(B) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNI NGSSKRIFT (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 C 07K 15/00, G 01N 33/68. (24) Alkupäivä - Löpdag

Transkriptio

1 (B) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNI NGSSKRIFT (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 C 07K 15/00, G 01N 33/68 (21) Patenttihakemus - Patentansökning SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P US P US P (71) Hakija - Sökande 1. Scripps Clinic b Research Foundation, North Torrey Pines Road, La Jolla, Cal., USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Lerner, Richard Alan, 7750 E. Rosenland, La Jolla, Cal., USA, (US) 2. Green, Nicola (MMI), 7750 E. Roseland, La Jolla, Cal., USA, (US) 3. Sutcliffe, J. Gregor, 1467 Kings Cross Drive, Cardiff, Cal., USA, (US) 4. Shinnick, Thomas Michael, Jonny Lane, San Diego, Cal., USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Leitzinger Oy (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Diagnostinen vasta-aine ja menetelmä sen valmistamiseksi Diagnostik antikropp och förfarande för dess framställning (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer FI A (C 12N 15/00), EP A 1930 (C 07K 1/02), US A (C 07C 103/52), US A (C 07C 103/52), Chemical Abstracts 85(1976) t (57) Tiivistelmä - Sammandrag Erittäin puhdas ja spesifinen synteettinen peptidi valmistetaan määrittämällä DNA-sekvenssi ja sen jälkeen syntetisoimalla peptidi, joka vastaa luonnonantigeeniproteiinin mandollista antigeenideterminanttia, joka voi olla tunnettu tai tuntematon, ja kiinnittämällä synteettinen peptidi kantajaan. Tätä synteettistä antigeeniä voidaan käyttää valmistettaessa rokotetta, joka isäntäeliöön vietynä käynnistää isäntäeliössä luonnonproteiinin vasta-aineiden tuoton tai solun välittämän reaktion luonnonproteiinin suhteen tai kummatkin, jolloin peptidi muodostaa näin valmistetun antigeenin spesifisen antigeenideterminantin.

2 En synnerligen ren och specifik, syntetisk peptid framställes genom bestämning av DNA-sekvens och därefter genom att syntetisera en peptid, som motsvarar ett naturantigenproteins eventuella antigendeterminant, som kan vara känd eller okänd, och genom att fästa en syntetisk peptid vid en bärare. Denna syntetiska antigen kan användas vid framställning av vaccin, som infört i värdorganismen igångsätter i värdorganismen produktion av naturproteinets antikroppar eller en cellförmedlad reaktion mot naturproteinet eller bägge, varvid peptiden bildar det så framställda antigenets specifika antigendeterminant

3 Diagnostinen vasta-aine ja menetelmä sen valmistamiseksi Diagnostisk antikropp och förfarande för dess framställning Oheisen keksinnön kohteena on uusien synteettisten antigeenien valmistaminen DNA-sekvensseistä saadun informaation perusteella diagnostisiin tarkoituksiin. Tarkemmin sanoen tämän keksinnön kohteena ovat tällaiset antigeenit, jotka on muodostettu kytkemällä kantajaan synteettinen antigeenideterminantti, joka immunologisesti vastaa luonnonproteiinin osaa (antigeeni). Antigeenit on alalla aikaisemmin saatu usealla tavalla mukaanlukien johtamalla luonnonaineista, kytkemällä hapteeni kantajaan ja rekombinanttiin DNA-teknologian avulla. Sela et al (Proc. Nat. Acad. Sci., USA, Vol. 68, no. 7, sivut , heinäkuu 1971; Science, Vol. 166, sivut , joulukuu 1969; Adv. Immun., Vol. 5, sivut , 1966) ovat myös kuvanneet eräitä synteettisiä antigeenejä. Luonnonaineista saatuihin antigeeneihin kuuluu lukematon määrä tunnettuja luonnossa esiintyviä antigeenejä, kuten veriryhmän antigeenit, HLA-antigeenit, differentiaatioantigeenit, virusja bakteeriantigeenit ja vastaavat. Näiden antigeenien tunnistamiseen ja tutkimiseen on käytetty viimeisen vuosisadan aikana huomattava määrä ponnistuksia. Tiettyjä "synteettisiä" antigeenejä on valmistettu kytkemällä pieniä molekyylejä (kuten esimerkiksi dinitrofenolia) kantajamolekyyleihin (kuten esimerkiksi häränseerumialbumiiniin), jolloin muodostuu antigeenejä, jotka aiheuttavat vasta-aineen muodostumisen mainitulle kytketylle pienelle molekyylille. Kantajamolekyyli on tarpeen, koska eläimen, johon se injiscitiin, immuunisysteemi ei "tunnista" itse tätä pientä molekyyliä. Tätä tekniikkaa on myös käytetty erillisissä tapauksissa

4 antigeenien valmistamiseen kytkemällä tunnettujen proteiinien peptidipalasia kantajiin, kuten on kuvattu edellä viitatuissa Sela'n et al artikkeleissa. Vaikkakin tämä hapteeni-kantaja-tekniikka on palvelut hyvin tutkijakuntaa, sen immuunireaktion luonnetta koskevissa tutkimuksissa, sillä ei ole ollut merkittävää hyötyä sellaisten antigeenien valmistuksessa, joilla olisi merkitystä diagnostiikassa. Tähän puutteeseen on olemassa useita syitä. Ensiksikin, jotta tällä tekniikalla voitaisiin valita ja konstruoida hyödyllinen antigeenideterminantti patogeenista (esimerkiksi hepatiitti B-virus), on kohtalaisen onnistumismandollisuuden takaamiseksi määritettävä patogeenin koko proteiinisekvenssi. Tämän tehtävän vaikeuden vuoksi sitä on harvoin, jos koskaan, tehty. Toiseksikin, vaikka oltaisiin halukkaita määrittämään patogeenin koko proteiinisekvenssi, jää muita ongelmia. Erityisesti monet mielenkiintoiset antigeenit ilmentyvät harvoin tai ei lainkaan tavallisissa patogeenien populaatioissa. Esimerkiksi gonokokki ilmentää patogeenisen antigeenisen determinanttinsa kanssa. Siten mielenkiintoista antigeenia ei ehkä saada viljelemällä tavanomaisesti gonokokkia in vitro. Tunnettujen RNA- ja DNA-virusten onkogeeniset proteiinit eivät myöskään ole läsnä virushiukkasissa vaan ilmentyvät vain, kun virus- ja isäntäsolu ovat vuorovaikutuksessa. Näin muodoin näitä proteiineja ei voida saada tavanomaisilla virusten eristys- ja proteiinien puhdistusmenetelmillä. Hybridoma-teknologiaa käyttämällä voidaan valmistaa vastaaineita virusten geenituotteille. Periaatteessa on hybridomateknologialla mandollista alkaa monimutkaisella antigeeniseoksella ja muodostaa myöhemmin prosessissa spesifisiä vastaaineita.

5 Tätä vastoin oheinen keksintö on päinvastainen menetelmä sikäli, että aloitamme lopullisesta, erittäin puhtaasta antigeenideterminantista, jolloin haluttua antigeenituotetta ei tarvitse puhdistaa. Hybridoma-vasta-aineilla tiedetään olevan alhainen aviditeetti ja alhainen sitoutumisvakio, joten niiden arvo on rajoitettu. Hybridoma-teknologiassa on viime kädessä luotettava siihen, että pahanlaatuiset solut tuottavat vasta-aineen, mihin kaikkeen liittyy luonnollisesti huoli erotustekniikasta, puhtaudesta ja turvallisuudesta. Hybridoma-tuotto perustuu kudosviljelmään tai hiirien viemiseen. Tämän ilmeisenä seurauksena on, että tuottaminen on kallista ja erien välillä esiintyy luontaista vaihtelevuutta. Lisäksi on vaikeaa valmistaa hybridi molekyyleille, jotka ovat vain pieni prosenttimäärä siitä monimutkaisesta seoksesta, josta on lähdettävä. Se, että jäljempänä kuvatulla menetelmällä onnistuttiin muodostamaan vasta-aineita, jotka reagoivat hiiri-leukemiaan ja hepatiittiin B-virusten natiivien proteiinien kanssa, oli itse asiassa varsin yllättävää ja myös vastoin molekyylibiologian tämänhetkistä ajatustapaa. Yllätys oli kaksinkertainen. Ensiksikin koe muodostui joukosta peräkkäisiä tapahtumia, jotka kaikki oli suoritettava onnistunnesti, vaikka vain muutamat niistä olivat rutiinia. Monet näistä vaiheista tarvittiin tuottamaan DNA-sekvenssit, jotka muodostivat peptidisynteesin perusrungon. Yllättävää oli, että voitiin suorittaa näin monta peräkkäistä vaihetta, joista kukin oli biologisen luonteensa vuoksi oikullinen. Toiseksi oli varsin yllättävää, että lyhyet suorat peptidiketjut toivat esiin vasta-ainereaktiota eläimissä

6 ja että nämä esiintulleet vasta-aineet pystyivät tunnistamaan paljon suurempia ja monimutkaisempia natiiveja proteiinirakenteita. Mitä tulee edelliseen kohtaan, seuraavat vaiheet oli suoritettava. Seuraavat näkökohdat tekevät loppumenestyksen todennäköisyyden pieneksi ja jopa kaukaiseksi. Ensiksikin DNA-molekyylin cdna-kopion kloonauksessa käytetään DNA-lähtöaineen komplementtien nukleotidien polymeroimiseen retroviruksen käänteis-transkriptaasi-entsyymiä. Tällaisen kopiointitapahtuman luotettavuus on sellainen, että viidestäsadasta nukleotidistä kopioituu väärin noin yksi. Toinen virhelähde muodostuu lisäksi siitä, että RNA-polymeraasientsyymi, joka itsessään on jokseenkin epätarkka jäljentävä entsyymi, kopioi RNA-lähtöaineiden elävässä solussa tämän geenistä. Sen jälkeen kytketään cnda-kopio plasmidivektoriin, jossa tapahtumassa on osoitettu usein tapahtuvan toisiintumisia kloonatussa DNA - palasessa. Sen jälkeen plasmidi viedään bakteeriin ja valitaan muuntuneet pesäkkeet, joissa on rekombinanttiplasmidi. Muuntuneiden bakteereiden pesäke hajotetaan sivelemällä kasvualustalle ja massan kasvua ja DNA:n valmistusta varten valitaan yksi ainoa eriste. Koska tässä prosessissa on tapahtunut useita jäljentämiskierroksia, ei ole mitään varmuutta siitä, etä yksi tai useampi nukleotidiä muuttavista tapahtumista ei olisi vahingoittanut geeniä, jonka eristämisessä ei ole ollut mitään selektiopainetta. Tällainen vaurio saattaa tehdä tällaisen geenin DNA-sekvenssin sisällöttömäksi tai suuresti vähentää sen käyttökelpoisuutta peptidien valinnan ja niiden synteesin sinikopiona. Nämä tähän mennessä kootut haitat ovat samoja, jotka liittyvät DNA:n eristämiseen sekvenssianalyysiä varten siten, että tämä DNA täsmälleen esittäisi alkuperäistä virusgeeniä. Seuraava toimenpideryhmä johtaa virusgeenin DNA-sekvenssiin. Näiden tutkimusten alussa oli juuri tulossa esiin mandollisuus,

7 että tiedemiehet kykenisivät tarkasti ratkaisemaan geenikokoiset nukleotidisekvenssit rutiinimaisella tavalla Sanger ja hänen työtoverinsa (Sanger et al, 1977, Nature 265: 687) kuvasivat yrityksiään ratkaista pienen bakteeriviruksen 6X174 nukleotidisekvenssi. Heidän ratkaisunsa, jossa 5300 nukleotidissä oli yli 30 virhettä, perustui voimakkaasti siihen, että proteiinin ja RNA:n sekventoinnin avulla tutkittiin DNA:n sekventointitulokset. Tässä työssä oli kiinni yli 10 ammattitaitoista tiedemiestä noin 5 vuoden ajan. Nämä tutkijat, joista eräälle myönnettin työstään Nobelin palkinto, päättelivät, että "Kuten muissakin nukleiinihappojen sekventointimenetelmissä, ei käytettyä plus- ja miinus-tekniikkaa sinänsä voida pitää täysin luotettavana, vaan virheitä voi silloin tällöin esiintyä. Nämä virheet ja epävarmuudet voidaan poistaa vain vieläkin enemmän työtä vaativilla kokeilla. Vaikkakin suuri osa sekvenssistä on vahvistettu, kuluu luultavasti vielä pitkä aika ennen kuin koko järjestys voidaan vahvistaa. Emme ole vakuuttuneita, että jokaisen yksityiskohdan vahvistaminen on tieteellisesti oikeutettua...". Geenin ratkaistun DNA-sekvenssin perusteella ennustettu proteiinisekvenssi pysyy siten hypoteettisena, kunnes sen tarkkuus on todistettu. Tällaisia todistuksia on nyt kolmea muotoa - joko geenin proteiinituotteen osittainen aminohappojärjestyksen analyysi tai havainto, että DNA-sekvenssin ennustaman proteiinin synteettisten peptidien vastavirta-aineet reagoivat natiivin proteiinin kanssa tai kloonatun geenin funktionaalisen proteiinin todellinen ilmentyminen (suhteellisen harvinainen tapahtuma). Nämä tekijät ovat tulkinneet Arnon'in et al. (1971, Proc. Nat. Acad. Sci. 68: 1450) Atassain (1975, Immunochemistrv 12: 423) ja Vyas'in et al. (1972 Science 178:1300) aikaisemmat tutkimukset ja osoittaneet, että yleisesti ottaen on epätodennäköistä, että lyhyet suorat aminohapposekvenssit synnyttävät vasta-aineita, jotka reagoivat natiivin proteiinirakenteen kanssa. Useimpien molekyylien useimmilla alueilla uskottiin

8 antigeenideterminanttien johtuvan aminohappotähteistä, jotka olivat selvästi erillään suorassa sekvenssissä mutta lähellä toisiaan kääntyneessä proteiinissa. Vasta-aineiden tuottamiseen käytettyjen peptidien täsmällisen kolmidimensionaalisen konformaation uskottiin olevan useimmissa tapauksissa kriittinen, myös niillä antigeeneillä, joissa aminohapot ovat lähellä toisiaan sekvenssissä. Esimerkiksi Sela uskoi, että anti-lysotsyymi-reaktion tuottamiseen täytyi syntetisoida melko monimutkainen silmukkarakenne; Atassi valmisti useita monimutkaisia molekyylejä, joiden kunkin oli tarkoitus jäljitellä kohdeproteiinin tertiääristä rakennetta, ja Vyas päätteli, että hepatiitti B-viruksen pinnan antigeenin kolmidimensionaalinen konformaatio oli kriittinen tekijä tuotettaessa vasta-aineita, jotka reagoivat tämän natiivin rakenteen kanssa. Tässä hakemuksensa esitetty havainto osoittaa, että muita tutkijoita huolestuttaneet seikat, joiden perusteella he uskoivat, että nämä kokeet eivät toimisi, olivat perusteettomia. Olemme kuitenkin havainneet, että suorien peptidien vasta-aineet reagoivat natiivien molekyylien kanssa ja että monimutkaiset synteesit ovat tarpeettomia, epätaloudellisia ja vanhanaikaisia tämän keksinnön esiintuoman edistysaskeleen valossa. Tämän keksinnön mukaisesti mielenkiintoinen proteiiniosa organismissa ei ole erityisen tärkeä, koska voidaan lähteä geenistä, joka tuottaa proteiinin ja kaikkia geenejä on yleensä mukana enemmän tai vähemmän yhtä suuret määrät. Siten voidaan valmistaa angigeeneja, jotka indusoivat vasta-ainereaktion jopa organismin pienimmillekin proteiinikomponenteille. Koska tässä keksinnössä saadaan antigeeni, joka ei sisällä lainkaan kilpailevia ja häiritseviä proteiineja, valmiste tuottaa suojaavaa tai talteenotettavia vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä mielenkiinnon kohteena olevan antigeenideterminantin suhteen; täten ei esiinny mitään ristireaktiivisuutta minkään muun antigeenideterminantin kanssa.

9 Koska tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan kasvattaa käytännöllisesti katsoen missä tahansa mielenkiintoisessa isäntäeläimessä, suurissa eläimissä, kuten lampaissa, hevoseläimissä jne., voidaan hyvin helposti ja halvalla saada käytännöllisesti katsoen täysin identtisten ja luotettavien vasta-aineiden pitkäikäinen lähde tai "varasto" yksinkertaisesti vain aika ajoin ottamalla vasta-aineet talteen tästä isäntäeläimestä. Tämä on suuri etu, kun verrataan vasta-aineiden kasvattamisen kustannuksia ja epäluotettavuutta alan aikaisempien oppien mukaisesti. Tämän keksinnön periaatteiden avulla on mandollista suunnitella ja tuottaa antigeeni käytettäväksi vasta-aineina, joilla ei lainkaan ole sitä erittäin vakavaa moniin antigeeneihin kohdistuvaa autoimmuunireaktiota, joka on estänyt tai suuresti rajoittanut kokonaisten proteiini-vasta-aineiden käyttöä diagnoosissa. Tämän keksinnön avulla voidaan valmistaa uusia vasta-aineita, jotka koskaan ennen eivät ole olleet mandollisia. Lyhyesti sanottuna alan kaikki aikaisemmat vasta-aineiden valmistusmenetelmät, mukaanlukien viimeaikaiset rekombinantti DNAja hybridoma-menetelmät ovat oheiseen keksintöön verrattuna teknillisesti monimutkaisempia ja kalliimpia, enemmän aikaa vieviä ja niiden saannot ovat sekä määrällisesti että laadullisesti alhaisemmat. Lisäksi niissä kaikissa on jonkin verran turvallisuus- ja luotettavuusvaikeuksia, joita aina esiintyy menetelmässä, jossa haluttu komponentti on erotettava ei-toivotuista komponenteista. Alan aikaisemmilla menetelmillä ei myöskään ole mandollista poistaa tietyn antigeenin autoimmunologiset reaktiot, kun taas oheinen keksintö avaa tien näihin uusiin tuloksiin. Tämä keksintö tarjoaa uusia, odottamattomia tuloksia yksinkertaisemmalta, halvemmalla ja suoremmalla ja

10 tuottavammalla tavalla kuin alalla aikaisemmin on ollut mahdollista. Oheisen keksinnön avulla vältetään alan aikaisempien uusien synteettisten antigeenien valmistusmentelmien nämä ja muut esteet ja haitat. Tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet ovat spesifisiä halutulle antigeenille eivätkä ristireagoi vääriin antigeenideterminantteihin, joita voi esiintyä antigeenin epärelevanteissa osissa. Yleisesti sanoen synteettinen antigeeni (joka vastaa immunologisesti luonnon, spesifisen antigeenideterminantin sisältävää antigeenia) voidaan muodostaa seuraavien vaiheiden avulla: (a) määritetään genomista (joko DNA tai RNA) koko mielenkiintoisen peptidialueen tai sen osan aminohapposekvenssi; (b) ennustetaan peptidialueet, jotka ovat potentiaalisia antigeenideterminantteja; (c) valmistetaan synteettinen antigeenideterminanttipeptidi, joka immunologisesti duplikoi yhden tai useamman luonnonantigeeniä vastaavan antigeenideterminantin; ja tarvittaessa (d) kytketään vaiheessa (c) muodostettu synteettinen determinantti farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan, jolloin on saatu haluttu synteettinen antigeeni. Vasta-aineen valmistuksesa käytetty rokote valmistetaan siten, että kyseessä olevan organismin DNA-sekvenssistä (tai pienestä cdna-sekvenssistä, jos genomi on RNA) määritetään proteiiniantigeenin antigeenideterminanttiosan aminohapposekvenssi, syntetisoidaan peptidi, joka antigeenisesti on toisinto tai

11 oleellisesti toisinto proteiinin determinanttiosasta, ja tarvittaessa kiinnitetään synteettinen peptidi kantajaan tai muodostetaan kantajan muodostama antigeeni, jossa peptidi on spesifinen antigeenideterminantti ja joka isäntäeliöön vietäessä käynnistää vasta-aineiden tuoton proteiiniantigeenin suhteen. Vasta-aineiden valmistusmenetelmässä injisoidaan edellä kuvattu rokote isäntäeliöön ja isännän nesteistä otetaan talteen proteiiniantigeenin vasta-aineet, joita käytetään tavanomaisissa diagnostisissa toimenpiteissä proteiinivasta-aineen havaitsemiseen. Vaikkakin keksinnössä on monia menetelmällisiä vaiheita, joissa käytetään monia aineita tämän keksinnön mukaisten vasta-ainevalmisteiden valmistuksessa ja toteutettaessa tämän keksinnön mukaisia menetelmiä, kuten jäljempänä tullaan yksityiskohtaisemmin tarkastelemaan, on huomattava, että keksintö ei rajoitu minkään tiettyjen vaihdeiden tai reagenssien tai olosuhteiden hyväksikäyttöön. Keksintö on pikemminkin käsiteltävä edellä kuvatulla tavalla käsitteelliseksi keksinnöksi, joka on määritelty oheisissa patenttivaatimuksissa. Diagnoosia, jolloin indusoidaan väliaikainen immuniteetti, ja muita käyttötarkoituksia varten tehdyt vasta-ainevalmisteet, jotka ovat muodostuneet isäntäeliön edellä kuvattuihin rokotteisiin kohdistuvan immuunireaktion avulla ja jotka on otettu talteen tavalliseen tapaan, ovat myös tärkeitä tämän keksinnön yleisajatuksen ja spesifisten sovellutusten kannalta. Tämän keksinnön eri puolia voidaan käyttää hyödyksi muodostettaessa yhden vasta-aineen sisältävä tuote, jossa peptidin spesifinen antigeenideterminantti-luonne on merkittävä tai vähintään pääasiallinen tekijä sikäli kuin on kysymys tuotteen

12 biologisesta toiminnasta. Esimerkiksi liposomit voivat sisältää rasvahappopeptidiosia, joissa peptidiosaan kuuluu kaksi tai useampia, kandelle tai useammalle organismille spesifisiä antigeenideterminantteja. Kokonaisuuteen kuuluvat antigeenikantajat, jotka on muodostettu useasta synteettisestä peptidispesifisestä antigeenideterminantista, voivat olla syntetisoidut päästä päähän, yhdistetty synteesin jälkeen tai valmistettu näiden kanden tavan yhdistelmällä. Myös muut yhdistelmät ovat mandollisia. Kuvio 1 kuvaa Mo - MuLV - proviruksen 3'-pään nukleotidisekvenssiä. Kuvio 2 esittää leimatun SCRF 60A solulisaattia, joka on saatettu reagoimaan erilaisten antiseerumien, mukaanlukien tämän keksinnön mukaisen uuden synteettisen rokotteen antiseerumin kanssa, SDS - PAGE - erotuksen autoradiografiaa. Kuvio 3 on Mo-MuLV // proviruksen uusittu geenikartta. Kuvio 4 on leimatun SCRF 60A solulisaatin, johon on viitattu kuviossa 2, SDS-PAGE-erotuksen autoradiograafi. Kuviossa 6 on verrattu Mo-MuLV- ja AKV-virusten geenikarttojen osia. Kuvio 6 on pyyhkäisyelektronimikroskoopin fotomikrograafi virushiukkasen pinnasta, jossa on vasta-aineita, jotka on kasvatettu tämän keksinnön mukaista R-synteettistä antigeeniesimerkkiä vastaan ja konjugoitu näkemisen helpottamiseksi ferritiinin kanssa. Kuviossa 7 on esitetty HB D Ag:n 226 aminohapon sekvenssi, jonka Pasek et al on tulkinnut nukleiinihapposekvenssistä. Yksikirjaimisella koodilla (A ala, C cys, D asp, E glu,

13 F phe, G gly, H his, I ile, K lys, L leu, M met, N asn, P pro, Q gln, R arg, S ser, T thr, V val, W trp, Y tyr) on osoitettu synteesiin valitut proteiinialueet. Näitä peptidejä vastaavat lihavasti alleviivatut alueet on numeroitu 1-8 tai 3a-6a, 8a. Lihavan alleviivauksen lopussa C tai Y osoittaa, missä teknillisistä syistä lisättiin kysteeniä tai tyrosiinia, jota on löydetty primäärisessa sekvenssissä. Ryhmät, jotka eivät ole samoja kaikissa kolmessa nukleotidisekvenssin määrityksessä on alleviivattu ohuella. Monet näistä ovat kerääntyneet välille Kuviossa 8 on esitetty peptidisekvenssi ja sen asema (vastaa kuviossa 1 alleviivattuja ryhmiä). Alleviivatut ryhmät eivät olleet primäärisessä proteiinisekvenssissä vaan ne lisättiin, jotta olisi mandollista suorittaa kytkentä kantajaan tai radiojodata. Lukuunottamatta peptideitä 1, 3a ja 7 kytkettiin kaikki peptidit kantajaproteiiniin KLH kohdassa "menetelmät" kuvatulla tavalla. Peptidi 1 käytettiin kytkemällä KLH-kantajaan. Peptidit 3a ja 7 olivat liukenemattomia eikä niitä käytetty. Kuvio 9 on autoradigraafikuva radioaktiivisesti leimatuista, puhdistetuista Dane-hiukkaista, jotka oli saatettu reagoimaan 5 gl kanssa normaalista anti-peptidi 3 seerumia tai anti-peptidi 4 seerumia. Sakat otettiin talteen ja valmistettiin elektroforeaasia varten kohdassa "menetelmät" kuvatulla tavalla. Näytteet elektroforesoitiin 5-17 % SDS-polyakryyliamidigeelillä ja autoradiografoitiin. Kuviossa 10 on kuvattu infulenssa X-47 kannan genomi ja genomin tulkinta. Kystiiniä lisätään kytkentää varten

14 peptidialueelle, jonka arvellaan olevan potentiaalisen antigeenideterminantin, ja leiman, esimerkiksi radioleiman, kiinnittämiseksi peptidiin lisätään tyrosiinia. Kuviossa 11 kuvaa suu- ja sorkkataudin genomia ja alueita, jotka peptidisekvensseiksi tulkittuina ovat todennäköisesti spesifisiä antigeenideterminanttialueita. Kuviossa 12 on kuvattu poly(spesifinen antigeenideterminantti-peptidi) kopolymeeriantigeeni. Menetelmä ja materiaalit Tälle keksinnölle ainutlaatuiset menetelmät ja materiaalit on kuvattu jäljempänä erityisesti huomioiden itse menettelytapa. Itse laboratoriotekniikat, menetelmät ja materiaalit ovat yleisesti kuitenkin samoja, joita käytetään yleisesti molekyylibiologiassa ja biokemiassa. Mielenkiinnon kohteena olevien yleisten materiaalien ja menetelmien suhteen viitataan erityisesti seuraaviin teoksiin: METHODS IN ENZYMOLOGY. toim.: Colowick, S.P. ja Kaplan, N.O., Academic Pres, New York; METHODS IN IMMUNOLOGY AND IMMUNO- CHEMISTRY, Academic press, ja HANDBOOK OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Chemical Rubber Publishing Company. Hapteenien ja antigeenien valmistaminen kiinnittämällä determinantti kantajaan on erittäin yleisesti tunnettu tekniikka, ja lukuisia kantajia on kuvattu. Yleisesti tunnettuja kantajia ovat maljakotilon hemosyaniini (keyhole limpet Hemocyanin, (KLH)), häränseerumialbumiini (BSA), lampaan erytrosyytit (SRBC), D-glutamiinihappo:D-lysiini. Mikään yksittäinen laboratoriotekniikka ei ole sinänsä uusi; : - keksintö piilee pikemminkin tuotteissa, joita ei koskaan aikai-

15 semmin ole ollut olemassa ja jotka merkitsevät suurta funktionaalista edistysaskelta verrattuna alan viimeaikaisiin tuotteisiin, ja kokonaisuutena menetelmissä, joilla tämän keksinnön mukaiset tuotteet valmistetaan. Seuraava lähdeluettelo on annettu taustatiedoksi ja viitteiksi: Lähdeluettelo 1. Baltimore, D., Cold Spring Harbor Symp., Ouant.Biol. 39, ;0 (1974). 2. Oskarsson, M.K., Elder, J.H., Gautsch, J.W. Lerner, R.A. ja Vande Woude, G.F., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 75, (1978). 3. Gautsch, J.W., Elder. J.H., Schindler, J., Jensen, F.C., ja Lerner, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 75, (1978). 4. Jamjoon, G.A., Naso, R.B. ja Arlinghaus, R.B., Virol. 78, (1977). 5. Famulari, N.C., Buchhagen, D.L., Klenk, H.D., ja Fleissner, E., J. Virol. 20, (1976). 6. Witte, 0.N., Tsukamoto-Adey, A. ja Weissman, L.L., Virol (1977). 7. Fan, H. ja Verma, I.M., J. Birol (1978). 8. Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Lerner, R.A., Johnson, P. ja Verma, I.M., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44. painossa (1979). 9. Sutcliffe, J.G., Shinnick. T.M., Verma. I.M. ja Lerner, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., painossa (1980). 10. Marglin. A. ja Merrifield, R.B., Ann. Rev. Biochem. 39, (1970). 11. Pederson, F.S. ja Haseltine, W.A., J. Virol. 33, (1980). 12. Atlas of Protein sequence and Structure, Vol. 5, Sup. 3, M.O. Dayhoff, toim., Natl. Biomed. Res. Found., julk. Washington, D.C. (1978).

16 Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. ja Orcutt, B.C., s. 352 op. cit. 14. Fisher, R.A., The Genetical Theorv of Natural Selection, Clarendon Press, Oxford (1930). 15. Eider. J.H., Gautsch, J.W. Jensen, F.C., Lerner, R.A., Harley, J.W. ja Rowe, W.P., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 74, (1977). 16. Lerner, R.A., Jensen, F.C., Kennel, S.J., Dixon, F.J., Roches, G.D. Francke, U., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 69, (1972). 17. Niman, H.L. ja Elder, J.H., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., painossa (1980). 18. Edwards, S.A. ja Fan, H., J. Virol. 30, (1979). 19. Kitaga#a, T. ja Ailawa, T., J. Biochem. (Tokyo) 79, 233 (1976). 20. Liu, F., Zinnecker, M., Hamaoka, T. ja Katz, D.H. Biochem. 18, 690 (1979). 21. Katz, David H., U.S.-patentti n:o 4,191,668, J. Exp. Med., 134: (1971). 23. J. Exo. Med.. 136: , (1972). 24. J. Exp. Med., 138: (1973). 25. J. Exp. Med., 139: (1974). 26. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 71: Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 73: (1976). 28. J. Immunol. 114: (1975). 29. J. Immunol. 120: (1978). 30. J. Exp. Med., 139: (1974). 31. Humphrey, J.H. ja White, R.G., Immunology for Students of Medicine, Blackwell, Oxford (1970). 32. Katz, David H. ja Benacerraf, Baruj, Immunological Tolerance, Mechanisms and Potential Therapeutic Applications, Academic Press (1974). 33. Newsweek, , sivut Chemical & Enqineering News, , s. 10.

17 Milstein, C., Differentiation 13: 55 (1979). 36. Howard, J.C., Butcher, G.W. Galfre', G., Milstein. C. ja Milstein, C.P., Immunol. Rev. 47: 139 (1979). 37. Hammerling. G.J., Hammerling, U., ja Lemke, H., Immunogenetics 8: 433 (1978). 38. Shulman. M., Wilde, C.D., ja Köhler, G., Nature 276: 269 (1978). 39. Köhler, G. ja Milstein, G., Nature 256: 495 (1975). 40. Ledbetter, J.A. ja Herzenberg. L.A., Immunol. Rev. 47: 63 (1979). 41. Gefter, M.L., Margulies. D.H. ja Scharff, M.D., Somatic Cell Genetics 3: 231 (1977). 42. Köhmler. G. ja Milstein. C., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976). 43. J. Biol. Chem., 241: (1966). 44. J. Biol. Chem., 242: (1967). 45. Kprowski, Hilary et al. US-patentti nro 4,196,265, huhtikuu Science 209, nro 4463, sivut (syyskuu 1980 koko numero). 47. Davis, B.D., Dulbecco. R., Eisen, H.N., Ginsberg, H.S., Wood, W.B. Jr., ja McCarty, M., Microbiology, Harper & Row, Hagerstown, Md., Morgan, J. ja Whelan, W.J., Recombinant DNA And Genetic Experimentation. Pergamon Press, New York, Goldstein, L. ja Prescott, D.M., Cell Biology. A Comprehensive Treatise. Vols. 1, 2 & 3, Academic Press, San Francisco. 50. Scott, W.A. ja Werner, R., Molecular Cloning of Recombinant DNA, Academic Press, New York, Wu, Ray (Ed.), Colowick, Sidney P., ja Kaplan, Nathan 0., Methods in EnzYmologY, yleisesti ja Vol. 68, "Recombinant DNA" erityisesti, Academic Press, New York. 52. Cooper, Terrance G., The Tools of Biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1977.

18 Sela, Michael, Science 166: (1969). 54. Arnon, R., Elchanan, M., Sela, M. ja Anfinsen, C.B., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 68: 1450 (1971). 55. Sela, M., Adv. Immun. 5: (1966). 56. Sela. M., Arnon, R., ja Chaitchik, S., US-patentti 4,075,194, Cohen. S.N., ja Boyer, H.W., US-patentti 4,237,224, Lerner, T.A., Sutcliffe, J.G. ja Shinnick, T.M. (1981) Cell 23: Wilson, I.A., Skehel. J.J. ja Wilev, D.C. (1981), Nature 289: Sutcliffe. J.G., Shinnick, T.M., Green, N., Liu, F-T, Niman, H.L., ja Lerner, R.A. (1980), Nature 287: Vuoteen 1970 mennessä kykenivät Marglin ja Merrifield ilmoittamaan, että "Kykymme syntetisoida keskikokoisia peptideitä on nyt hyvin osoitettu." Chemical Synthesis of Peptides and Proteins. A. Marglin ja R.B, Merrifield, Ann. Rev. Biochem. 39: , sivulla 862 (1970)). Merrifield et al synteesiä käytettiin osoittamaan oheisen keksinnön käytännöllisyyspuoli. Synteesitekniikka sinänsä ei kuitenkaan ole kriittinen. DNA-kartoitus, genomien yleinen karakterisointi ja proteiinin aminohapposekvenssin ennustaminen geneettisestä koodista ovat kaikki hyvin vakiintuneita tekniikoita. Oheisen keksinnön toistamiseksi valittiin yhdeksi välittäjäksi hyvin tutkittu virus, jotta voitaisiin välttää tulosten mahdolliset moniselitteisyydet. Kuitenkin on ilmeistä, että tämä valinta ei vähäisessäkään määrin ole rajoittava ja että keksintöä voidaan yleisesti soveltaa mihin tahansa systeemiin, jossa halutaan valmistaa rokote suojaamaan miltä tahansa sellaiselta proteiinipitoiselta antigeenilta, joka sisältää

19 peptidin, joka on antigeenin spesifinen antigeenideterminantti tai sisältää sellaisen. Mielenkiinnon kohteena oleva antigeeni voi siten olla peräisin viruksesta, bakteerista tai somaattisten solujen palasista edellyttäen, että spesifinen antigeenideterminanttipeptidi immunologisesti karakterisoi antigeenin. Tekniikat ja materiaalit, joilla antigeenideterminantit sidotaan kantajiin, ovat yleisesti tunnettuja eikä tähän yksittäiseen vaiheeseen sinänsä sisälly mitään erityistä uutuutta. Keksintö on pikemminkin monospesifisen antigeenin luominen synteettisestä spesifisestä antigeenideterminanttipeptidistä ja kantajasta niin, että saadaan rokote, jolla vältetään alalla aikaisemmin esiintyneet ongelmat ja rajoitukset. Keksinnöllisen menetelmän aikana suoritetaan useita vaiheita ja toimenpiteitä, joiden avulla erotetaan eri materiaalit ja reagenssit, tunnistetaan komponentit ja osoitetaan, että halutut reaktiot ja tulokset ovat tapahtuneet. Yleiskäyttöön sopivia tekniikoita on kuvattu standarditeksteissä ja tutkielmissa. Mainittakoon esimerkiksi seuraavat viitteet: METHODS IN ENZYMOLOGY, supra; METHODS IN IMMUNOLOGY AND IMMUNOCHEMISTRY, supra; HANDBOOK OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, supra; Dyson, Robert D., "Cell biology - A Molecular Approach", 2. painos, Allyn ja Bacon, Boston (1978); Pelczar, Michael J., Jr., Reid, Roger D., Chan, E.C.S., "Microbioloqy", 4. painos. McGraw-Hill (1977); Bohinski, R.C., "Modern Concepts in Biochemistry", 2. painos, Allyn ja Bacon, Boston (1976). Ilman mitään merkittävää muutosta on käytetty julkaistuja erityismenetelmiä (viiteet 1-20, 21-30, 32, 35-43). Keksinnön menetelmät Keksinnön mukaisten menetelmien vaiheet, joita voidaan soveltaa mihin tahansa tiettyyn keksinnön hyödyntämiseen, riippuvat

20 siitä, mitä tiedetään mielenkiinnon kohteena olevasta antigeenilajista ja sen saatavuudesta. Menetelmiä on tarkoituksenmukaista tarkastella vaiheittain. I. Antigeenideterminantin karakterisointi ja tunnistaminen Jos antigeenideterminantti tunnetaan ja peptidiketjun aminohapposekvenssi, joka muodostaa spesifisen antigeenideterminantin tai sisältää sen, on tunnettu, niin välittömästi voitaisiin valmistaa synteettinen peptidi, joka immunologisesti on toisinto mielenkiinnon kohteena olevan antigeenin spesifisestä antigeenideterminantista. Tämä lähestymistapa voi tulla tulevaisuudessa mielenkiintoisemmaksi, mutta tällä hetkellä on tavallisesti tunnistettava peptidi, joka on determinantti tai sisältää sen ja määritettävä peptidin aminohappojärjestys. Aminohappojärjestys voidaan määrittää suoraan tai epäsuorasti DNA-kartoittamalla genomi, joka ohjaa mielenkiintoisen peptidiosan muodostumista. Tässä keksinnössä käytetyt menetelmät ovat tunnettuja teoreettiselta kannalta ja mielenkiintoisen peptidiosan muodostumista ohjaavan genomin DNA-kartoitus on niin hyvin määritelty, että siitä voi nyt tulla käytännön työkalu. Aminohappojärjestyksen määrittäminen suoraan proteiinista on niin työläs ja epävarma menetelmä, että sillä on vain vähän akateemista arvoa ja että sillä ei käytännöllisesti katsoen ole mitään käytännöllistä arvoa tällä hetkellä. Vaikkakin aminohapposekvenssin suora määrittäminen peptidiproteiineista voi jonakin päivänä tulla käytännön työkaluksi, tällä hetkellä käytettävissä olevat tavat eivät ole sellaisia, että tätä menetelmää voitaisiin suositella valmistustoimenpiteisiin tai synteettisten peptidispesifisten antigeenideterminanttien syntetisoimiseen. Keksinnön lähtökohtana on loppujen lopuksi genomi, joka määrittää peptidiosan sen aminohapposekvenssin, joka sisältää spesifiset antigeenideterminanttialueet.

21 Kun aminohappojärjestys on tunnettu tai ennustettu, peptidi syntetisoidaan Merrifield'in et al tekniikalla tai millä tahansa muulla tekniikalla, joka voi olla käytettävissä tai tulla sellaiseksi. Abstraktisssa mielessä voitaisiin peptidisynteesistä edetä suoraan rokotteeseen, mutta varovaisuus määrää ainakin nykyisellä tiedontasolla, että näin syntetisoidun peptidin on oltava ristiriidatta sama kuin mielenkiinnon kohteena oleva antigeenin spesifinen antigeenideterminantti tai ainakin sen kanssa immunologisesti ekvivalentti. Tämä todistus tehdään kemiallisen ja fysikaalisen karakterisoinnin kautta ja lopulta saamalla aikaan synteettisen determinantin vasta-aineiden ja luonnon antigeenin välinen immuunireaktio. Tässä karakterisoinnissa käytetään yleisesti tunnettuja menetelmiä, joilla määritetään molekyylipaino, varaus, sitomisaffiniteetti jne. Näitä karakterisointimenetelmiä on yleisesti kuvattu julkaisuissa: "Modern Concepts in Biochemistry" supra. kappale 2 otsikolla "Methods of Biochemistry" ja "Cell Biology", supra, liite "Tools of the Cell Biologist". Näissä on myös mainittu menetelmien ja tekniikoiden täydelliset kuvaukset. Radioimmunomääritysmenetelmiä käytetään laajalti, ja niitä on kuvannut Hunter. W.M. "Preparation and Assessment of Radioactive Tracers", British Medical Bulletin, 30: Jäljempänä on annettu esimerkkejä näistä karakterisoinneista. II. Antigeenin valmistaminen Sen jälkeen, kun käytettävissä on synteettinen peptidi, jonka on osoitettu olevan mielenkiinnon kohteena oleva antigeenin spesifinen antigeenideterminantti, niin tunnetuilla sitomistekniikoilla sidotaan determinantti kantajaan antigeeniksi tilanteissa, joissa tällainen kantaja tarvitaan. Tämä vaihe voidaan luonnollisesti suorittaa pienessä mitassa silloin, kun osoitetaan peptidin immunologinen identiteetti antigeenideterminantille. Esimerkiksi, kun keksintö ensin todistettiin

22 laboratoriossamme, Dr. Fu-Tong Liu auttoi kiinnittämään valmistamamme synteettisen proteiinin tunnettuun KLH-kantajaan käyttämällä julkaistuja materiaaleja ja menetelmiä. (Liu, Fu-Tong et al, "New Procedures for Preparation and Isolation of Coniugated of Proteins and a Synthetic Copolymer of D-amino cids an.d Immunochemical Characterization of such Conjugates", Biochemistry 18: (1979). Kantajan valinta riippuu enemmän antigeenin lopullisesta aiotusta käyttötarkoituksesta kuin antigeenin determinantista perustuen kriteereihin, jotka eivät erityisesti liity oheiseen keksintöön. Esimerkiksi, jos valmistetta tullaan käyttämään eläimissä, valitaan kantaja, joka ei aiheuta tässä eläimessä kiusallista reaktiota. Jos valmistetta on tarkoitus käyttää ihmisessä, niin tärkeimmät seikat koskevat kantajan ja/tai saadun antigeenin immunokemikaalisten tai muiden sivureaktioiden puutetta, turvallisuutta ja tehokkuutta - samat näkökohdat, jotka koskevat kaikkia ihmiskäyttöön aiottuja valmisteita. Käytännössä on tarkoitus, että oheista keksintöä sovelletaan ensin laajasti eläimissä, esimerkiksi lemmikkieläimissä ja maatilaeläimissä. III. Immuunireaktio-vasta-aineen valmistus Erittäin usein on toivottavaa määrittää, onko mukana jotain tiettyä antigeeniä, esimerkiksi jonkin tietyn taudin diagnoosin apukeinona. Koska synteettinen antigeeni on monospesifinen mielenkiinnon kohteena olevalle yhdelle ainoalle spesifiselle antigeenideterminantille, myös antigeenin vasta-aineet ovat monospesifisiä mielenkiintoisen antigeenin suhteen. Aina ei voida täydellistä monospesifisyyttä toteuttaa, mutta ristireaktio antigeenin muille antigeeniosille vältetään, koska vasta-aineen kautta on mandollista vain yksi immuunireaktio. Vasta-aineet otetaan talteen ja valmistetaan millä tahansa tavanomaisella menetelmällä, joita käytetään diagnostisissa

23 testeissä. Esimerkiksi on tavallista, että vasta-aine leimataan tunnistamista ja kvantitatiivista määritystä varten. Immunomäärityksissä käytetään yleisesti radioleimausta esimerkiksi Greenwood'in menetelmällä (kts. Hunter, Br. Med. Bull. 30:18 (1974)) ja leimaamista fluoresoivalla värillä. IV. Esimerkkimenetelmä - antiqeenideterminantti on tuntematon Yhteenveto: Replikoitumiskykyisten hiirten leukemiavirusten, kuten Moloney-, Rauscher-, Friend- ja AKV-virusten hyväksyttyyn geneettiseen rakenteeseen sisältyy kolme geeniä. Nämä geenit, qaq. pol, ja env ovat sijoittuneet vastaavassa järjestyksessä pitkin yksisäikeistä RNA-genomia. Ne jäljentyvät integroidusta kaksisäikeisestä DNA-proviruksesta. Näiden kolmen geenin proteiinituotteet ymmärretään huomattavan yksityiskohtaisesti. Gaq-geeni koodaa noin 65 kilodaltonin polyproteiinia, joka proteolyyttisesti käsitellään 15, 12, 30 ja 10 kilodaltonin, amino-karboksi-päätteisiksi proteiineiksi. Näitä proteiineja on virionin ytimessä ja yksi näistä, p30, on yhdistetty virustropismiin. Toinen geeni, pol, ilmentyy gag-geenin näennäisenä jatkeena siten, että havaitaan noin 180 kilodaltonin polyproteiini, joka sisältää sekä qag- että pol-komponentit. Polyproteiini prosessoituu 70 kilodaltonin proteiiniksi, joka on käänteistranskriptaasi. Tämä entsyymi vastaa infektoivan viruksen yksisäikeisen RNA-genomin kopioimisesta kaksisäikeiseksi RNArakenteeksi, joka voi integroitua isäntäeläimen DNA:an. Kolmas geeni, env, koodaa polyproteiinin, joka glykosyloidaan ja käsitellään komponenteiksi gp70 ja pl5e. Gp70 on kuoren pääkomponentti ja sen mukaan määräytyy viruksen isäntäalue. Sen havaitaan joskus kytkeytyneen disulfidin kautta pl5e-komponenttiin, joka on hydrofobinen proteiini, joka voi ankkuroida gp70-komponentin viruksen membraaneihin ja solumembraaneihin. Näiden kolmen geenin ilmentymisestä vastaavia lähetti-rna-molekyylejä on kuvattu.

24 Aloitimme tutkimuksemme Moloney Murine Leukemia-viruksen (Mo-MuLV) 3'-päästä, koska olimme erityisen kiinnostuneita envgeenistä, jonka uskottiin olevan kaikkein 3' läheisin geeni. Tällöin löysimme uuden geneettisen koodialueen, joka sijaitsee env.-geenin 3'-puolella. Alustavasti nimitimme tämän R-alueeksi, koska se on koodialue, joka genomissa on kaikkein kauimpana oikealla. Olemme myös kemiallisesti syntetisoineet osan R-proteiinista, muodostaneet vasta-aineita synteettiselle peptidille ja löytäneet infektoiduissa soluissa immunologisesti ristireaktiivisen materiaalin. DNA-sekvenssi: Kuviossa 1 on kuvattu Mo-MuLV-proviruksen 3'-pään nukleotidisekvenssi nukleotidisen plus-säikeen sekvenssi, joka oli 3'-LTR- ja karboksipäisellä viruksen koodausalueella, ratkaistiin 1108 emäsparin pituisesta cdna-kloonista ja sitä jatkettiin hieman sekventoimalla infektoivasta kloonista. Nukleotidijärjestyksen päällä on esitetty DNA:sta tulkittu proteiinisekvenssi. Ensimmäiset pääteasemassa sijaitsevaa 34 aminotähdettä määritettiin Copeland'in ja Oroszlan'in mukaan, ja asemat vastaavat meidän sekvessiämme. Asemassa 103 sijaitsevan aminohapon (val) jälkeen oleva nuoli tarkoittaa pl5e-komponentin karboksipäätettä. Muu osa aminohapposekvenssistä kuuluu R-proteiiniin. Numeroidut oligonukleotidit (25, 42, 57 ja 98B) esittävät niitä oligonukleotideja, jotka vastaavat AKV-virusta ja jotka on esitetty yksityiskohtaisesti kuviossa 5. R-koodialueen jälkeinen alleviivattu alue on plus-säikeisen DNA-synteesin alkukohta. Alueet, joista on käytetty merkintöjä IRL ja IRR, ovat pääteasemassa sijaitsevia invertoituja toistuvia kohtia, joiden välissä LTR:t ovat. LTR:n sisällä on 17 emäksen pitkä palindrooma (alleviivattu) ja 3 suoraa toistuvaa kohtaa (DR 1, 2 ja 3), jotka ovat juuri ennen virusjäljennöksen 5'-pään Hogness-box promoottoria (p). Edempänä molekyyliä sijaitsee jäljennöksen 3'-pään poly A additiosignaali.

25 Olemme myös sekvensoineet tämän täysipituisen viruskloonialueen, jonka transfektio-kokeilla voidaan osoittaa sisältävän kaikki biologisesti aktiiviset Mo-MuLV-koodisekvenssit. Tämä uusi DNA-sekvenssi vastaa alkuperäistä lukuunottamatta kuvattuja vähäpätöisiä eroja. Uskomme näiden erojen merkitsevän joko biologissti aktiivisten genomien populaatiossa tapahtuvaa muuttuvuutta tai artifakteja, jotka johtuvat sen käänteistranskriptaasi-reaktion tunnetusta pienestä epätarkkuudesta, joka muodosti alkuaan tutkimamme kloonin. Orientoitumista varten osoitamme useita tämän sekvenssin ominaisuuksia, jotka ovat tärkeitä viruksen elinkierrolle. Kun kuljemme 5'-päästä 3'-päähän pitkin genomi-rna vastaavaa DNA-säiettä, näemme pl5e-komponentin pääosan koodialueen (karboksipäinen env-koodialue); toisen (positiivinen) säikeen DNA-replikoitumisen alkukohdan; invertoidut toistuvat kohdat IRL ja IRR, joiden välissä ovat ne virussekvenssien osat, jotka toisiintuvat integroidun proviruksen 5'- ja 3'-päissä (nk. LTR:t) ja jotka tekevät viruksen DNA:sta transposonin; ja poly A additiosignaalin ja poly A häntää edeltävät todennäköiset viimeiset 3'-nukleotidit. Merkittyjä ovat myös kohdat, jotka ovat aktiivisia LTR:n 5'-kopiossa, nimittäin genomi-ilmentymän promoottori ja ensimmäinen jäljennetty emäs sekä hieman ennen Hogness box-promoottoria sijaitseva sekvenssi, jossa on kolme suoraa toistuvaa kohtaa, joiden sekvenssi on 7 emäksen pituinen. Nämä toistokohdat voivat (väite perustuu sijaintiin) liittyä jäljentymisen säätelyyn. Pääteasemassa sijaitsevassa, 515 emäksen pituisessa toistokohdassa havaitaan myös 17 emäksen sekvenssi, joka muodostaa itsenäisen invertoidun toistokohdan (palindrooma), mutta jonka tehtävää (jos sellainen on) ei tunneta. DNA-sekvenssin ennustama uusi proteiini: Löytämämme uusi geenialue voidaan parhaiten ymmärtää vertaa

26 maila siihen, jonka aikaisemmin uskottiin olevan proviruksen kauimpana oikealla sijaitseva geeni-virusproteiinin pl5e koodialue. pl5e-komponentin aminopääte voidaan tarkalleen paikallistaa siitä päällekkäisyydestä, joka on DNA-sekvenssimme ennustaman proteiinisekvenssin ja muiden saaman proteiinisekvenssin välillä. pl5e-komponentin karboksipääte määräytyy kohtaan 103 kolmea tietä. Copeland ja Oroszlan määrittivät pl5e-komponentin kanden C-päätteisen aminohappotähteen olevan leu-val. Tällaisen parin löydämme 103-asemassa pl5e aminopäätteistä. pl5ekomponetin ennustettu aminohappokoostumus, joka saadaan sijoittamalla karboksipääte valiiniin tässä kohden, vastaa erinomaisesti havaittua koostumusta. SDS-geeleillä määritetty pl5ekomponentin näennäinen molekyylikoko on lisäksi noin 15 kilodaltonia. Tämä kokoarvio sopii yhteen 103 tähteisen hydrofobisen proteiinin liikkuvuuden kanssa. Yllättäen emme ole asemassa 104 löytäneet translationaalista päätekodonia. Sen sijaan avoin translationaalinen lukurunko ulottuu vielä 92 triplettiä ennen pysäytysmerkkiä. Aminohappokoostumus, joka saadaan ottamalla nämä 92 triplettiä mukaan, ei lainkaan sovi pl5e-komponentin koostumukseen. Tämän johdosta päättelemme, että primäärinen env-geeniproteiinituote sisältää itse asiassa kolme peptidiä: gp70, pl5e ja tämä juuri identifioitu proteiini. R (asemat kuviossa 1). Tästä syystä etsimme R-proteiinia. R-proteiinin kemiallinen synteesi ja sen löytäminen infektoiduissa soluissa: Solid state-menetelmillä syntetisoimme useita ennustetun Mo-MuLV-R-proteiinin peptidejä ja muodostimme näille synteet- : tisille peptideille vasta-aineita. Tarkemmin sanoen C-päätetähdettä (LTQQFHQLKPIECEP) kiinnitettiin KLH-kantajamolekyyliin ja injisoitiin 6 kaniinin ja 4 hiireen. Seerumeista

27 määritettiin niiden kyky saostaa immunologisesti 36-tähteinen synteettinen substraatti, jossa on 125 -tyrosiinin ( 125 -YILNRLVQFVKDRISVVQALVLTQQFHQLKPIECEP) edeltämä R-proteiini, joka sisältää 35 CC-päätetähdettä. Kaikkien immunisoitujen kaniinien ja hiirten seerumeilla oli positiivinen kertainen vaste normaaliin seerumiin verrattuna, kuten on esitetty taulukossa 1. TAULUKKO 1 Lukema (0,1 min.) saos- Immunisoin- tetulla amino- Eläin nro titapa happo-polypeptidillä Normaali kaniininseerumi rb rb rb A A B rb veri vaihdettu myöhemmin rb B rb veri vaihdettu myöhemmin rb C rb veri vaihdettu myöhemmin rb C rb veri vaihdettu myöhemmin rb D 599 rb D 566

28 TAULUKKO 1 (jatk.) Tapa A: päivä 1-1 mg/kg Freund'in apuaineessa (Freunds complete adjuvant) subkutaanisti 4 jalkapohjaan ja ja pitkin selkää CT15-KLH päivä 7 - injektiot toistettiin - Freund'in apuaine päivä 14 - injektiot toistettiin - Freund'in apuaine päivä 21 - veri valutettiin Tapa B: päivä mg/kaniini Freund'in apuaineessa subkutaanisti (kaniinit painoivat noin 2,5-3 kg, joten tämä merkitsti huomattavaa annostuksen pienentämistä) CT14-KLH päivä 7-50 mg/kaniini Freund'in epätäydellisessa apuaineessa subkutaanisti päivä mg/kaniini alunassa (4 mg/kaniini) veri vuodatettiin päivinä 21 ja 28 tehostusruiske CT15-KLH-kantajalla alunassa, 50 mg/kaniini, veri vuodatettiin 7 päivän kuluttua tehostusruiskeesta Tapa C: Sama kuin tapa B paisti, että alkuannos pienennettiin 50 mg/kaniini myös myöhemmät annokset olivat 50 mg/kaniini CT15-KLH Tapa D: Sama kuin tapa C paitsi, että käytettiin CT15-biotiiniavidiinia Sen jälkeen yritimme löytää R-proteiinin MuLV-viruksia muodostavien SCRF 60A solujen, jotka oli leimattu kaksituntisella 35 S-metioniinipulssilla, Lysaateista (R-proteiini ei sisällä lainkaan tyrosiinia, eikä sen siten odotettu leimautuvan jodilla). Kuviossa 2 on kuvattu logaritmifaasissa olevia SCRF 60A soluja, jotka muodostavat Mo-MuLV-viruksista erottamattomia viruksia (16) ja joita oli kasvatettu Eagle'n MEM-alustalla, joka

29 sisälsi 10 % vasikansikiöseerumia. Solut leimattiin 37 C:ssa 2 tunnin aikana konsentraatiossa 2 x 10 6 solua/ml 35 S-metioniinilla (940 ci/millimooli, 100uCi/m1) Hank'in suolaliuoksessa (Hank's Balanced Saltn), joka sisälsi 10 % Eagle'n MEMkasvatusalustaa. Solut jäädytettiin, pestiin 0,15M natriumkloridilla. 10mM natriumfosfaatilla (ph 7,5), uutettiin 20 minuuttia OOC:ssa seuraavilla: 0,15M NaC1, 10mM natriumfosfaatti (ph 7,5), 1 % NP40, 0,5 % natriumdeoksikolaatti. 0,1 % SDS, 2 % Trasylol, minkä jälkeen solut käsiteltiin ultraäänellä ja sentrifugoitiin 5 minuuttia voimalla x g. Lysaatti esikirkastettiin saattamalla se reagoimaan 20 p1 kanssa normaalia kaniiniseerumia ja 20 p1 kanssa normaalia vuohenseerumia 30 minuutin ajan OOC:ssa, minkä jälkeen lisättiin 30 minuutiksi formaliinilla kiinnitettyä Staph A ja sentrifugoitiin 15 minuuttia x g voimalla. Lysaatista otetut osat saatettiin reagoimaan 0 C:ssa 1 tunnin ajan 5 pl kanssa seuraavia aineita: A) normaali kaniininseerumi, B) kaniinin anti-synteettinen R pentadekapeptidi-seerumi, C) vuohen anti-gp70-seerumi, D) vuohen anti-p30-seerumi tai E) normaali vuohenseerumi tai F) anti-gp70 hybridoma (nro R1-16G07, viite 17)-kasvatusalusta. Kompleksit otettiin talteen Staph A:lla ja pestiin 2 kertaa 500mM litiumkloridilla. 100mM Tris (ph 8,5) puskurilla ja liuotettiin täyttöpuskuriin, josta Staph A oli poistettu, ja täytettiin 11 % SDS-polyakryyliamidigeelille. Geeliä kostutettiin ENHANCE (NEN)-geelillä 90 minuuttia, vedellä 60 minuuttia, kuivattiin ja laitettiin kalvolle. Kuviossa esitetyt vyöhykkeet on aikaisemmin tunnistettu tässä laboratoriossa ja muiden toimesta. Anti-R-seerumi valmistettiin seuraavasti. Karboksipäätteinen R pentadekapeptidi (LTQQFHQLKPIECEP) konjugoitiin (KLH)-kantajaan (keyhold limpet haemocyanin) kysteiini-sulfhydryylin kautta. 63 gl 15 mg/ml m-malimidobentsoyyli-n-hydroksisukkin - imidi - esteriä N,N'-dimetyyliformamidissa lisättiin tipottain ja

30 samalla sekoittaen KLH-kantajaan (10 mg/ml) 10mM kaliumfosfaatissa (ph 7,0). Seosta sekoitettiin 30 minuuttia, minkä jälkeen se suodatettiin ja vietiin Sephadex G-25 pylvääseen (0,1M fosfaatti, ph 6,0). Aktivoidun proteiinin (2,3 ml) kanssa sekoitettiin 0,1 ml R pentadekapeptidiä (10 mg/ml 0,1M kaliumfosfaatissa, ph 7,3, 5mM EDTA) ja liuos säädettiin ph-arvoon 6,5, sekoitettiin 4 tuntia huoneen lämpötilassa ja kromatografoitiin Sephadex G-100 hartsilla (0,1M ammonium-bikarbonaatti, ph 9,5). Konjugoitu proteiini otettiin talteen ja käytettiin suoraan immunisoinnissa. Kuten kuviosta 2 nähdään, anti-r-seerumi havaitsee infektoiduissa soluissa proteiinin, jonka näennäinen molekyylipaino on noin 80 kilodaltonia. Kaikki kaniinin ja hiiren yksittäiset immuuniseerumit havaitsevat molekyylikooltaan samanlaiset proteiinit. Koska nukleotidisekvenssit osoittivat, että pl5e ja R olivat samassa lukurungossa, odotimme tämän molekyylin olevan itse asiassa env-prekursori. Gp70-komponentin, mukaanlukien anti-gp70 hybridoman vasta-aineet havaitsevat molekyylin, jolla on sama näennäinen molekyylikoko kuin anti-r:llä saostetulla molekyylillä, mikä vahvistaa, että todellakin on kysymyksessä env-prekursori. Sen mandollisuuden eliminoimiseksi, että kyseessä oli kaksi eri molekyyliä, joiden molekyylikoot sattumalta vastasivat toisiaan, teimme kaksi koetta. Ensiksi, kun lysaatit esikirkastetaan anti-r-seerumilla, poistetaan antigp70:n 80 kilodaltonin kohde. Sen sijaan lysaatin kirkastaminen anti-gp70-seerumilla poistaa R-determinantit. Toiseksi, kanden 80 kilodaltonin molekyylin, jotka on saostettu anti-r:llä ja anti-gp70:11ä, proteolyyttinen peptidien vertaaminen osoittaa näiden olevan identtisiä. Olemme näin identifioineet 80 kilodaltonin vyöhykkeen täydelliseksi env-geeni-polyproteiinituotteeksi, joka sisältää gp70:n. pl5e:n (kuten muut tutkijat ovat osoittaneet) ja R-determinantit, jolloin saadaan kuviossa 3 ehdotettu rakenne.