(10) FI B. (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats (51) Kv.lk. - Int.kl. A61K 39/395 ( ) CO7K 16/24 (2006.

Transkriptio

1 (12) PATENTTIJULKAISU M1 111 R PATENTSKRIFT III (10) FI B SUOMI - FINLAND (FI) (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats (51) Kv.lk. - Int.kl. A61K 39/395 ( ) CO7K 16/24 ( ) (21) Patenttihakemus - Patentansökning PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (86) Kv. hakemus - ML ansökan PCT/US92/08990 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P US P (73) Haltija - Innehavare 1 Immunex Corporation, 51 University Street, Seattle, WA 98101, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 ArmItage,Richard J., 5133 Eagle Harbor Drive, Bainbridge Island, WA 98110, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 2 Fanslow,William C., 218 SW 327th Place, Federal Way, WA 98023, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 3 Spriggs,Melanie K., th avenue West, Seattle, WA 98119, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 4 esrin1vasan,subhashin1, NE 129th Street, Kiddand, WA 98034, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (74) Asiamies - Ombud: Kolster Oy Ab Iso Roobertinkatu 23, Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä vasta-ainelden valmistamiseksi, jotka ovat immunoreaktiivisia CD4O-L-proteiinin kanssa Förfarande för framställning av en antikropp som är Immunoreaktiv med ett CD4O-L-protein (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta - Avdelad från ansökan: (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganism:atcc 68872ATCC, ATCC 68873ATCC (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer The EMBO Journal, vol. 11, 1992, Hollenbaugh et ei., 'The human T cell Antigen gb39 a member of the TNF gene family, is a ligand for the CD40 receptor: expression of a soluble form of gb39 with B cell costimulatory activitys, p , Molecular immunology, vol. 25, nro 9, 1988, Lauzon et al., "Characterization of gb39, a B-Iymphocyte associated differentiafion antigen which is also present on granulocytes and macrophages', p (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksinnön kohteena on uuden sytokiinin vastainen vasta-aine ja menetelmä sen valmistamiseksi. Sytokiini on CD40-L-polypeptidi, joka sitoutuu CD40-reseptorin solunulkoiseen sitoutumisalueeseen. uppfinningen avser antikroppar mot ett nytt cytokin och ett förfarande för dess framställning. Cytokinet år en CD4O-L-polypeptid, vilken binder sig vid den extracellulära bindningsregionen hos en CD40- receptor.

2 1 Menetelmä vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka ovat immunoreaktiivisia CD4O-L-proteiinin kanssa Jakamalla erotettu FI-patenttihakemuksesta Keksinnön tekninen alue Esillä oleva keksintö koskee menetelmiä vastaaineiden valmistamiseksi, jotka ovat immunoreaktiivisia ihmisen tai rottaeläimen CD4O-L-proteiinin kanssa. Tässä yhteydessä kuvataan myös rottaeläimen ja ihmisen sellaisen 10 sytokiinin kloonausta, joka sitoutuu ihmisen CD40- proteiiniin, jolla sytokiinilla on sekä agonisti- että antagonistiaktiivisuutta liukoisessa ja membraaniin sitoutuneessa muodossa. Keksinnön tausta 15 Sytokiinit, joita merkitään nimellä "interleukii- nit", ovat niitä proteiinitekijöitä, jotka vaikuttavat immuunivaikuttajasoluihin. On julkaistu sytokiinit, joita merkitään nimillä interleukiini-1 - interleukiini-l2, ja ne on nimetty interleukiiniksi. Muut tunnetut sytokiinit si- 20 sältävät kasvaimen nekroositekijän (TNF), granulosyytti-. makrofaagin pesäkkeen kasvua stimuloivan tekijän (GM-CSF), granulosyytin pesäkkeen kasvua stimuloivan tekijän 9.9 (G-CSF), mastosolun kasvutekijän (MGF), epidermaalisen kas-. vutekijän (EGF), verihiutaleista peräisin olevan kasvuteki- 25 jän (PDGF), hermosolun kasvutekijän (NGF), erytropoietiinin (EPO), y-interferonin (y-ifn) ja muut. DNA:t kandelle eri TNF-reseptorille (tyypille I ja tyypille II) on kloonattu (Smith et al., Science 248:1019, 1990 ja Schall et al., Cell 61:361, 1990). Molemmat TNF- 30 reseptorimuodot ovat sukua toisilleen ja ne kuuluvat sel- laiseen reseptoriryhmään, joiden jäsenet sisältävät kasvai- men kasvutekijäreseptorin (Johnson et al., Cell 47:545, 1986), B-soluantigeenin CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403, 1989), T-soluantigeenin OX40 (Mallett et al., EMBO 35 J. 9: ), ihmisen Fas-antigeenin (Itoh et al.,. Cell 66: 233, 1991) ja rottaeläinn 4-1BB-reseptorin (Kwon

3 2 et al., Cell. Immunol. 121:414, 1989 [Kwon et al. Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1963, 1989 [Kwon et al. II]). Ihmisen CD40-proteiini (CD40) on 277 aminohapon 5 pituinen peptidi, jonka molekyylipaino on ja siinä on 19 aminohapon pituinen erityssignaalipeptidi, joka sisältää pääasiassa hydrofobisia aminohappoja (Stamenkovic et al.). Ihmisen kypsän CD40-proteiinin (glykosyloitumattoman) molekyylipaino on Ihmisen CD40-proteiinia 10 koodittava cdna eristettiin cdna-kirjastosta, joka oli valmistettu Burkittin lymfoomasolulinjasta Raji. CD40- cdna:n koodittama mandollinen proteiini sisältää mandollisen leader-sekvenssin, membraanin läpi menevän domeenin ja useita muita ominaisuuksia, jotka ovat yleisiä mem- 15 braaniin sidotuilla reseptoriproteiineilla. CD40-proteiinin on havaittu ekspressoituvan B-lymfosyyteissä, epiteelisoluissa ja joissain karsinoomasolulinjoissa. CD40-proteiinia vastaan olevan monoklonaalisen vasta-aineen (mab) on osoitettu välittävän useita toimin- 20 nallisia vaikutuksia ihmisen B-soluissa. Nämä vaikutukset sisältävät: (a) homotyyppiset adheesiot (Gordon et al., J. Immunol. 140:1425, 1988 [Gordon et al. I]; (b) suurenneen solukoon (Gordon et al. I ja Valle et al., Eur. J. Immunol. 19:1463, 1989); (c) sellaisten B-solujen li- 25 sääntymisen, jotka on aktivoitu anti-igm-proteiinilla, anti-cd20-mab-proteiinilla, forboliesterillä yksinään (Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4494, 1986 ja Paulia et al., J. Immunol. 142:590, 1989) tai forboliesterillä yhdessä interleukiini-4-proteiinin kanssa 30 (Gordon et al., Eur. J. Immunol. 17:1535, 1987 [Gordon et al. II] ja (d) IgE-proteiinin (Jabara et al., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990; Zhang et al., J. Immunol. 146:1836, 1991) ja IgM-proteiinin tuoton (Gascan et al., J. Immunol. 147:8, 1991) interleukiini-4-proteiinilla (IL-4) 35 stimuloiduista viljelmistä, joista T-solut on poistettu. ja

4 Erään sellaisen vasta-aineen, jota kutsutaan nimellä mab 89, jonka ovat kuvanneet Banchereau et al., Clin. Immunol. Spectrum 3:8, 1991) [Banchereau et al. I], havaittiin indusoivan ihmisen B-solujen kasvua suhteelli- 5 sen alhaisilla vasta-ainekonsentraatioilla (30 ng/ml tai noin 10-1 M). Lisääntyminen kesti 2-3 viikkoa ja se johti kymmenkertaiseen ihmisen B-solupopulaation laajenemiseen. B-solujen optimaalinen stimulaatio tapahtui, kun CD40-pintamolekyyli ristisidottiin IgM-proteiinin kanssa. 10 Toisen anti-cd40-mab-proteiinin Fab-fragmentit indusoivat ainoastaan heikon lisääntymisvasteen. Lisäksi, Banchereau et al., Science 251:70, 1991) [Banchereau et al. II] julkaisivat, että lepotilassa olevat ihmisen B-solut saavuttivat pysyvän lisääntymistilan, kun niitä inkuboitiin se- 15 kä rottaeläinn fibroblastisen Ltk - solulinjan, joka oli transfektoitu ihmisen Fc-reseptorilla, että ihmisen CD40- proteiinille spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa. Banchereau et al. II havaitsivat, että CD40- proteiinin ristisitominen oli tarpeen B-solujen kloona- 20 lista ekspansiota varten. CD23 on matala-affiininen IgE-reseptori, jonka on havaittu ekspressoituvan useimmissa kypsissä IgM - /IgD - B-soluissa, mutta ei T-soluissa. CD23 on sekvensoitu ja sen sekvenssin kuvasivat Kikutani et al., Cell 47:657, Liukoisen CD23-proteiinin (scd23) havaittiin indusoivan pyrogeenisen reaktion kaneissa ja tämä reaktio kumoutui annettaessa ihmisen IgE-proteiinia (Ghaderi et al., Immunoloqy 73:510, 1991). Sen vuoksi CD23 voi olla sopiva merkki liukoisen CD40- tai CD4O-L-proteiinin vai- 30 kutuksista. Ennen esillä olevaa keksintöä CD40-proteiinin ligandi oli tuntematon. Sen mukaisesti alalla on olemassa tarve CD40-ligandin (CD4O-L) tunnistamiseksi ja karakterisoimiseksi.

5 4 II Keksinnön yhteenveto Uusi sytokiini, jota tästä lähtien kutsutaan nimellä "CD4O-L", on eritetty ja karakterisoitu. Rottaeläimen edustavan CD4O-L-cDNA:n nukleotidisekvenssi ja ennus- 5 tettu aminohapposekvenssi on kuvattu sekvenssissä SEQ ID numero 1 ja kuviossa 1, ja aminohapposekvenssi on myös listattu sekvenssissä SEQ ID numero 2. Ihmisen edustavan CD4O-L-cDNA:n nukleotidisekvenssi ja ennustettu aminohapposekvenssi on kuvattu sekvenssissä SEQ ID numero 11 ja 10 kuviossa 2, ja aminohapposekvenssi on myös listattu sekvenssissä SEQ ID numero 12. Lisåksi esitetään muita CD40- L-polypeptidejä, joita koodittavat sellaiset nukleotidisekvenssit, jotka hybridisoituvat keskinkertaisissa tai ankarissa olosuhteissa sekvenssin SEQ ID numero 11 mää- 15 rittelemiin koettimiin (ihmisen CD40-L-proteiinia koodittava alue), sekvenssifragmenttien ulottuessa nukleotidista 46 nukleotidiin 828 sekvenssissä SEQ ID numero 11, tai kuvion 2 sekvenssin (SEQ ID numero 11) tai sen fragmenttien kanssa komplementaarisiin DNA- tai RNA-sekvenssei- 20 hin. Lisäksi kuvataan nukleiinihapposekvenssit, jotka johtuen geneettisen koodin degeneraatiosta koodittavat polypeptidejä, jotka ovat oleellisesti identtisiä tai oleellisesti samanlaisia niiden polypeptidien kanssa, joita yllä kuvatut nukleiinihapposekvenssit koodittavat, 25 ja niiden komplementaariset sekvenssit. CD4O-L on tyypin II membraanipolypeptidi, jossa on solunulkoinen alue C-päässä, membraanin läpi kulkeva alue ja solunsisäinen alue N-päässä. Rottaeläinn CD4O-Lproteiinin liukoinen muoto on löydetty EL-4-solujen ja 30 sellaisten EL-4-solujen, jotka on lajiteltu tässä kuvatun biotinyloidun CD40/Fc-fuusioproteiinin perusteella, supernatanteista. Liukoinen CD4O-L-proteiini sisältää CD40- L-proteiinin solunulkoisen alueen tai sen fragmentin. Rottaelåimen CD4O-L-proteiinin proteiinisekvenssi on ku- 35 vattu kuviossa 1 ja sekvenssissä SEQ ID numero 2, ja ihmisen CD4O-L-proteiinin sekvenssi kuviossa 2 ja sekvens-

6 5 sissä SEQ ID numero 12. Rottaeläimen CD40-L-proteiinin solunulkoinen alue ulottuu aminohaposta 47 aminohappoon 260 kuviossa 1 ja sekvenssissä SEQ ID numero 2, ja ihmisen CD4O-L-proteiinissa aminohaposta 47 aminohappoon kuviossa 2 ja sekvenssissä SEQ ID numero 12. CD4O-Lproteiinin biologista aktiivisuutta välittää tämän sytokiinin sitoutuminen CD40-proteiinin kanssa ja se sisältää B-solujen lisääntymisen ja vasta-aineiden, sisältäen IgEvasta-aineen, erittymisen induktion. 10 Lisäksi esitetään antisense- tai sense-oligonuk- leotidit (deoksiribonukleotidit tai ribonukleotidit), jotka vastaavat sekvenssiä, joka on ainakin noin 12 nukleotidin pituinen, jotka on valittu CD40-L-nukleotidisekvenssistä tai DNA- tai RNA-säkvesseistä, jotka ovat 15 komplementaarisia sille CD4O-L-nukleotidisekvenssille, joka on kuvattu sekvensseissä SEQ ID numero 1 ja SEQ ID numero 11 ja kuvioissa 1 ja 2. Sellaiset antisense- tai sense-oligonukleotidit estävät CD4O-L-mRNA:n tai polypeptidien transkription tai translaation. 20 Lisäksi tässä esitetään vielä CD4O-L-peptidi- fragmentit, jotka vastaavat proteiinisekvenssiä, joka on. ainakin 10 aminohapon pituinen, joka valitaan aminohap- posekvenssistä, jota koodittavat sekvenssit SEQ ID numero 1 tai SEQ ID numero 11, jotka voivat toimia immunogeenei- 25 na CD4O-L-immunogeeneille spesifisten vasta-aineiden muo- dostamiseksi. Sellaiset CD4O-L-immunogeeni-fragmentit voivat toimia antigeenideterminantteina muodostettaessa CD4O-L-proteiinille spesifisiä monoklonaalisia vasta- aineita. Keksinnön mukaiselle menetelmälle ihmisen tai 30 rottaeläimen CD4O-L-proteiinin kanssa reagoivan vastaaineen valmistamiseksi on tunnusomaista se mitä patentti- vaatimuksensa 1 tai vastaavasti 3 esitetään. 35 Tässä esitetään myös ihmisen CD40/Fc-fuusioproteiinin ja liukoisen CD40-proteiinin (scd40), jotka sisältävät ihmisen CD40-proteiinin solunulkoisen alueen. Sekä scd40-proteiini että CD40/Fc-fuusioproteiini voivat

7 6 inhiboida CD4O-L-proteiinin tai monoklonaalisen anti- CD40-vasta-aineen indusoiman B-solun stimulaation, IL-4- proteiinin indusoiman IgE-stimulaation ja IL-4-proteiinin indusoiman CD23-proteiinin induktion B-soluissa. 5 Kuvioiden lyhyt kuvaus Kuvio 1 kuvaa nukleotidi- ja aminohapposekvenssit, jotka vastaavat rottaeläimen CD4O-L-proteiinin sekvenssejä. Tämä proteiini on tyypin II polypeptidi, jonka N-pää on sen solunsisäinen domeeni, jota seuraa membraa- 10 nin läpi kulkeva alue ja solunulkoinen domeeni polypeptidin C-päässä. Solunulkoinen domeeni, joka on pitempi kuin joko solunsisäinen domeeni tai membraanin läpi kulkeva alue, sisältää yhden mandollisen N-sidoksellisen glykosylaatiokohdan ja kaksi mandollista disulfidisidosta 15 neljän kysteiinijäännöksen (Cys) vuoksi. Kuvio 2 kuvaa nukleotidi- ja aminohapposekvenssit, jotka vastaavat ihmisen CD4O-L-proteiinin sekvenssejä. Tämä proteiini on tyypin II polypeptidi, jonka N-pää on sen solunsisäinen domeeni, jota seuraa membraanin läpi 20 kulkeva alue ja solunulkoinen domeeni polypeptidin C- päässä. Solunulkoinen domeeni, joka on pitempi kuin joko solunsisäinen domeeni tai membraanin läpi kulkeva alue, sisältää yhden mandollisen N-sidoksellisen glykosylaatiokohdan ja kaksi mandollista disulfidisidosta viiden 25 kysteiinijäännöksen (Cys) vuoksi. Kuvio 3 kuvaa ihmisen ja rottaeläimen CD4O-Lproteiinin proteiinisekvenssien vertailun, joka osoittaa 77,7 % homologian aminohappotasolla. Kuvio 4 kuvaa T-soluista tyhjennettyjen ihmisen 30 perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) lisääntymisen, jonka aiheutti inkubaatio sellaisten CV1- solujen kanssa, jotka oli transfektoitu täyspitkällä rot- taeläimen CD4O-L-cDNA:11a (SEQ ID numero 1) ja jotka eks- pressoivat sitoutunutta CD4O-L-proteiinia (CD40-L +CV1-35 solut) verrattuna sellaisiin CV1-soluihin, jotka oli transfektoitu tyhjällä vektorilla (HAVEO) ja jotka eivät

8 7 ekspressoineet sitoutunutta rottaeläimen CD40-L-proteiinia. Vuorokauden 7 lisääntymistulokset osoittavat, että CD40-L +CV1-solut kohottavat merkittävästi T-soluista tyhjennettyjen PBMC-solujen lisääntymistä interleukiini-4-5 proteiinin (IL-4) läsnä- tai poissaollessa. Kuvio 5 kuvaa toisen T-soluista tyhjennettyjen PBMC-solujen lisääntymisen määrityksen, jossa oli lisätty sitoutunutta rottaeläimen CD4O-L-proteiinia ja 10 ng IL- 4-proteiinia/ml. Nämä tulokset eivät osoita mitään yh- 10 teismitogeenista IL-4-proteiinin vaikutusta, mutta sitoutuneen CD40-L-proteiinin jatkuvan vahvan mitogeenisen vaikutuksen. Kuvio 6 kuvaa, että sitoutunut CD40-L-protenni lisää IgE-proteiinin eritystä. Kuvio 7 kuvaa, että membraaniin sitoutunut CD40-15 L-proteiini stimuloi CD23-proteiinin erittymistä IL-4- proteiinin läsnä ollessa. Kuvio 8 kuvaa rottaeläimen pernan B-solujen lisääntymisen, jonka aiheuttivat membraaniin sitoutunut rottaeläimen CD4O-L-proteiini tai 7A1-solut, joka on aut- 20 taja-t-soluklooni. Kuvio 9 kuvaa rottaeläimen EL40.9-solujen, joka on lajiteltu solulinja, joka lajiteltiin sen perusteella, että se ekspressoi rottaeläimen CD4O-L-proteiinia, ja T- solujen 7A1 vertailun antigeenispesifisen vasteen indu- 25 soimisessa, jonka vasteen osoittivat plakkeja muodostavat solut (PFC) anti-lammas-punasoluilla (SCBC). Kuvio 10 kuvaa membraaniin sitoutuneen CD40-Lproteiinin B-solujen ja muiden solutyyppien, jotka oli transfektoitu eri cdna11a, lisääntymistä tehostavan ak- 30 tiivisuuden vertailun. Membraaniin sitoutunut CD40-Lproteiini osoitti merkittävästi suuremman B-solun lisääntymistä tehostavan aktiivisuuden kuin auttajasoluklooni tai muut kontrollisolut. Kuvio 11 kuvaa, että rottaeläimen CD40-L-cDNA:11a 35 transfektoidut 7C2- (auttaja-t-soluklooni) ja CV1-solut indusoivat anti-scbc-plakkeja muodostavia soluja.

9 8 Kuvio 12 kuvaa kanden auttaja-t-solukloonin vertailun, jotka solut ekspressoivat membraaniin sitoutunutta CD4O-L-proteiinia, rottaeläimen B-solujen lisääntymisen indusoimisessa. 5 Kuvio 13 kuvaa membraaniin sitoutuneen CD4O-L- proteiinin ja auttaja-t-solukloonin aiheuttaman antigeenispesifisten plakkeja muodostavien solujen induktion lisätyn interleukiini-2-proteiinin (IL-2) läsnä- tai poissaollessa. 10 Kuvio 14 kuvaa membraaniin sitoutuneen CD40-L- proteiinin vaikutukset B-solujen lisääntymisen ja IgEproteiinin erityksen stimuloimisessa. Membraaniin sitoutuneen CD4O-L-proteiinin vaikutukset inhiboituivat CD40- reseptorilla, mutta eivät TNF-reseptorilla. 15 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Uudet polypeptidit, jotka voivat toimia ligandina rottaeläimen ja ihmisen CD40-proteiinille, on eristetty ja sekvensoitu. Erikoisemmin, näitä ligandeja koodittavat cdna:t on kloonattu ja sekvensoitu. Lisäksi on esitetty 20 menetelmät CD4O-L-rekombinanttipolypeptidien ekspressoimiseksi. CD40-L-polypeptidi sisältää muut nisäkkään CD40- L-muodot, kuten ihmisen tai rottaeläimen CD4O-Lproteiinin johdannaiset tai analogit. Rottaeläimen ja ihmisen CD4O-L-proteiini sisältää 214 ja 215, vastaavasti, 25 aminohapon pituisen solunulkoisen alueen C-päässä täyspitkässä membraaniin sitoutuneessa polypeptidissä. Solunulkoinen alue sisältää domeenin, joka sitoutuu CD40- proteiiniin. Rottaeläimen ja ihmisen CD4O-L-proteiini sisältää lisäksi homologisen 24 aminohapon pituisen mem- 30 braanin läpi kulkevan alueen, jota reunustavat varatut aminohapot kummallakin puolella, ja 22 aminohapon pituisen solunsisäisen alueen N-päässään. Lisäksi tässä käsitellään täyspitkät CD4O-L-polypeptidit tai niiden fragmentit, jotka sisältävät solunulkoisen alueen kokonaan 35 tai osan siitä, tai solunulkoisen alueen johdannaiset ja nisäkässolut, jotka on transfektoitu cdna:lla, joka koo-

10 9 dittaa rottaeläimen tai ihmisen CD4O-L-proteiinia, ja jotka ekspressoivat ihmisen tai rottaeläimen CD4O-Lproteiinia membraaniin sitoutuneena proteiinina. Tässä kuvataan edelleen eristetyt DNA-sekvenssit, 5 jotka koodittavat CD4O-L-polypeptidejå, ja DNA- tai RNAsekvenssit, jotka ovat komplementaarisia sellaisille eristetyille DNA-sekvensseille. Eristetyt DNA-sekvenssit ja niiden komplementit valitaan ryhmästä, joka sisältää (a) nukleotidit , nukleotidit tai nuk- 10 leotidit kuviossa 2 kuvatusta DNA-sekvenssistä (SEQ ID numero 11) ja niiden komplementit, (b) DNAsekvenssit, jotka hybridisoituvat DNA-sekvensseihin (a) tai niiden komplementteihin keskinkertaisen ankaruuden olosuhteissa ja jotka koodittavat CD40-L-polypeptidiä, 15 niiden analogit tai johdannaiset ja (c) DNA-sekvenssit, jotka johtuen geneettisen koodin degeneraatiosta koodittavat niitä CD40-L-polypeptidejä, joita edellä mainitut DNA-sekvenssit ja niiden komplementit koodittavat. Lisäksi tässä esitetään vektorit, jotka sisältävät DNA- 20 sekvenssit, jotka koodittavat CD4O-L-polypeptidejä ja analogeja, ja isäntäsolut, jotka on transfektoitu sellaisilla vektoreilla. Tässä kuvattu uusi sytokiini on ligandi CD40- proteiinille, joka on reseptori, joka on TNF-reseptorei- 25 den suurryhmän jäsen. Sen vuoksi CD4O-L-proteiini on todennäköisesti vastuussa signaalin kuljettamisesta CD40- proteiinin kautta, jonka tiedetään ekspressoituvan esimerkiksi B-lymfosyyteissä. Täyspitkä CD40-L-proteiini on membraaniin sitoutunut polypeptidi, jossa on solunulkoi- 30 nen alue C-päässä, membraanin läpi kulkeva alue ja solunsisäinen alue N-päässä. CD40-L-proteiinin liukoinen muoto voidaan valmistaa solunulkoisesta alueesta tai sen fragmentista ja liukoista CD4O-L-proteiinia on löydetty sellaisten solujen viljelysupernatanteista, jotka ekspres- 35 soivat CD40-L-protelinin membraaniin sitoutunutta muotoa. Rottaeläimen CD4O-L-proteiinin solunulkoisen alueen pro-

11 10 teiinisekvenssi ulottuu aminohaposta 47 aminohappoon 260 kuviossa 1 ja sekvenssissä SEQ ID numero 2. Ihmisen CD40- L-proteiinin solunulkoisen alueen proteiinisekvenssi ulottuu aminohaposta 47 aminohappoon 261 kuviossa 2 ja 5 sekvenssisså SEQ ID numero 12. CD4O-L-proteiinin biologisen aktiivisuuden välittää sen sitoutuminen CD40- proteiiniin tai sen lajispesifiseen homologiin ja se sisältää B-solujen lisääntymisen ja immunoglobuliinin erityksen induktion aktivoiduista S-soluista. CD40-L- 10 proteiini (sisältäen liukoiset monomeeriset ja oligomeeriset muodot kuin myös membraaniin sitoutuneet muodot) voi vaikuttaa B-solujen lisääntymiseen ja immunoglobuliinin eritykseen (lukuunottamatta IgE-proteiinin eritystä) ilman lisätyn IL-4-proteiinin läsnäoloa, joka on päinvas- 15 taista anti-cd40-vasta-aineille, jotka vaativat IL-4- proteiinia ja ristisitomista aktiivisuuden välittämiseksi. CD4O-L viittaa polypeptidien lajiin, joka kykenee sitoutumaan CD40-proteiiniin tai nisäkkään CD40-20 proteiinin homologeihin. Tässä käytettynä termi "CD40-L" sisältää liukoiset CD4O-L-polypeptidit, joista puuttuu membraanin läpi kulkevat ja solunsisäiset alueet, nisäkkäiden homologit ihmisen CD4O-L-proteiinille, ihmisen tai rottaeläimen CD4O-L-analogit tai ihmisen tai rottaeläimen 25 CD4O-L-johdannaiset. CD4O-L-proteiini voidaan myös saada sellaisten nukleotidisekvenssien mutaatiolla, jotka koodittavat CD40-L-polypeptidiå. CD4O-L-analogi, kuten tässä viitataan, on polypeptidi, joka on oleellisesti homologinen 30 ihmisen tai rottaeläimen CD4O-L-proteiinin sekvenssille, mutta jossa on erilainen aminohapposekvenssi kuin luonnollisessa CD4O-L-polypeptidisekvenssissä (ihmisen tai rottaeläinlajien) johtuen yhdestä tai useammasta deleetiosta, insertiosta tai substituutiosta. CD4O-L-analogit 35 voidaan syntetisoida DNA-rakenteista, jotka on valmistet-

12 1 1 tu oligonukleotidisynteesillä ja ligaatiolla tai kohdennetulla mutageneesimenetelmällä. Ihmisen tai rottaeläimen CD4O-L-proteiinin primaarista aminohapporakennetta voidaan modifioida CD40-L- 5 johdannaisten luomiseksi muodostamalla kovalenttiset tai aggregoituvat konjugaatit muiden kemiallisten ryhmien kanssa, kuten glykosyyliryhmien, lipidien, fosfaatin, asetyyliryhmien ja niiden kaltaisten kanssa, tai luomalla aminohapposekvenssimutantit. CD4O-L-proteiinin kovalent- 10 tiset johdannaiset on valmistettu liittämällä tietyt toiminnalliset ryhmät CD4O-L-proteiinin aminohappojen sivuketjuihin tai CD4O-L-polypeptidin N-päähän tai C-päähän tai sen solunulkoiseen domeeniin. Muut tässä yhteydessä käsiteltävät CD4O-L-johdannaiset sisältävät CD40-L- 15 proteiinin tai sen fragmenttien kovalenttiset tai aggregoituvat konjugaatit muiden proteiinien tai polypeptidien kanssa, kuten syntetisoimalla rekombinanttiviljelmässä N- pään tai C-pään fuusioina. Konjugaatti voi sisältää esimerkiksi signaali- tai leader-polypeptidisekvenssin CD40-20 L-polypeptidin N-pään tai C-pään alueella, joka sekvenssi translaation aikana tai translaation jälkeen ohjaa konjugaatin siirtymistä sen synteesikohdasta solumembraanin tai soluseinän sisä- tai ulkopuolella olevaan kohtaan (esim. Saccharomyces-hiivan a-tekijän leader-sekvenssi). 25 CD4O-L-polypeptidifuusiot voivat sisältää polypeptidejä, jotka on lisätty CD40-L-proteiinin puhdistuksen ja tunnistuksen tehostamiseksi (esim. poly-his), tai fuusiot muiden sytokiinien kanssa uusien polyfunktionaalisten kokonaisuuksien saamiseksi. Muut sytokiinit sisältävät esi- 30 merkiksi mitkä tahansa interleukiinit-1-13, TNFproteiinin (kasvaimen nekroositekijä), GM-CSF-proteiinin (granulosyytti-makrofaagin pesäkekasvua stimuloiva tekijä), G-CSF-proteiinin (granulosyytin pesäkekasvua stimuloiva tekijä), MGF-proteiinin (mastosolun kasvutekijä), 35 EGF-proteiinin (epidermaalinen kasvutekijä), PDGFproteiinin (verihiutaleista peräisin oleva kasvutekijä),

13 12 NGF-proteiinin (hermon kasvutekijä), EPO-proteiinin (erytropoietiini), y-ifn-proteiinin (y-interferoni), 4-1BB-L-proteiinin (4-1BB-ligandi) ja muut sytokiinit, jotka vaikuttavat immuunisolujen kasvuun, lisääntymiseen tai 5 toimintaan. Tässä yhteydessä esitetyt nukleiinihapposekvenssit sisältävät DNA- ja/tai RNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat sekvenssin SEQ ID numero 1 tai SEQ ID numero 11 nukleotidisekvenssiin tai niiden komplementaarisiin juos- 10 teisiin keskinkertaisissa tai ankarissa olosuhteissa. Keskinkertaisen ankaruuden sisältävät hybridisaatioolosuhteet viittaavat olosuhteisiin, jotka on kuvattu esimerkiksi teoksessa Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. painos, osa 1, sivut , 15 Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989). Keskinkertaisen ankaruuden sisältävät olosuhteet, kuten Sambrook et al. ovat ne määritelleet, sisältävät sellaisen esipesuliuoksen käytön, joka on 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mm EDTA (ph 8,0), ja hybridisaatio-olosuhteet 50 C:ssa, 5 x 20 SSC -liuoksessa yli yön. Ankarat olosuhteet sisältävät korkeammat lämpötilat hybridisaatiossa ja pesussa. CD4O-L-proteiinin biologinen aktiivisuus voidaan määrittää esimerkiksi antamalla kilpailla sitoutumisesta CD40-proteiinin ligandia sitovaan domeeniin (se tarkoit- 25 taa, kompetetiiviset sitomistestit). Sekä rottaeläimen että ihmisen CD4O-L-proteiini sitoutuu ihmisen CD40- proteiiniin. Rottaeläimen CD4O-L-proteiinin (ekspressoitu lajitelluissa rottaeläimen EL-40.9-soluissa) sitoutumisaffiniteetti ihmisen CD40-proteiiniin oli noin 1,74 x M -1. Samalla tavalla, rottaeläimen CD4O-L-proteiinin (ekspressoitu lajittelemattomissa rottaeläimen EL soluissa) sitoutumisaffiniteetti ihmisen CD40-proteiiniin oli noin 2,3 x 10 9 M -1. Molemmat sitoutumismittaukset ovat tyypillisen sytokiini/sytokiinireseptorin sitoutumisen 35 rajoissa.

14 (8 Eräässä CD40-L-polypeptidin kompetetiivisen sitoutumistestin muodossa käytetään radioaktiivisesti leimattua kuvion 1 mukaista liukoista rottaeläimen CD4O-Lproteiinia (SEQ ID numero 1) tai kuvion 2 mukaista ihmi- 5 sen CD40-L-proteiinia (SEQ ID numero 11) ja CD40- proteiinia ekspressoivia koskemattomia soluja (esim. ihmisen B-soluja). Koskemattomien solujen tilalla voidaan käyttää liukoista CD40-proteiinia (kuten CD40/Fc-fuusioproteiinia), joka on sidottu kiinteään faasiin proteiini 10 A tai proteiini G -interaktiolla fuusioproteiinin Fcalueen välityksellä. Toisessa kompetetiivisen sitoutumistestin muodossa käytetään radioaktiivisesti leimattua liukoista CD40-proteiinia, kuten CD40/Fc-fuusioproteiinia, ja koskemattomia soluja, jotka ekspressoivat CD40-L- 15 proteiinia. Liukoinen CD4O-L-proteiini voi vaihtoehtoisesti olla sidottu kiinteään faasiin. Kompetetiiviset sitoutumistestit voidaan suorittaa käyttäen standardimenetelmiä. Radioaktiivisesti leimattua rottaeläimen CD4O-L-proteiinia voidaan esimerkiksi 20 käyttää kilpailemaan mandollisen CD40-L-homologin kanssa pintaan sidottua CD40-proteiinia vastaan olevan sitoutumisaktiivisuuden testaamiseksi. Kompetetiivisilla autoradiografialevytesteillä voidaan saada kvalitatiivisia tuloksia tai Scatchard-kaaviota voidaan käyttää kvantita- 25 tiivisten tulosten muodostamiseksi. Kompetetiiviset sitoutumistestit CD40-proteiinia ekspressoivien koskemattomien solujen kanssa voidaan suorittaa kandella menetelmällä. Ensimmäisessä menetelmässä B-solut kasvatetaan joko suspensiossa tai kiinnittyneinä 30 kudosviljelymaljoihin. Kiinnittyneet solut voidaan poistaa käsittelemällä 5 mm EDTA-liuoksella 10 minuuttia 37 C:ssa. Toisessa menetelmässä voidaan käyttää transfektoituja COS-soluja, jotka ekspressoivat membraaniin sitoutunutta CD40-proteiinia. COS-solut tai muut nisäkäs- 35 solut voidaan transfektoida sopivassa vektorissa olevalla ihmisen CD40-cDNA:11a niin, että ekspressoidaan täyspit-

15 14 kää CD40-proteiinia solunulkoisen alueen ulottuessa solun ulkopuolelle. Vaihtoehtoisesti liukoinen CD40-proteiini voidaan sitoa kiinteään faasiin, kuten pylväskromatografiamatrik- 5 siin tai putkeen tai sen kaltaiseen substraattiin, joka on sopiva sellaisen tunnistettavan ryhmän, kuten 125 I:n, läsnäolon analyysiä varten. Sitominen kiinteään faasiin voidaan saada aikaan esimerkiksi ottamalla CD40/Fcfuusioproteiini ja sitomalla se proteiini A tai proteiini 10 G -pintaan. Muita menetelmiä CD4O-L-proteiinin ja sen homologien biologisen aktiivisuuden mittaamiseksi on konjugoidun liukoisen CD40-proteiinin (esimerkiksi 1251_ CD40/Fc) hyväksikäyttö samanlaisissa kilpailutesteissä 15 kuin yllä on kuvattu. Tässä tapauksessa kuitenkin käytetään koskemattomia soluja, jotka ekspressoivat CD4O-Lproteiinia, tai liukoista CD40-L-proteiinia, joka on sidottu kiinteään substraattiin, konjugoidun liukoisen CD40-proteiinin ja näytteen, joka mandollisesti sisältää 20 CD40-homologin, CD4O-L-proteiiniin tapahtuvan sitoutumi- sen kilpailun mittaamiseksi. CD4O-L-proteiinia voidaan myös testata mittaamalla biologista aktiivisuutta B-solun lisääntymistestillä. Ihmisen B-solut voidaan saada ihmisen risoista puhdista- 25 maila negatiivisella selektiolla ja Percoll-tiheysdimentaatiolla, kuten ovat kuvanneet Defrance et al., J. Immunol. 139:1135, Burkittin lymfoomasolulinjoja voidaan käyttää CD4O-L-proteiinin aiheuttaman solulisäyksen mittaamiseksi. Esimerkit Burkittin lymfoomasolulinjoista 30 sisältävät esimerkiksi Raji- (ATCC CCL 86), Daudi- (ATCC CCL 213) ja Namalwa-solulinjat (ATCC CRL 1432). Membraaniin sitoutunut CD4O-L-proteiini stimuloi B-solun lisääntymistä. Oligomeerinen, mieluummin dimeerinen, CD40-Lproteiini voi stimuloida B-solun lisääntymistä. CD40-35 proteiini (reseptori) vastustaa CD4O-L-proteiinin aiheut- tamaa B-solujen lisääntymistä.

16 15 Vielä eräs testi CD4O-L-proteiinin biologisen aktiivisuuden määrittåmiseksi on mitata B-solujen tuottama immunoglobuliini, jota ne tuottavat vasteena CD40-Lproteiinin tai sen johdannaisen tai analogin aiheuttamal- 5 le aktivaatiolle. Polyklonaalisen immunoglobuliinin eritys voidaan mitata esimerkiksi inkuboimalla 5 x 10 5 B- solua/ml viljelmässä ainakin seitsemän vuorokautta. Immunoglobuliinin (Ig) tuotto voidaan mitata ELISA-testillä, kuten sellaisella, jonka ovat kuvanneet Maliszewski et 10 al., J. Immunol. 144:3028, 1990 [Maliszewski et al. I] tai Maliszewski et al., Eur. J. Immunol. 20:1735, 1990 [Maliszewski et al. II]. Rottaeläimen B-solut voidaan saada esimerkiksi hiiristä ja niitä voidaan viljellä niiden menetelmien mukaisesti, jotka ovat kuvanneet Grab- 15 stein et al., J. Exp. Med. 163:1405, 1986 [Grabstein et al. I], Maliszewski et al. I ja Maliszewski et al. II. CD4O-L-proteiinia voidaan käyttää sitoutumistesteissä CD40-proteiinia ekspressoivien solujen tunnistamiseksi. Esimerkiksi rottaeläimen kuvion 1 mukainen CD40-L- 20 proteiini (SEQ ID numero 1) tai ihmisen kuvion 2 mukainen. CD4O-L-proteiini (SEQ ID numero 11) tai niiden solunul- koinen domeeni tai fragmentti voidaan konjugoida tunnis- tettavaan ryhmään, kuten Radioaktiivinen leimaus 125 Idla voidaan suorittaa millä tahansa useasta standar- 25 dimenetelmästå, joilla saadaan aikaan toiminnallinen kor- keaan spesifiseen aktiivisuuteen leimattu CD4O-L-. molekyyli. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muuta tunnistettavaa ryhmää, kuten entsyymiä, joka voi katalysoida. kolorimetrisen tai fluorimetrisen reaktion, biotiinia tai avidiinia. CD40-proteiinia ekspressoivat solut voidaan saattaa kosketukseen konjugoidun CD4O-L-proteiinin kanssa. Inkubaation jälkeen sitoutumaton konjugoitu CD40-Lproteiini poistetaan ja sitoutuminen mitataan käyttäen tunnistettavaa ryhmää. 35

17 16 II III CD40-L-polypeptidit voivat esiintyä oligomeereinä, kuten dimeereinä tai trimeereinä. Oligomeerit liittyvät toisiinsa disulfidisidoksin, jotka muodostuvat eri CD4O-L-polypeptidien kysteiinijäännösten väliin. Vaihto- 5 ehtoisesti kaksi liukoista CD40-L-domeenia voidaan liittää toisiinsa Gly4 SerGly 5Ser-linkkerisekvenssillä tai muulla linkkerisekvenssillä, jotka on kuvattu USpatenttijulkaisussa , joka on liitetty tähän viitteeksi. CD40-L-polypeptidit voidaan myös muodostaa 10 fuusioimalla liukoisen CD4O-L-proteiinin C-pää (solunulkoinen domeeni) IgGl-proteiinin Fc-alueeseen (esimerkiksi sekvenssi SEQ ID numero 3), kuten on kuvattu CD40/Fcfuusioproteiinille. CD4O-L/Fc-fuusioproteiinien annetaan rakentua hyvin paljon samalla tavalla kuin vasta- 15 ainemolekyylin raskasketjujen divalenttisten CD4O-Lproteiinien muodostamiseksi. Jos fuusioproteiinit valmistetaan vasta-aineen sekä raskas- että kevytketjun kanssa, on mandollista muodostaa CD4O-L-oligomeeri, jossa on jopa neljä CD40-L-proteiinin solunulkoista aluetta. 20 Fuusioproteiinit voidaan valmistaa halutuista sekvensseistä käyttäen tavanomaisia entsyymin katkaisuja fragmenttien ligaatiomenetelmiä. PCR-menetelmiä, joissa käytetään synteettisiä oligonukleotideja, voidaan käyttää haluttujen fragmenttien valmistamiseksi ja/tai 25 amplifioimiseksi. Päällekkäin meneviä synteettisiä oligonukleotideja, jotka edustavat haluttuja sekvenssejä, voidaan myös käyttää fuusioproteiineja koodittavien DNArakenteiden valmistamiseksi. Fuusioproteiinit voivat myös sisältää CD4O-L-proteiinin ja kaksi tai useamman lisäse- 30 kvenssin, jotka sisältävät leader-sekvenssin (tai signaalipeptidin), Fc-alueen, linkkerisekvenssin ja sekvenssit, jotka koodittavat erittäin antigeenisia ryhmiä, jotka muodostavat keinot fuusioproteiinin helppoon puhdistukseen ja nopeaan tunnistukseen. 35 Signaalipeptidit helpottavat proteiinien eritystä soluista. Esimerkkisignaalipeptidi on ihmisen interleu-

18 17 kiini-7-proteiinin aminopään 25 aminohapon pituinen leader-sekvenssi (IL-7; Goodwin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:302, 1989; kuvio 2B). Muita signaalipeptidejä voidaan myös käyttää. Esimerkiksi tietyt nukleotidit IL- 5 7-leader-sekvenssissä voidaan muuttaa ilman, että muutetaan aminohapposekvenssiä. Lisäksi voidaan valmistaa aminohappomuutokset, jotka eivät vaikuta IL-7-sekvenssin kykyyn toimia leader-sekvenssinå. FlagR -oktapeptidi (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp- 10 Lys) ei muuta fuusioproteiinien biologista aktiivisuutta, on erittäin antigeeninen ja muodostaa epitoopin, joka reversiibelisti sitoo spesifisen monoklonaalisen vastaaineen, joka mandollistaa ekspressoidun fuusioproteiinin nopean tunnistuksen ja helpon puhdistuksen. FlagR - 15 sekvenssin katkaisee myös spesifisesti naudan limakalvon enterokinaasi jäännöksestä, joka sijaitsee juuri Asp- Lys-parin jälkeen, fuusioproteiinit, joiden päähän tämä peptidi on lisätty, voivat myös olla resistenttejä solunsisäiselle degradaatiolle E. coli -bakteerissa. Rotta- 20 eläimen monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu Flag R - sekvenssiin, on talletettu ATCC-kokoelmaan koodinumerolla. HB 9259; menetelmät vasta-aineen käyttämiseksi Flag R - 25 sekvenssin sisältävien fuusioproteiinien puhdistuksessa on kuvattu US-patenttijulkaisussa , joka on liitetty tähån viitteeksi. Sopivat Fc-alueet määritellään Fc-alueiksi, jotka sitoutuvat proteiini A:han tai proteiini G:hen, tai vaihtoehtoisesti ne tunnistaa vasta-aine, jota voidaan käyt-.... tää Fc-alueen sisältävän fuusioproteiinin puhdistukseen o. 30 tai tunnistukseen. Suositeltavat Fc-alueet sisältävät ih-. misen IgG 1 - tai rottaeläimen IgGi-proteiinin Fc-alueen. Eräs esimerkki on ihmisen IgGl-Fc-alue, joka on esitetty. sekvenssissä SEQ ID numero 3; toinen esimerkki on Fcalue, jota koodittaa cdna, joka on saatu PCR-menetelmällä 9 35 oligonukleotidialukkeilla sekvensseistä SEQ ID numero 9 ja SEQ ID numero 10 käyttäen ihmisen cdna:ta templaatti-

19 na. Osia sopivasta Fc-alueesta voidaan myös käyttää, esimerkiksi ihmisen IgGi-Fc-aluetta, josta on deletoitu se aminohapposekvenssi, joka on vastuussa sitoutumisesta proteiini A:han niin, että tuloksena syntynyt Fc-alue si- 5 toutuu proteiini G:hen, mutta ei proteiini A:han. [Gly4Ser]3-toistoalue muodostaa linkkerisekvenssin, joka erottaa CD4O-L-proteiinin solunulkoisen alueen fuusioproteiinin Fc-alueesta sellaisella etäisyydellä, joka on riittävä varmistamaan sen, että CD4O-L-proteiini 10 laskostuu oikein sekundaariseen ja tertiaariseen rakenteeseensa. Sopiva linkkerisekvenssi (1) sisältää joustavan pidennetyn rakenteen, (2) ei sisällä taipumusta sellaisen järjestyneen sekundaarirakenteen muodostumiseksi, joka voisi reagoida fuusioproteiinien toiminnallisten do- 15 meenien kanssa ja (3) sisältää minimaalisen hydrofobisen tai varautuneen ominaisuuden, joka voisi edesauttaa reaktiota toiminnallisten proteiinidomeenien kanssa. Tyypilliset pinta-aminohapot joustavilla proteiinialueilla sisältävät Gly-, Asn- ja Ser-jåännökset. Käytännössä minkä 20 tahansa aminohapposekvenssien permutaation, joka sisältää Gly-, Asn- ja Ser-jäännökset, voidaan odottaa tyydyttävän yllä olevat kriteerit linkkerisekvenssille. Muita lähes neutraaleja aminohappoja, kuten Thr ja Ala, voidaan myös käyttää linkkerisekvenssissä. Linkkerisekvenssin pituus 25 voi vaihdella ilman, että se merkittävästi vaikuttaa fuusioproteiinin biologiseen aktiivisuuteen. Linkkerisekvenssit ovat tarpeettomia silloin, kun fuusioitavilla proteiineilla on sellaiset ei-keskeiset N- tai C-pään aminohappoalueet, joita voidaan käyttää toiminnallisten 30 domeenien erotukseen ja ehkäisemään steerinen häiriö. CD40-L-polypeptidit voivat esiintyä liukoisina polypeptideinå, jotka sisältävät kuviossa 1 (SEQ ID numero 1) ja kuviossa 2 (SEQ ID numero 11) esitetyn CD40-Lproteiinin solunulkoisen domeenin, tai membraaniin sitou- 35 tuneina polypeptideinä, jotka sisältävät solunulkoisen domeenin, membraanin läpi kulkevan alueen ja solunsisäi-

20 19 sen domeenin, kuten on esitetty kuviossa 1 (SEQ ID numero 1) ja kuviossa 2 (SEQ ID numero 11) rottaeläimen ja ihmisen sekvensseille, vastaavasti. Lisäksi tässä esitetty kuvaus sisältää CD40-L-proteiinin solunulkoisten domeeni- 5 en tai niiden fragmenttien oligomeerit, jotka on liitetty 10 mällä. toisiinsa disulfidi-interaktioin, tai jotka on ekspressoitu fuusiopolymeereinä joko aminohappoliitosryhmävälikkeen kanssa tai ilman. Esimerkiksi dimeerinen CD4O-Lmolekyyli voidaan liittää yhteen IgG-Fc-alueen liitosryh- Ilman, että sitoudutaan teoriaan, membraaniin sitoutunut CD4O-L-proteiini ja oligomeerinen CD4O-Lproteiini voivat saavuttaa aktiivisuuden, joka stimuloi Ig-muodostusta ja B-solujen lisääntymistä, joka aiemmin 15 saavutettiin ainoastaan ristisidotulla anti-cd40-vastaaineella IL-4-proteiinin läsnä ollessa. Lisäksi tuntuu olevan todennäköistä, että monomeerinen liukoinen CD4O-Lproteiini, joka sisältää ainoastaan CD40-L-proteiinin solunulkoisen domeenin ja kykenee sitoutumaan CD40-20 reseptoriin, toimisi vastustaen membraaniin sitoutuneen ja oligomeerisen CD4O-L-proteiinin ja/tai ristisidottujen anti-cd40-vasta-aineiden aktiivisuutta. Edelleen tuntuu o olevan todennäköistä, että membraaniin sitoutuneen CD40- L-proteiinin interaktio CD40-proteiinin kanssa on pääasi- 25 allinen molekylaarinen interaktio, joka on vastuussa T- solukontaktista riippuvaisessa B-solun kasvun ja sekä antigeenispesifisen vasta-aineen tuoton ja polyklonaalisen Ig-erityksen induktiossa. Tässä suhteessa nisäkässolu, joka on transfektoitu cdna:11a, joka koodittaa täyspitkää 30 CD4O-L-proteiinia (se tarkoittaa, että se on membraaniin sitoutunut ja sisältää solunsisäisen domeenin, membraanin läpi kulkevan alueen ja solunulkoisen domeenin tai sen fragmentin), voi matkia T-soluja niiden kyvyssä indusoida. B-solun kasvua, erilaistumista ja antigeenispesifisen 35 vasta-aineen tuoton stimulaatiota. Tuntuu, että oligomee- risen liukoisen CD4O-L-proteiinin, suositeltavasti so-

21 20 lunulkoisten alueiden dimeerien, aktiivisuudet voivat matkia membraaniin sitoutuneen CD4O-L-proteiinin biologisia aktiivisuuksia. Lisäksi liukoinen monomeerinen CD40- L-proteiini (joka sisältää solunulkoisen domeenin tai sen 5 fragmentin) voi sitoutua CD40-reseptoriin ehkäisten T- solun interaktion B-solujen kanssa ja näin ollen sen aktiivisuus on samanlainen kuin CD40-proteiinin (reseptori) solunulkoisen domeenin, joka itsessään voi olla monomeerisessä tai oligomeerisessä muodossa. Vaihtoehtoisesti, 10 CD4O-L-proteiini voi olla oligomeerinen (suositeltavasti dimeeri) toimien liukoisena tekijänä, joka kykenee indusoimaan B-solun kasvun, erilaistumisen ja stimuloimaan antigeenispesifisen vasta-aineen tuoton. Sen mukaisesti tuntuu, että membraaniin sitoutunut CD4O-L-proteiini ja 15 oligomeerinen CD4O-L-proteiini toimivat CD40-proteiinin agonisteina, kun taas liukoinen (monomeerinen) CD4O-Lproteiini ja liukoinen CD40-proteiini toimivat CD40- proteiinin antagonisteina blokeeraten CD40-proteiinin reseptorikohdat ilman, että ne merkittävästi kuljettavat 20 signaalia, tai ehkäisemällä CD40-L-proteiinin sitoutumi- sen CD40-kohtiin B-soluissa ja muissa kohdesoluissa. Sekä CD40-proteiinin agonisteilla että antagonisteilla on käyttökelpoista terapeuttista aktiivisuutta. Esimerkiksi CD40-proteiinin agonistit (se tarkoittaa, 25 membraaniin sitoutunut CD4O-L-proteiini ja oligomeerinen CD4O-L-proteiini) ovat käyttökelpoisia rokoteadjuvantteina ja stimuloimaan monoklonaalisten vasta-aineiden tuottoa hybridoomasoluista. CD40-proteiinin antagonistit (se tarkoittaa, CD40-reseptori, CD40/Fc- ja mandollisesti 30 liukoinen monomeerinen CD4O-L-proteiini) ovat käyttökelpoisia hoidettaessa autoimmuunitauteja, joille on ominaista korkeiden antigeeni-vasta-aine-kompleksien tasojen läsnäolo, kuten allergia, ihohukka, nivelreuma, insuliinista riippuvainen sokeritauti (IDDM), käänteishyljintä- 35 tauti (GVHD) ja muut.

22 21 Ihmisen B-solujen IgE-eritys voidaan indusoida IL-4-proteiinilla T-solujen läsnä ollessa (Vercelli et al., J. Exp. Med. 169:1295, 1989). Lisäksi, IgE-tuotto voidaan indusoida T-soluista tyhjennetyistä PBM-soluista 5 (perifeerisen veren mononukleaariset solut) lisäämällä monoklonaalista anti-cd40-vasta-ainetta (Jabara et al., J. Exp. Med. 172:1861, 1990 ja Zhang et al., J. Immunol. 146:1836, 1991). Tässä kuvataan edelleen menetelmä IgEtuoton inhiboimiseksi aktivoiduista B-soluista, jotka on 10 aktivoitu IL-4-proteiinilla T-solujen läsnä ollessa tai CD40-L-proteiinilla (suositeltavasti membraaniin sitoutunut CD40-L-proteiini), joka menetelmä sisältää vaiheen, jossa annetaan tehokas määrä CD40/Fc-fuusioproteiinia, kuten tässä on kuvattu, tai liukoista CD40-proteiinia, 15 jota koodittaa se cdna-sekvenssi, joka on kuvattu sekvenssissä SEQ ID numero 3. Samalla tavalla CD40-reseptorit ja mandollisesti liukoinen CD4O-L-proteiini (ainoastaan monomeeri) voivat myös blokeerata muiden vasta-aineisotyyppien erityksen. 20 Edelleen tässä esitetään CD4O-L-polypeptidit, joihin on liittynyt luonnollinen glykosylaatiosisältö tai. se ei ole liittynyt. Hiiva- tai nisäkäsekspressiosystee-.. meissä (esim. COS-7-solut) ekspressoitu CD4O-L-proteiini voi olla samanlainen tai merkittävästi erilainen kuin 25 luonnollinen CD4O-L-polypeptidi molekyylipainon ja gly-.. kosylaatiosisällön suhteen riippuen valitusta ekspres- siosysteemistä. CD4O-L-polypeptidien ekspressio bakteeriekspressiosysteemeissä, kuten E. coli -bakteerissa, muodostaa glykosyloimattomia molekyylejä. 30 DNA-rakenteet, jotka koodittavat erilaisia amino- happojäännösten tai -sekvenssien lisäyksiä tai substituu-. g tioita tai päässä olevien tai sekvenssin sisäisten jään-.. nösten tai sekvenssien deleetioita, joita ei tarvita bio- logiseen aktiivisuuteen tai sitoutumiseen, voidaan val-. 35 mistaa. Esimerkiksi CD4O-L-proteiinin solunulkoista N- glykosylaatiokohtaa voidaan modifioida niin, että gly-

23 22 kosylaatio estyy samalla, kun sallitaan homogeenisen pelkistetyn hiilihydraattianalogin ekspressio käyttäen hiivan ekspressiosysteemejå. Eukaryoottisten polypeptidien N-glykosylaatiokohdille on ominaista aminohappotripletti 5 Asn-X-Y, jossa X on mikä tahansa aminohappo paitsi Pro ja Y on Ser tai Thr. Sopivat modifikaatiot tätä triplettiä koodittavaan nukleotidisekvenssiin johtavat sellaisiin substituutioihin, lisäyksiin tai deleetioihin, jotka ehkäisevät hiilihydraattijäännösten kiinnittymisen Asn- 10 sivuketjuun. Toisessa esimerkissä sekvenssit, jotka koodittavat Cys-jäännöksiä, voidaan muuttaa niin, että aiheutetaan Cys-jäännösten deletoituminen tai niiden korvaus toisella aminohapolla, joka ehkäisee molekyylien välisten väärien disulfidisidosten muodostumisen renaturaa- 15 tion aikana. Ihmisen CD4O-L-proteiini sisältää viisi Cysjäännöstä sen solunulkoisessa domeenissa. Näin ollen ainakin yksi viidestä Cys-jäännöksestä voidaan korvata toisella aminohapolla tai se voidaan deletoida ilman, että vaikutetaan proteiinin tertiaariseen rakenteeseen tai di- 20 sulfidisidosten muodostumiseen. Toiset lähestymistavat mutageneesiä varten sisältävät niiden sekvenssien modifikaatiot, jotka koodittavat kaksiemäksisiä aminohappojäännöksiä niin, että tehostetaan ekspressiota hiivasysteemeissä, joissa KEX2-25 proteaasiaktiivisuus on läsnä. CD4O-L-polypeptidin alayksiköt voidaan rakentaa deletoimalla ne sekvenssit, jotka koodittavat päisså olevia tai sekvenssin sisäisiä jäännöksiä tai sekvenssejä. CD4O-L-polypeptidejä koodittavat monieksoniset 30 geenit. Esillä oleva keksintö sisältää lisäksi vaihtoehtoiset mrna-rakenteet, jotka voivat johtua erilaisista mrna-silmukointitapahtumista transkription jälkeen ja joissa on yhteisiä alueita, jotka ovat identtisiä tai samankaltaisia tässä kuvattujen cdna:den kanssa. 35 Antisense- ja sense-oligonukleotidit sisältävät yksijuosteisen nukleiinihapposekvenssin (joko RNA:ta tai

24 23 DNA:ta), joka kykenee sitoutumaan kohde-cd4o-l-mrna:han (sense) tai CD4O-L-DNA-sekvensseihin (antisense). Esillä olevan keksinnön mukaiset antisense- tai senseoligonukleotidit sisältävät sekvenssin SEQ ID numero 1 5 tai SEQ ID numero 11 fragmentin tai sekvenssin SEQ ID numero 1 tai SEQ ID numero 11 DNA- tai RNA-komplementin. Sellainen fragmentti sisältää ainakin noin 14 nukleotidia. Suositeltavasti sellainen fragmentti sisältää noin 14 - noin 30 nukleotidia. Keinot muodostaa antisense- tai 10 sense-oligonukleotidi, joka perustuu CD4O-L-cDNAsekvenssiin, on kuvattu esimerkiksi julkaisuissa Stein ja Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988 ja van der Krol et al., BioRechniques 6:958, Antisense- tai sense-oligonukleotidien sitoutumi- 15 nen kohdenukleiinihapposekvensseihin johtaa sellaisten dupleksien muodostumiseen, jotka blokeeraavat translaation (RNA) tai transkription (DNA) yhdellä useista eri tavoista sisältäen tehostuneen dupleksien degradaation, transkription tai translaation enneaikaisen terminaation 20 tai muut tavat. Sopivat polymeraasipromoottorit sisältävät minkä tahansa RNA polymeraasin promoottorin, tai minkä tahansa DNA polymeraasin promoottorin. Antisense- tai sense-oligonukleotidit sisältävät lisäksi oligonukleotidit, joissa on modifioidut sokerifosfodiesterirungot (tai 25 muut sokerisidokset, kuten ne, jotka on kuvattu julkaisussa W091/06 629) ja joissa sellaiset sokerisidokset ovat resistenttejä endogeenisille nukleaaseille. Sellaiset resistentit sokerisidokset sisältävät oligonukleotidit ovat stabiileja in vivo (se tarkoittaa, ne kykenevät 30 vastustamaan entsymaattista degradaatiota), mutta niissä on jäljellä sekvenssispesifisyys, jotta ne kykenevät sitoutumaan kohdenukleotidisekvensseihin. Muut sense- tai antisense-oligonukleotidiesimerkit sisältävät ne oligonukleotidit, jotka on kovalenttisesti sidottu orgaanisiin 35 ryhmiin, kuten ne, jotka on kuvattu julkaisussa W091/10 448, ja muihin ryhmiin, jotka kohottavat oligo-

25 24 nukleotidin affiniteettia kohdenukleiinihapposekvenssiin, kuten poly-(l-lysiini). Edelleen, interkalatoivia aineita, kuten elliptisiiniä, ja alkyloivia aineita tai metallikomplekseja voidaan kiinnittää sense- tai antisense- 5 oligonukleotideihin niiden sitoutumisspesifisyyksien modifioimiseksi kohdenukleotidisekvenssiä kohtaan. Antisense- tai sense-oligonukleotidit voidaan viedä sisälle sellaiseen soluun, joka sisältää kohdenukleiinihapposekvenssin, millä tahansa geenisiirtomenetelmällä sisältäen esi- 10 merkiksi CaPO4 -välitteisen DNA-transfektion, elektroporaation tai muut geenisiirtovälineet, kuten Epstein-Barrviruksen. Antisense- tai sense-oligonukleotidit viedään suositeltavasti sisälle soluun, joka sisältää kohdenukleiinihapposekvenssin, insertoimalla antisense- tai sense- 15 oligonukleotidi sopivaan retrovirusvektoriin, sitten saattamalla solu kosketukseen halutun insertoidun sekvenssin sisältävän retrovirusvektorin kanssa joko in vivo tai ex vivo. Sopivat retrovirusvektorit sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, rottaeläimen retroviruksen 20 M-MuLV, N2 (retrovirus, joka on peräisin M-MuLV- viruksesta) tai kaksoiskopiovektorit, joiden nimet ovat. DCT5A, DCT5B ja DCT5C (katso PCT-patenttihakemus US... 90/02656). Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita pro-. moottorisekvenssejä oligonukleotidin ekspressoimiseksi. 25 Sense- tai antisense-oligonukleotidit voidaan myös viedä sisään soluun, joka sisältää kohdenukleoti-. disekvenssin, muodostamalla konjugaatti ligandia sitovan molekyylin kanssa, kuten on kuvattu julkaisussa WO... 91/ Sopivat ligandia sitovat molekyylit sisältä- 30 vät, mutta eivät ole rajoittuneet, solupintareseptorit, 0. kasvutekijät, muut sytokiinit tai muut ligandit, jotka. sitoutuvat solupintareseptoreihin. Ligandia sitovan mole- kyylin konjugoiminen ei suositeltavasti oleellisesti häi-. ritse ligandia sitovan molekyylin kykyä sitoutua sen vas taavaan molekyyliin tai reseptoriin tai blokeeraa sense-

26 25 tai antisense-oligonukleotidin tai sen konjugoidun muodon saapumista soluun. Sense- tai antisense-oligonukleotidi voidaan vaihtoehtoisesti viedä sisään soluun, joka sisältää koh- 5 denukleiinihapposekvenssin, muodostamalla oligonukleotidi-lipidi-kompleksi, kuten on kuvattu julkaisussa WO 90/ Sense- tai antisense-oligonukleotidi-lipidikompleksin erottaa toisistaan suositeltavasti solun sisällä oleva endogeeninen lipaasi. 10 Rottaeläimen CD4O-L-cDNA-sekvenssi saatiin suorilla ekspressiomenetelmillä. Ihmisen CD40-L-sekvenssi saatiin lajien välisillä hybridisaatiomenetelmillä käyttäen rottaeläimen CD4O-L-cDNA:ta koettimena. Kloonasimme rottaeläimen CD4O-L saamalla ensin 15 ihmisen CD40-proteiinin (reseptori) solunulkoisen alueen kloonin polymeraasiketjureaktiomenetelmällä (PCR) käyttäen alukkeita, jotka perustuivat sekvenssiin, jonka ovat julkaisseet Stamenkovic et al. (SEQ ID numero 4). Ylävirran oligonukleotidialuke 5'-CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' 20 (SEQ ID numero 5) muodostaa SalI-kohdan CD40-proteiinin aloitusmetioniinin yläpuolelle ja alavirran oligonukle-. otidialuke 5'-CCGTCGACGTCTAGAGCCGATCCTGGGG-3' (SEQ ID nu- mero 6) insertoi terminaatiokodonin CD40-proteiinin aminohapon 192 jälkeen, jota seuraa XbaI- ja SalI-kohdat. 25 Amplifioitu cdna digestoitiin SalI-entsyymillä ja se kloonattiin vektoriin pdc406 (McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991) plasmidin pdc406/s CD40 rakentamiseksi. Toinen CD40-reseptorifragmentti (SEQ ID numero 4) saatiin PCR-menetelmillä ihmisen IgGl-Fc-domeenin 30 SEQ ID numero 3) fuusioimista varten. Lyhyesti, ylävirran oligonukleotidialuke (SEQ ID numero 5) ja fuusiotemplaat- ti (SEQ ID numero 4) olivat samat kuin aiemmin. Alavirran oligonukleotidialuke oli 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3' (SEQ ID 35 numero 7), joka insertoi aminohapot Tyr Val Glu Pro Arg (SEQ ID numero 8) CD40-proteiinin aminohapon 193 jälkeen.