Grampositiivisten bakteerien resistenssimekanismien toteaminen EUCAST suositus Laura Lindholm THL, Mikrobilääkeresistenssiyksikkö 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 1
EUCAST suositus resistenssimekanismien toteamiseksi Konsultaatiokierros (EUCAST consultation contact list, website, ECDC focal point contacts) http://www.eucast.org/eucast_news/ 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 2
EUCAST suositus kliinisesti ja/tai epidemiologisesti merkittävien resistenssimekanismien toteamiseksi 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 3
Grampositiivisten bakteerien resistenssimekanismien toteaminen MRSA (metisilliiniresistentti Staphylococcus aureus) Glykopeptidiherkkyydeltään alentunut Staphylococcus aureus GRSA GISA hgisa VRE (vankomysiinille resistentti Enterococcus faecium ja Enterococcus faecalis) Penisilliiniherkkyydeltään alentunut Streptococcus pneumoniae 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 4
5. Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 5.1 Definition 5.2 Clinical and/or epidemiological importance 5.3 Mechanisms of resistance 5.4 Recommended methods for detection of resistance 5.5 References The guidelines have been developed by conducting systematic literature searches, and recommendations are based on multi-centre studies or multiple single centre studies. 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 5
Metisilliiniresistentti Staphylococcus aureus (MRSA) Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Määritelmä S. aureus isolaatit, joilla hankittu/ylimääräinen penisilliiniä sitova proteiini (PBP2a tai vastikään löydetty PBP2c), jolla matala affiniteetti -laktaamiantibiootteja kohtaan S. aureus isolates with an auxiliary penicillin-binding protein (PBP2a or the recently discovered PBP2c) for -lactam agents, except for the novel class of cephalosporins having anti-mrsa activity, have low affinity. Kliininen ja/epidemiologinen merkitsevyys MRSA aiheutta merkittävää sairastavuutta ja kuolleisuuden maailmanlaajuisesti MRSA bakteremiassa kuolleisuus on kaksinkertainen verrattuna herkkään S.aureukseen MRSA infektiot endeemisiä sekä sairaaloissa että avohoidossa kaikkialla maailmassa 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 6
Suositellut menetelmät S. aureuksen metisilliiniresistenssin toteamiseksi Fenotyyppiset menetelmät: MIC -määritys Kiekkoherkkyysmääritys PBP2a latex agglutinaatiotestaus Genotyyppinen menetelmä: meca/c geenin osoitus PCR -menetelmällä Methicillin/oxacillin resistance can be detected both phenotypically by MIC determination, disk diffusion tests or latex agglutination to detect PBP2a, and genotypically using PCR. 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 7
MIC määritys ja kiekkomenetelmä Liemilaimennosmenetelmä (Broth microdilution) ISO 20776-1 Standardin mukainen metodologia Kannat joiden MIC > 4mg/L tulee raportoida metisilliinille resistenteiksi Kiekkomenetelmä (Disk diffusion) EUCAST kiekkoherkkyysmenetelmä: http://www.eucast.org/antimicrobial_susceptibility_testing/disk_diffusion_methodology/ Kannat joiden kefoksitiinin (30 g) estorengas < 22mm tulee raportoida metisilliinille resistenteiksi 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 8
MIC määritys ja kiekkomenetelmä Kefoksitiini on suositeltavin antibiootti kiekkotestaukseen, koska se on EUCAST:in mukaan erittäin herkkä ja spesifinen meca/mecc välitteisen metisilliiniresistenssin markkeri Oksasilliinin käytöstä tulisi luopua kiekkotestauksessa -> oksasilliinille ei ole enää tulkintarajoja EUCAST:in Breakpoint taulukossa http://www.eucast.org/clinical_breakpoints Kannat, joiden oksasilliini MIC kohonnut (MIC>2mg/L), mutta jotka herkkiä kefoksitiinilla testattaessa (estorenkaan halkaisija 22mm, MIC 4) erittäin harvinaisia Mikäli oksasilliini- ja kefoksitiini testien tuloksissa ristiriitaa, EUCAST suosittelee meca/mecc geenien genotyyppistä testausta PCR:llä tai meca geenituotteen (PBP2a) testausta latex agglutinaatiotestillä 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 9
Tulosten tulkinta jos oksasilliini ja kefoksitiini tulokset eroavat * * * Suositellaan meca/mecc geenien genotyyppistä testausta PCR:llä tai meca geenituotteen (PBP2a) testausta latex agglutinaatiotestillä 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 10
Resistenssin toteaminen genotyyppisesti tai latex agglutinaatiomenetelmillä meca -geenin toteaminen PCR:llä ja PBP2a proteiinin toteaminen latex agglutinaatiotestillä on mahdollista kaupallisilla tai in-house menetelmillä mecc geenin tai PBP2c proteiinin toteaminen ei vielä tällä hetkellä ole mahdollista kaupallisilla menetelmillä Alukkeet sekä menetelmät mecc geenin toteamiseksi on julkaistu: Stegger M, et al. Clin Microbiol Infect. 2012; 4:395-400. Pichon B, J Antimicrob Chemother. 2012; 67:2338-41. 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 11
Glykopeptidiherkkyydeltään alentunut Staphylococcus aureus Glycopeptide non-susceptible Staphylococcus aureus EUCAST:in kliininen MIC breakpoint S. aureuksen vankomysiini resistenssille on 2mg/L GRSA (vana mediated), GISA / hgisa (non-vana mediated) Määritelmä GRSA: Glycopeptide Resistant S. aureus S. aureus isolaatit, joilla korkea-asteinen vankomysiini resistenssi (MIC >8 mg/l). Resistenssi on eksogeenista, enterokokeilta siirtyneen vana geenin välittämää 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 12
Glykopeptidiherkkyydeltään alentunut Staphylococcus aureus GISA: Glycopeptide Intermediate S. aureus S. aureus isolaatit, joilla malala-asteinen vankomysiini resistenssi (MIC 4-8 mg/l). hgisa: Heterogeneous Glycopeptide Intermediate S. aureus. S. aureus isolaatit, jotka herkkiä vankomysiinille (MIC 2mg/L), mutta joiden populaatiosta pienellä osalla (1 10 6 soluista) MIC >2 mg/l PAP -analyysin perusteella (population analysis profile). Resistenssi on endogeenista ts. seurausta kromosomissa tapahtuneista mutaatioista, jotka saavat aikaan soluseinän paksuuntumisen (vankomysiinin diffuusio aktiiviseen kohtaan estyy / glykopeptidien sitoutumiskohtien hyperproduktio -> vankomysiinin pääsy aktiiviseen kohtaan hidastuu) 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 13
Kliininen ja/epidemiologinen merkitsevyys Glykopeptidiherkkyydeltään alentuneiden S.aureus isolaattien prevalenssista Euroopassa ei ole tarkkaa tietoa Yksittäisten laitosten raporttien perusteella on arvioitu, että hgisa:n prevalenssi olisi 2% ja GISA:n alle 0,1% (Clin Microbiol Rev 2010;1:99-139) GRSA has not yet been reported in Europe and is currently extremely rare worldwide First case of infection with vancomycinresistant Staphylococcus aureus in Europe The Lancet, Volume 382, Issue 9888, Page 205, 20 July 2013 doi:10.1016/s0140-6736(13)61219-2 Lähes kaikki isolaatit, joilla kohonnut MIC (GISA) tai joilla resistenttejä subpopulaatioita (hgisa) ovat myös MRSA:ta 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 14
Suositellut menetelmät glykopeptidiherkkyydeltään alentuneen S. aureuksen havaitsemiseksi Kiekkomenetelmää ei voi käyttää hgisa:n tai GISA:n testaamiseen MIC-määritys Liemilaimennosmenetelmä (ISO 20776-1) Kultainen standardi Gradienttiliuskamenetelmä (E-testi) Tulos saattaa olla 0,5-1 laimennoksen verran korkeampi kuin liemilaimennosmenetelmällä Maljalaimennosmenetelmä MIC määritys tulisi tehdä aina jos potilasta, jolla vakava S.aureus infektio hoidetaan vankomysiinillä vankomysiiniresistenssin raja MIC > 2mg/L Jos MIC 2 mg/l, kanta tulee lähettää referenssilaboratorioon 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 15
The mechanism of hgisa is complex and detection relies on population analysis, which is cumbersome, requires special equipment and needs a high level of technicalexpertise. Methodology for detection of hgisa will be outlined, but for surveillance reporting is restricted to GISA, which is defined as isolates with an MIC >2mg/L. 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 16
Testejä hgisa:n seulomiseksi ja varmistamiseksi Wootton M, MacGowan AP, Walsh TR, Howe RA. A multicenter study evaluating the current strategies for isolating Staphylococcus aureus strains with reduced susceptibility to glycopeptides. J Clin Microbiol. 2007;45(2):329-32. hgisan testaus perusteltua valikoiduissa tapauksissa esim. jos epäillään hoidon epäonnistumista 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 17
Vankomysiinille resistentti Enterococcus faecium ja Enterococcus faecalis Vancomycin resistant Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Määritelmä Enterococcus faecium tai Enterococcus faecalis, jotka ovat resistenttejä vankomysiinille (VRE) (vankomysiini MIC >4 mg/l) Kliininen ja/epidemiologinen merkitsevyys VRE:n aiheuttamien infektioiden hoito vaikeaa (vähän hoitomahdollisuuksia), koska enterokokit luonnostaankin resistenttejä monille antibiooteille VRE leviää tehokkaasti sairaalaympäristössä, koska se on hyvin kestävä ja kolonisoi useita yksilöitä, joista vain muutamille kehittyy kuitenkin enterokokki -infektio 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 18
Resistenssimekanismi Kliinisesti merkityksellinen resistenssi on yleisimmin plasmidivälitteisten vana ja vanb ligaasien välittämää. Terminaalinen D-Ala D-Lac, glykopeptidin sitoutuminen peptidoglykaaniin heikkenee vana kannat ovat resistenttejä sekä vankomysiinille että teikoplaniinille, vanb kannat vain vankomysiinille E. casseliflavuksella ja E. gallinarumilla on kromosomissaan luonnostaan vanc geeni, joka saa aikaan matala-asteisen resistenssin (MIC 4-16mg/mL) Ei yleisesti katsota merkitykselliseksi infektiokontrollin näkökulmasta (ei siirtyvä) 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 19
Suositellut menetelmät E. faeciumin ja E. faecaliksen glykopeptidi resistenssin havaitsemiseksi/löytämiseksi MIC määritys Kiekkomenetelmä Breakpoint agar menetelmä Kaikissa kolmessa menetelmässä on tärkeää, että maljoja inkuboidaan 24h indusoituvan resistenssin havaitsemiseksi Kaikki menetemät detektoivat vana välitteisen resistenssin hyvin, vanb välitteinen resistenssin detektoiminen automaattilaitteistoilla on/on ollut haastavampaa Kiekkomenetelmä (5 g vanco) toimii hyvin, mikäli EUCAST menetelmää noudatetaan pikkutarkasti MIC ja kiekkomenetelmässä lajimäärityksen varmistaminen! MGP (methyl-alpha-d-glucopyranoside), liikkuvuus MALDI-TOF 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 20
MIC-määritys Liemilaimennos (ISO 20776-1) Gradientti MIC-määritys ( E-testi, valmistajan ohjeiden mukaisesti) Breakpoint agar BHI (Brain Heart Infusion) agar, jossa 6mg/l vankomysiiniä 1x10 5 1x10 6 cfu (10 l 0.5 McFarland suspensiota) 24h, 35±1ºC, lämpökaappi >1pesäke kasvua = positiivinen Genotyyppinen testaus Kaupallinen tai in-house vana ja vanb PCR THL rutiini multiplex: vana, vanb, vanc, E.faecium, E.faecalis, E.gallinarum, E.casseliflavus (tarvittaessa myös muita van geenejä) 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 21
Kiekkomenetelmä MH, McFarland 0.5, 5 g vankokiekkko, Air 35±1ºC, 24h Tarkastele maljoja valoa vasten Epämääräiset estorenkaan reunat (hiipuva kasvu) ja yksittäiset pesäkkeet renkaan sisällä ovat merkki mahdollisesta vankomysiiniresistenssistä. a) b) c) d) a) terävät estorenkaan reunat ja halkaisija 12mm. Raportoi S (herkkä) b-d) epämääräiset estorenkaan reunat ja / tai pesäkkeitä estorenkaan renkaan sisällä. Raportoi R (resistentti) vaikka estorengas olisi 12mm (varmista tulos MIC määrityksellä) 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 22
Penisilliiniherkkyydeltään alentunut Streptococcus pneumoniae Penicillin non-susceptible Streptococcus pneumoniae Määritelmä Str. pneumoniae isolaatit, joiden penisilliiniherkkyys on alentunut (MIC arvot korkeammat kuin villityypin isolaateilla ts. MIC > 0,06 mg/l) johtuen muuntuneista penisilliiniä sitovista proteiineista (PBPs), joilla on matalampi affiniteetti -laktaameja kohtaan Käytettäessä korkeampaa penisilliinin annostusta, kannat joiden betsyylipenisilliini MIC on välillä 0,12-2 mg/l katsotaan penisilliinille herkiksi (muissa infektioissa kuin meningiitissä) 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 23
Suositellut menetelmät penisilliiniherkkyydeltään alentuneen Streptococcus pneumoniaen havaitsemiseksi Alentunut penisiliiniherkkyys voidaan havaita fenotyyppisesti MIC- tai kiekkomenetelmillä Seulonta 1 g oksasilliinikiekolla, jos estorengas: 20mm raportoi herkkänä riippumatta kliinisestä indikaatiosta Oksasilliinille herkkä pneumokokki voidaan vastata herkkänä kaikille beetalaktaameille < 20mm bentsyylipenisilliini MIC tulee määrittää aina Oksasilliinille resistenttiä pneumokokkia ei saa vastata penisilliinille resistentiksi vaan herkkyys tulee varmistaa penisilliinille ja tarpeen mukaan muille beetalaktaameille erikseen MIC-määrityksellä 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 24
Muille -laktaamiantibiooteille kuin bentsyylipenisilliini, oksasilliini estorenkaan halkaisijaa voidaan käyttää herkkyyden ennustamiseen seuraavasti: 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 25
2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 26
Tulossa Syksyn 2013 aikana kysely FiRe-laboratorioillle Grampositiivisten bakteerien resistenssimekanismien toteamiseksi käytettävistä menetelmistä Toteutetaan todennäköisesti verkossa nettikyselynä Kansallinen suositus moniresistenttien bakteerien resistenssimekanismien toteamisesta pohjautuen EUCAST suositukseen 2.10.2013 Fire-päivä, syksy 2013 / Laura Lindholm 27