Utaretulehdusta aiheuttavien mikrobien eristäminen ja tunnistaminen

Transkriptio

1 Sivu/sivut 1 / 6 1 Menetelmä T. Honkanen-Buzalski and E. Seuna: Isolation and identification of pathogens from milk. Teoksessa The bovine udder and mastitis, 1995, Muunnos. 2 Poikkeamat viitemenetelmästä 2.1 Anaerobisia bakteereita ei tutkita ilman erityistä syytä. 2.2 Mykoplasmoja ei tutkita ilman erityistä syytä. Mykoplasmaa epäiltäessä näyte toimitetaan Eviran Kuopion toimipaikkaan. Näyte säilytetään ennen lähettämistä jääkaapissa. Jos näytteenotosta näytteen lähettämiseen kuluu yli 2 vrk, näytettä on säilytettävä -70 C (ei tavanomaisessa pakastuslämpötilassa). 2.3 Primaarimaljalle siirrostetaan -toksinen Staphylococcus aureus tarvittaessa. 3 Soveltuvuus Menetelmä soveltuu tavallisimpien utaretulehdusmikrobien eristämiseen maidosta. Menetelmällä voidaan tutkia myös muiden eläinten kuin lehmän maitoa. Tavallisimmat utaretulehdusnäytteestä eristetyt bakteerit ovat: koagulaasinegatiiviset stafylokokit (KNS), Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. uberis, Enterococcus spp.,lactococcus spp., Aerococcus viridans, Escherichia coli, Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa, Arcanobacterium pyogenes ja Corynebacterium bovis. Harvinaisempia aiheuttajia ovat esimerkiksi Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Corynebacterium ulcerans ja hiivat, hyvin harvinaisia esimerkiksi Serratia marcescens, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus ja Prototheca spp. On huomattava, että kaikki nämä voivat olla näytteessä myös kontaminantteina. 4 Analyysituloksen laadunvarmistus (Rasti ruutuun) Kansainvälisen menetelmäkokoelman menetelmä Laboratorioiden väliset vertailututkimukset Menetelmävertailut Vertailukantojen käyttö Siirrostetut näytteet Rinnakkaismääritykset Sokeakokeet Valvontakortit

2 Sivu/sivut 2 / 6 5 Määritelmä Utarekudos ja vedinontelo ovat normaalisti steriilejä lukuun ottamatta vedinkanavan ulkoaukkoa. Utaretulehdusta aiheuttavat mikrobit ovat yleensä aerobisia bakteereita, joissakin tapauksissa myös hiivoja, homeita ja levää. Tavallisimmin on kyse yhden mikrobilajin aiheuttamasta utareneljänneksen tulehduksesta. Ns. kesämastiitti on anaerobien ja aerobien bakteerien aiheuttama tulehdus. Kesämastiitissa eristetään aerobisesti kasvava Arcanobacterium pyogenes ja diagnoosi perustetaan tähän löydökseen, eikä anerobeja rutiinitutkimuksessa pyritä eristämään. Kesämastiitissa myös maidon ulkonäkömuutokset ja haju antavat selkeät viitteet ko. tulehduksesta. Eläimellä voi varsinaisten utaretulehdusta aiheuttavien mikrobien lisäksi yleisinfektion yhteydessä olla maidossa myös muita mikrobeja, mutta tällöin ei ole kyse varsinaisesta utaretulehduksesta vaan muuhun tulehdukseen liittyvästä utareen infektiosta. Utaretulehdustutkimus tehdään aseptisesti otetusta maitonäytteestä (näytteenottoohje: Näyte jäähdytetään heti näytteenoton jälkeen jääkaappilämpötilaan, ja säilytetään jäähdytettynä laboratorioon saakka. Näyte voidaan myös pakastaa, ja näin on tehtävä aina heti näytteenoton jälkeen, jos aika näytteenotosta tutkimuksen aloittamiseen ylittää 48 h. Näytteen mukaan liitetään tiedot kliinisistä oireista, mahdollisista lääkityksistä ja maitonäytteestä tehdystä tulehdusastetta mittaavasta kokeesta, yleensä CMT (Californian Mastitis Test). 6 Periaate Primaariviljelmä tehdään vähän eskuliinia sisältävälle veriagarille (mastiittiagar), johon voidaan siirrostaa -toksinen Staphylococcus aureus (käytetään apuna streptokokki- ja Corynebacterium ulcerans -diagnostiikassa). Mikrobien tunnistus perustuu pesäkemorfologiaan ja biokemiallisiin ja serologisiin testeihin. 7 Laitteet ja välineet 7.1 Mikrobiologinen perusvälineistö 7.2 UV-lamppu ,0 ± 1,0C lämpökaappi

3 Sivu/sivut 3 / 6 8 Elatusaineet ja reagenssit 8.1 Elatusaineet Luettelot sisältävät tavallisimmin käytetyt alustat, reagenssit ja testikitit Mastiittiagar Edwardsin agar Veriagar Penisilliiniagarit (0, 0,13 KY ja 1,03 KY) EMB-agar Tween80-agar % peptonivesi Hippuraattiliemi Inuliini Raffinoosi Sorbitoli ,9 % NaCl Lakmusmaito Urea-agar Liikkuvuus-putki 8.2 Reagenssit ja testikitit Gramvärjäysliuokset % vetyperoksidi Oksidaasitesti % rikkihappo Nitrocefin-kiekot Indolitesti Coagulase plasma Koagulaasi-pikatesti, esim. Slidex Staph-kit Streptococcal grouping kit, Oxoid Api Staph/Api 32 ID Staph Api Strep/ Api 32 ID Strep Api 20 E Api 20 NE Api Coryne

4 Sivu/sivut 4 / 6 9 Suoritus 9.1 Primaariviljely 9.2 Inkubointi Näytteen annetaan lämmetä huoneenlämpöön. Näyte sekoitetaan hyvin ennen primaariviljelyä. Primaariviljely tehdään neljään osaan jaetulle mastiittiagarille (maljan jakavaan ristikkoon voidaan vetää ß-toksinen S. aureus bakteeri). Kertakäyttösilmukka (10 l) kastetaan kerran maitonäytteeseen, ja maljan neljännekseen tehdään viivaviljelynä yhteensä 6-8 vetoa kääntäen silmukka kerran vetojen välillä (viivat jätetään 0,5 cm päähän S. aureus -ristikosta). 37,0C ± 1,0 C h ja h 9.2 Pesäkkeiden tarkastelu ja valinta varmistuskokeisiin Primaariviljelyn tarkastelun ja päätöksen jatkotutkimukseen tulevista pesäkkeistä tekee tehtävään koulutettu henkilö, eläinlääkäri tai alaan perehtynyt mikrobiologi. Maljan tarkastelussa kiinnitetään huomiota pesäkkeiden ulkonäköön ja lukumäärään. Jatkotutkimuksiin valitaan ne näytteet, joissa samaa mikrobilajia kasvaa vähintään viisi pesäkettä (vastaa 500 pmy/ml). Mikäli samankaltaisia pesäkkeitä on < 5, kyseessä ei yleensä ole utareinfektio vaan epäonnistuneesta vetimenpuhdistuksesta johtuva bakteerikasvusto tai lievä vedinkanavan infektio. Poikkeuksena on Streptococcus agalactiae, josta huomioidaan yksikin puhtaana kasvava pesäke. Koska utaretulehduksen yleensä aiheuttaa yksi mikrobilaji, on näytteenoton mahdolliset epäpuhtaudet (sekakasvu) tärkeää havaita tässä vaiheessa. Mikäli maljalla kasvaa useampaa kuin kahta bakteerilajia, on syytä epäillä sekakasvua. Jos näytteessä on sekakasvu, tutkimusta ei jatketa. Tällaisessa tapauksessa tulisi laboratorioon toimittaa uusi näyte. Primaariviljelmän varmennettavista pesäkkeistä tehdään puhdasviljelmät mastiitti- tai veriagarille, tarvittaessa lisäksi selektiivialustalle, kuten Edwards, EMB. Puhdasviljelmien teon jälkeen maljoja inkuboidaan vielä tuntia 37,0C ± 1,0C. Seuraavan päivän tarkastelussa kiinnitetään erityistä huomiota toisena inkubointivuorokautena tulleisiin pesäkkeisiin, ja puhdasviljellään ne tarvittaessa. Arcanobacterium pyogenes, Corynebacterium bovis ja jotkut hitaasti kasvavat streptokokit tulevat usein esiin vasta toisena kasvatusvuorokautena. Myös sekakasvu voi tulla esiin vasta toisen vuorokauden jälkeen. Inkubointia voidaan vielä jatkaa, esimerkiksi hiiva- ja Arcanobacterium pyogenes -infektioissa tämä voi olla tarpeen.

5 Sivu/sivut 5 / 6 10 Varmistuskokeet Varmistustestit tehdään aina puhdasviljelmästä. Perustesteinä tehdään gramvärjäys, katalaasi (grampositiiviset) ja oksidaasi (gramnegatiiviset). Yleisimmät varmistustestaukset on kuvattu työohjeessa LAB Käytetyistä testeistä on yksityiskohtaiset LAB-sarjan työohjeet (ohjeet tulostettavissa Mikrobit on tunnistettava sille tasolle, että tulosta voidaan hyödyntää myös infektiolähteen selvittämisessä ja utaretulehduksen ennaltaehkäisyssä. Ryhmä/lajitason tunnistus riittää seuraaville: koagulaasinegatiiviset stafylokokit, Klebsiella spp., Enterococcus spp., Lactococcus spp. Utaretulehdusnäytteitä tutkivan laboratorion on varmistuttava siitä, että laboratorion käyttämät varmistustestit soveltuvat utaretulehdusdiagnostiikkaan; humaani- tai elintarvike- ja vesidiagnostiikkaan kehitetyt varmistustestit eivät välttämättä anna oikeata tulosta eläintautipatogeenien kohdalla. 11 Tulokset Tulos ilmoitetaan eristetyn mikrobin nimenä/niminä. Bakteerien numeerisella määrällä ei sinänsä ole merkitystä, eikä sitä ilmoiteta. Mikäli mikrobikasvusto on tulkittu epäpuhtauksien aiheuttamaksi, tulokseksi ilmoitetaan "sekakasvu". Mikäli näytteestä ei eristetä utaretulehdusta aiheuttavia bakteereita, tulokseksi ilmoitetaan "ei spesifistä kasvua". Jos näytteestä on eristetty muu kuin utaretulehduspatogeeni, voidaan tällöin lisäksi mainita eristetyn mikrobin nimi. 12 Menetelmän validoinnin tulokset Eläintautibakteriologinen menetelmä, jolle ei käyttöönottovalidointia. 13 Mahdollisia virhelähteitä Sekakasvutapauksessa maljalla saattaa selvästi olla mastiittipatogeeneja, mutta ei voida varmasti sanoa, mistä ne ovat peräisin. Viljelytulos voi olla negatiivinen, vaikka utareneljännes olisi infektoitunut. Tähän on mm. seuraavia syitä: jollei kolimastiittitapauksessa näytettä ole otettu infektion alkuvaiheessa, bakteeriviljelyn tulos voi olla kielteinen. Jos eläin on saanut antibioottihoitoa vähän ennen näytteenottoa, viljelytulos on todennäköisesti negatiivinen. Mikrobin pitoisuus näytteessä on alle menetelmän toteamisrajan. Näytettä on säilytetty väärin, ja patogeeni on kuollut. Bakteeri ei kasva rutiinivijlelyalastalla / aerobiolosuhteissa. Utaretulehdusbakteereita erittyy tulehtuneesta neljänneksestä eri aikoina eri määriä.

6 Sivu/sivut 6 / 6 Jos näyte viljellään ohjetta pienemmälle agar-alueelle, maidon inhibitoriset aineet saattavat estää näytteessä olevien bakteereiden kasvun. Näytteen pitkäaikainen pakastus saattaa muuttaa näytteen mikrobiflooraa, lyhytaikaisen (6 viikkoa) pakastamisen ei ole todettu muuttavan sitä. 14 Viitteet Eläinlääkintä- ja elintarvikelaitoksen päätös 697/3/99 (Eläintautitutkimuksia tekevien laboratorioiden pätevyysvaatimukset). Honkanen-Buzalski, T. ja Seuna, E. (1993) Utaretulehdusmaidon mikrobiologinen diagnostiikka. Sivut kirjassa Utareen sairaudet 2. uudistettu painos. Toim. Sandholm, M., Honkanen-Buzalski, T., Kaartinen, L. ja Pyörälä, S. Gummerus Kirjapaino Oy, Jyväskylä. Honkanen-Buzalski, T. ja Seuna, E. (1995) Isolation and identification of pathogens from milk. Sivut kirjassa The bovine udder and mastitis. Toim. Sanholm, M., Honkanen-Buzalski, T., Kaartinen, L. ja Pyörälä S. Gummerus Kirjapaino Oy, Jyväskylä. Laboratory Handbook on Bovine Mastitis, Revised Edition National Mastitis Council, Inc. Murdough, PA, Deitz, KE, Pankey, JW. Effects of Freezing on the viability of Nine Pathogens from Quarters with Subclinical Mastitis. J Dairy Sci, 1996, 79, Muutokset edelliseen versioon Ohje päivitetty Evira-muotoon. Työohje B050 muuttunut MIBI 105:ksi. Edellinen menetelmäversio on EELA 3480 versio : Ohje on päivitetty uuden organisaation mukaiseksi. Tämä ohje korvaa ohjeen Evira 3480/ : Työohje MIBI 105 muuttunut LAB 2100.Kohtaan muutettu diagnostiikassa käytetyn testin nimi. Kohtaan lisätty erotusdiagnostiikkaan vaihtoehtoisia testejä : vastuuhenkilö muuttunut