sijaitsee vaccinia-viruksen EcoRI-K-fragmentissa; muut lyhenteet ovat kuten kuviossa 1.3. Kuviossa 9.1 esitetään plasmidien ps2gpt-p2 ja pp2gp160mn rakentaminen. Nuolet plasmidien alueella osoittavat vastaavien geenien transkription suunnan. 15 Kuviossa 9.2 esitetään kaavio virusten vp2-gp160mn- A ja vp2-gp160mn-b rakentamisesta. Kuviossa 9.3 esitetään kartat villityypin vacciniaviruksen PstI-E-fragmentille sekä gp160-geenejä käsittävien kimeeristen virusten PstI-fragmenteille. Nuolet osoittavat 20 gp160-geenin transkription suunnan. Numerot osoittavat fragmenttien kokoja kiloemäspareissa. Kuvio 9.4 esittää plasmidin pselp-gpt-l2 rakentamista. Nuolet osoittavat vastaavien geenien transkription suunnan. 25 Kuviossa 9.5 A) esitetään plasmidin pse1p-gp160mn rakentaminen ja kuviossa 9.5 B) esitetään sekvenssit, jotka ovat villityypin (sekvenssitunnusnro 73) ja modifioitujen gp160-geenien (sekvenssitunnusnro 75) luennanaloituskodonien ympärillä. 30 Kuvio 9.6 on kaaviokuva kimeeristen vacciniavirusten vse1p-gp160mna ja vp2-gp160mnb rakentamisesta. Nuolet osoittavat gp160-geenin transkription suunnan. Kuvio 9.7 on kartta villityypin vaccinia-viruksen SalI-F-fragmentista ja kimeeristen vaccinia-virusten vse1p- 35 gp160mna ja vp2-gp160mnb SalI-fragmenteista. Nuolet osoit-

26 24 tavat gp160-geenin transkription suunnan. Numerot osoittavat fragmenttikokoja kiloemäspareissa. Kuviossa 10.1 A) esitetään plasmidin pn2-gptaprots rakenne. Kaksoisgeenikasettia, joka koostuu gpt-geenistä 5 vaccinia--p7.5-promoottorin (P7.5) kontrolloimana ja ihmisen proteiini-s-geenistä (huprots) synteettisen poxviruspromoottorin (selp) kontrolloimana, sivuavat NotI-restriktiokohdat. Kuvio 10.1 B) esittää sekvenssejä, jotka ovat villityypin proteiini-s-geenin (sekvenssitunnusnro 77) ja 10 proteiini-s-geenin kimeereissä (sekvenssitunnusnro 79) luennanaloituskodonien ympärillä. Kuviossa 10.2 esitetään Southern blot -analyysi kimeerisistä vaccinia-viruksista, jotka käsittävät proteiini- S-geenin. A) Kokonaissolu-DNA:t, jotka on pilkottu SacI:llä 15 ja hybridisoitu vaccinia-villityyppi-saci-fragmenttiin. B) Sama materiaali pilkottuna NotI:llä ja seulottuna ihmisproteiini-s-sekvensseillä. C) Kaaviokuva villityyppi-saci-ifragmentista ja kimeerisestä SacI-fragmentista insertin ligatoinnin jälkeen. 20 Kuviossa 10.3 esitetään Western blot -analyysi plasmasta saadulle proteiini-s:lle (pdprots; vyöhykkeet 1 ja 2) ja yhdistelmä-dna-proteiini-s:lle (rprots). SK-Heplsolujen soluviljelmäsupernatantit (10 pl) määritettiin tunnin inkubointien jälkeen. 25 Kuviossa 11.1 esitetään plasmidin pn2gpta-fix rakenne. Kaksoisgeenikasettia, joka koostuu gpt-geenistä vaccinia--p7.5-promoottorin (P7.5) kontrolloimana ja ihmistekijä-ix-geenistä synteettisen vaccinia-viruspromoottorin (selp) kontrolloimana, sivuavat NotI-restriktiokohdat. 30 Kuviossa 11.2 esitetään Southern blot -analyysi kimeerisille viruksille, jotka käsittävät ihmistekijä-ixgeenin. Paneeli A): kokonaissolu-dna:t, jotka on pilkottu SfuI:llä ja hybridisoitu ihmistekijä-ix-geenikoettimeen (plasmidi pbluescript-fix). Kaikissa 8 isolaatissa (nrot , 9 ja 10) insertillä oli "a"-suuntaus; m = merkki;