Geenimonistus -ongelmia

Transkriptio

1 Geenimonistus -etuja nopeus spesifisyys herkkyys ei tarvitse elävää virusta tunnistetaan viruksia, joita ei voida viljellä hitaasti kasvavien virusten tunnistus nopeutuu kvantitaatio, genotyypitys

2 Geenimonistus -ongelmia reaktion inhibiitio nukleiinihappojen hajoaminen polymeraasin inhibiitio kontaminaatio

3 Nukleiinihappojen häviäminen hajoaminen nukleaasit näytekäsittelyssä näytteessä itsessään näytteen bakteereista nukleiinihappojen sieppaus stabiilisuus: DNA>dsRNA>sRNA

4 HSV DNA säilyvyys Jerome et al. -02 likvorinäytteet -23 C C 30 pv puhdistettu DNA +4 C 3 v puhdistettu DNA +4 C ja tikkunäyte -20 C 16 kk

5 HIV RNA säilyvyys Bruister et al. -97 EDTA- ja hepariiniveri +4 C6 t EDTA-veri +25 C 74 t seerumi ja EDTA-plasma puskurissa -70 C 6 kk, -70 C 12 kk (Winters et al. -93) +4 C 14 pv +30 C 2 pv RNA saalis plasmasta merkitsevästi suurempi kuin seerumista

6 HCV RNA säilyvyys seerumi RT ja +4 C 5 pv -20 C, sulatus ja jäädytys x5 (Fong et al. -93) seerumi -70 C 5 v (Schmid et al. -99)

7 Inhibiittorit vaikutus lyyttisiin entsyymeihin sitoutuminen nukleiinihappoihin ja proteiineihin vaikutus kohdegenomin ja polymeraasin sitoutumiseen polymeraasin inaktivoituminen

8 Inhibiittorit kliinisissä näytteissä olevia hemoglobiini, bilirubiini, sappihapot, hepariini, urea, siitepöly, puuteri, kehon nesteiden endogeeniset inhibiittorit toimenpiteitä tehdaspuhtaat välineet ei hepariiniverta seerumin, plasman nopea eristys ja jäähdytys

9 Kontaminaatio väärä positiivinen väärä negatiivinen potilaasta näytteenottajasta näytteen käsittelyssä kuljetuksessa tutkiva laboratorio

10 Kontaminaation välttäminen näytteenotto puhtaat kertakäyttöputket likvorinäytettä otettaessa hansikkaat, maski hyvä laboratoriotyöskentely

11 Geenimonistusnäytteet virologisessa diagnostiikassa teoriassa mistä tahansa näytteestä oikea näyte oikea paikka oikea aika

12 Näytelaadut geenimonistukseen plasma HBV, HCV, HIV, CMV, EBV enterot seerumista adeno valkosoluista, plasmasta likvori enterot, herpesvirukset, HIV, polyooma rakkulanäytteet enterot. ei HSV ja VZV ensisijaisesti virtsa CMV, adeno, polyooma

13 Näytelaadut geenimonistukseen ulostenäyte kaliki, astro, entero nenänielunäyte (NPS), nenänielutikku, nenätikku enterot, rinot, metapneumo, muut respiratoriset? BAL, pleuraneste, perikardiumneste CMV, enterot, rinot, respiratoriset?

14 Näytelaadut geenimonistukseen lapsivesi CMV, parvo polvipunktio parvo kudosnäytteet, ruumiinavausnäytteet parvo, herpesvirukset, enterovirukset fixoidut kudosnäytteet

15 Geenimonistusnäytteet kontaminaation esto seerumin ja plasman nopea erotus erite- ja punktionäytteet, kudospalat, obduktiomateriaali puhtaisiin putkiin, jäähdytys respiratoriset näytteet tikussa tai virusviljelyputkessa

16 Geenimonistusnäytteet näytteiden toimitus tutkivaan laboratorioon mahdollisimman nopeasti säilytys +4 C tarvittaessa Jokaiselle virukselle optimaalinen ja ensisijainen näytelaatu löytyy tutkivan laboratorion ohjeista!

17 Tulosten tulkinta positiivisuuden merkitys steriilit näytteet (likvori, seerumi, virtsa, nivelneste, lapsivesi) reaktivaatioissa, kroonisissa infektioissa? esim. herpes virusten persistenssi valkosoluissa biopsiat respiratoriset näytteet positiivisuus häviää kahdessa viikossa

18 ylivoimaisuus PCR keskushermostoinfektiot herpes virukset, enterovirukset

19 PCR/viljely PCR + PCR - Näyte No Virus Vilj.+ Vilj.- Vilj. + Vilj. - Likvori 301 Entero (13%) Uloste 61 Entero Resp. 229 Entero Rino (10%) 24 (11%) Tot (15%) 7 456

20 Geenimonistus ylivoimaisuus keskushermostoinfektiot herpes virukset, enterovirukset virusta hankala viljellä tai kasvaa huonosti, hitaasti astro, noro, parvo, polyooma, HHV-6 metapneumo, papillooma kvantitatiivisuus HIV, HCV, CMV, EBV genotyypitys