UTLAGGNINGSSKRIFT C (", 2C

Transkriptio

1 n e3 (B) (11)KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT C (", 2C (51) Kv.lk.6 - Int.c1.6 C 07K 14/315, 16/12, 1/36, G 01N 33/569, 33/68, C 12Q 1/14 SUOMI-FINLAND (21) Patenttihakemus - Patentansökning (FI) (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag Patentti- ja rekisterihallitus (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig Patent- och registerstyrelsen (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (71) Hakija - Sökande 1. Tikkanen, Kaarina, c/o Biokemian ja bioteknologian laitos, Kuopion yliopisto, Savilandentie 9 F, Kuopio, (FI) 2. Finne, Jukka, c/o Biokemian ja bioteknologian laitos, Kuopion yliopisto, Savilandentie 9 F, Kuopio, (FI) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Tikkanen, Kaarina, c/o Biokemian ja bioteknologian laitos, Kuopion yliopisto, Savilandentie 9 F, Kuopio, (FI) 2. Finne, Jukka, c/o Biokemian ja bioteknologian laitos, Kuopion yliopisto, Savilandentie 9 F Kuopio, (FI) (74) Asiamies - Ombud: Oy Kolster Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Streptococcus ruis-bakteerin adhesiiniproteiini ja menetelmä sen valmistamiseksi Streptococcus suis-bakteriens adhesinprotein och förfarande för dess framställning (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer WO A 92/16630 (C 12N 15/31), Infection and Immunity, vol. 57, 1989, pp , The Journal of Biological Chemistry, vol. 267, 1992, pp (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksinnön kohteena on Streptococcus suisbakteerin adhesiiniproteiini, menetelmä sen valmistamiseksi ja adhesiiniproteiinin vastainen vasta-aine. Keksinnön kohteena on myös kyyhkyn ovomukoidin käyttö adhesiiniproteiinin tunnistamisessa. Keksinnön mukaista adhesiiniproteiinia ja sen vasta-aineita voidaan käyttää sekä diagnostisesti että terapeuttisesti. Uppfinningen berör Streptococcus suis-bakteriens adhesinprotein, förfarande för dess framställning och antikropp mot adhesinproteinet. Uppfinningen berör ocksä användningen av duvovomukoid vid identifiering av adhesinproteinet. Adhesinproteinet och dess antikropp i enlighet med uppfinningen kan användas både diagnostiskt och terapeutiskt.

2 1 9«7 33 Streptococcus suis-bakteerin adhesiiniproteiini ja menetelmä sen valmistamiseksi TAUSTA 5 Keksinnön ala Keksinnön kohteena on Streptococcus suis-bakteerin adhesiiniproteiini, sen biologisesti ja immunologisesti aktiiviset johdannaiset ja fragmentit, menetelmä adhesiiniproteiinin valmistamiseksi ja adhesiiniproteiinin, sen 10 johdannaisen tai fragmentin vastainen vasta-aine. Keksinnön kohteena on myös kyyhkyn ovomukoidin käyttö adhesiiniproteiinin tunnistamisessa. Keksinnön mukaista adhesiiniproteiinia, sen johdannaisia ja fragmentteja sekä niiden vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisesti. 15 S. suis-bakteerien (Lancefieldin ryhmä D) tiedetään aiheuttavan sikojen meningiittiä, pneumoniaa, artriittiä ja sepsistä. S. suis tyyppi 1 aiheuttaa pääasiassa vastasyntyneiden porsaiden septisemiaa ja meningiittiä, ja tyyppi 2 hieman vanhempien, n viikon ikäisten por- 20 saiden meningiittiä, joka voi tarttua myös ihmiseen. Siankasvatuksen keskittyessä ja eläintiheysten noustessa tartunnat leviävät yhä helpommin ja S. suis-bakteerin aiheuttamat infektiotaudit yleistyvät. Tästä syystä diagnostiikan kehittämistä pidetään erittäin tärkeänä sikojen meningiittien ja muiden vakavien infektioiden tunnistamisessa. Tunnettu tekniikka Bakteerien tarttuminen kohdesolujen pintaan on ensimmäinen tapahtumå bakteeritaudin synnyssä (Beachey, E.H. (1981) J. Infect. Dis. 143, ). Bakteerien tarttu-.30 mista välittää usein bakteerien pinnassa oleva proteiini, adhesiini, joka spesifisesti tarttuu solujen pinnan reseptorirakenteisiin. Adhesiineja tunnetaan monenlaisia, mutta niiden täsmällinen rakenne ja mekanismi on usein vielä selvittä- 35 mättä. Ne ovat luonteeltaan proteiineja, jotka spesifises-

3 2 ti tunnistavat kohdesolun reseptorit, jotka vuorostaan yleensä ovat hiilihydraattirakenteita. Bakteerien erityyppisiä adhesiineja ja niiden tunnistamia hiilihydraattirakenteita on esitetty mm. julkaisussa Sharon, N., (1987) 5 FEBS Letters, 217, E. coli ja monet muut gram-negatiiviset bakteerit tarttuvat lektiinien kaltaisilla bakteeriadhesiineilla isäntäsolun pinnan määrättyihin molekyyleihin. Tavallisia adhesiinien reseptoreita ovat glykolipidien ja glykopro- 10 teiinien sokeriosat. Usein adhesiinit ovat kiinnittyneet bakteerisolun pinnalla oleviin hiusmaisiin rakenteisiin fimbrioihin (piliin). Fimbrioita on monen tyyppisiä; ne vaihtelevat sekä rakenteen että sokerispesifisyyden suhteen. 15 Koska punasolujen pinnalla on usein bakteerien re- septorirakenteita, bakteerit tarttuvat näihin rakenteisiin ja agglutinoivat punasoluja in vitro-olosuhteissa. Bakteeriviljelmät saattavat ilmentää kolmea tai neljää hemagglutiniinia (adhesiinia), joista jokaisella on erilainen hii- 20 lihydraattispesifisyys; täten bakteerilla on kyky tarttua moniin eri solutyyppeihin. Enterobakteereiden tutkimuksissa adheesioreaktiot on jaettu kahteen pääluokkaan: mannoosiherkkiin (MS) reaktioihin, jolloin hemagglutinaatioreaktio inhiboituu a-man- 2:5 nosideilla ja mannoosiresistentteihin (MR) reaktioihin, jolloin hemagglutinaatio ei ole inhiboitavissa a-mannosideilla. E. colin tyyppi 1 fimbria (MS-rakenne) koostuu lähes pelkästään 17 kda:n suuruisista identtisistä osayksiköistä. Useat MR-adhesiinit tunnistavat a-gal(1-4)-b-gal 30 -rakennetta (P-spesifinen adhesiini) tai a-neunac-(2-3)- B-Gal (S-spesifinen adhesiini). Yleensä puhdistetut fimbriat koostuvat osayksiköistä, joiden molekyylipaino vaihtelee kda. Adhesiiniproteiini on tavallisesti erillinen pro- 35 teiini, joka on kiinnittynyt fimbrioiden päihin tai fim-

4 brioiden sivuille, sitä voi olla myös kiinnittyneenä suoraan bakteerin ulkomembraaniin. Joillakin bakteerikannoilla adhesiiniproteiinia on bakteerisolun pinnalla vaikka fimbriat puuttuvat. Adhesiinit saattavat tällöin muodostaa 5 adhesiinisen kapselin bakteerin ympärille. E. colin nonfimbriaalisten adhesiinien koko vaihtelee kda välillä (Jann, K. ja Hoschutzky, H. (1990), Current Topics in Microbiology and Immunology 151, 55-70). Streptokokkien tiedetään sitoutuvan erilaisiin liu- 10 koisiin proteiineihin ja glykoproteiineihin, sen sijaan niiden oligosakkaridispesifisyyttä ei juurikaan tunneta. Myös spesifinen sitoutuminen epiteelisoluihin on lähes tuntematonta. Jotkut Streptococcus sanguis- ja Streptococcus mitis-kannat sitovat galaktoosia ja sialohappoa 15 (Murray, P.A., Levine, M.J., Tabak, L.A., ja Reddy, M.S. (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, ). Streptococcus pneumoniaen sitoutuminen epiteelisoluihin inhiboituu GlcNAcB1-3Gal-rakenteella ja tämän bakteerin on raportoitu sitoutuvan GalNAcB1-4Gal-rakennetta sisältäviin 20 glykolipideihin keuhkoissa (Krivan, H.C., Roberts, D.D. ja Ginsburg, V. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, ). S. mitis tarttuu hampaan pintaan ja on osatekijä plakin muodostuksessa. Tästä bakteerikannasta on kyetty '5 eristämään sialohappoa sitova adhesiini. Sialohappoa sitovassa proteiinissa oli ainakin kaksi disulfidi-sidottua osayksikköä 96 kd ja 70 kd. Molemmat osayksiköt sitoivat N-asetyylineuramiinihappo-a2-3-galaktoosi-B1-3-N-asetyyligalaktosamiinia (Murray, P.A., Levine, M.J., Reddy, M.S.,.30 Tabak, L.A., Bergey, E.J. (1986) Infect. Immun. 53, ). S. sanguis-bakteerin galaktoosia sitovan adhesiinin molekyylipainoksi saatiin noin 20 kda ja sen isoelektrinen piste oli 8,5-9 (Nagata, K., Nakao, M., Shibata S., Shizukuishi, S., Nakamura R. ja Tsunemitsu, A. (1983) J. Pe- 35 riodontol. 54, ). Tämän lisäksi S. sanguis-baktee-

5 reista on kloonattu 36 kda-suuruinen adhesiini-proteiini. Kloonatun adhesiinin hiilihydraattispesifisyys on tuntematon; adhesiinin tiedetään kuitenkin tarttuvan syljellä pinnoitettuun hydroksiapatiittiin ph-herkän reseptorin 5 välityksellä (Ganeskumar, N., Song, M. ja McBride, B.C. (1988) Infect. Immun. 56, ). S. suis on tärkeä sikojen patogeeni. Se levittäytyy porsaiden tonsilloihin tai sieraimiin ja aiheuttaa vakavia infektioita. S. suis-bakteerien kapselipolysakkarideilla 10 ja pintaproteiineilla on esitetty olevan merkitystä patogeneesissä, mutta infektion molekulaarinen mekanismi on tuntematon. S. suis-bakteerien on osoitettu sitoutuvan sialyloituihin poly-n-asetyylilaktosamiiniglykaaneihin (Liukkonen J., Haataja, S., Tikkanen, K., Kelm, S., ja 15 Finne, J. (1992) J. Biol. Chem. 267, ). Kuitenkin useimpien S. suis-bakteerien aiheuttama hemagglutinaatio inhiboituu galaktoosilla, täten galaktoosia tunnistava adhesiini on todennäköisesti yleisempi S. suis-bakteerissa kuin edellä mainittu (Kuri, D., Haataja S. ja Finne, J. 20 (1989) Infect. Immun. 57, ). Adhesiineja on usein pyritty irroittamaan ja eristämään lämpökäsittelyllä ja/tai uuttamalla. Proteus mirabilis-bakteerin adhesiini eristettiin lämpökäsittelyllä (65 C, 20 min, 2 M urea) ja puhdistettiin geelisuodatuk- 25 sella (Sepharose CL-4B) (Wray, S.K., Hull, S.I., Cook, R.G., Barrish, J. ja Hull, R.A. (1986) Infect. Immun ). S. mitis-bakteerin lektiini irroitettiin uuttamalla bakteerit litium-3,5-dijodosalisylaatilla ja uutteesta puhdistettiin sialohappoa sitova proteiini geelisuodatuk- 30 sen ja affiniteettikromatografian avulla (Murray, P.A., Levine, M.J., Reddy, M.S., Tabak, L.A. ja Bergey, E.J. (1986) Infect. Immun. 53, ). Streptococcus pyogenes-bakteerin (Lancefieldin ryhmä A) sydänlihaskudokseenja munuaissolujen tyvikalvoon tarttuva proteiini 35 kyettiin eristämään käsittelemällä bakteereita emäksellä

6 h ajan (Stinson, M.W. ja Bergey E.J (1982). Infect. Immun. 35, ). E. colin nonfimbriaalinen adhesiini uutettiin kuumentamalla bakteerisuspensiota 65 C lämpötilassa 30 min ajan (Goldhar, J., Perry, R., Golecki, J.R., 5 Hoschutzky, H., Jann B., ja Jann, K. (1987) Infect. Immun. 55, ). Fimbriaalisesta E. colista erotettiin fimbriat homogenoimalla mekaanisesti ja fimbriahomogenaatista adhesiiniproteiini irroitettiin kuumennuskäsittelyllä (70 C 1 h, 5 mm EDTA) (Moch, T., Hoschutzky, H., Hacker, 10 J., Kröncke, K.-D ja Jann, K. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, ). Usein adhesiiniproteiinin irroittamisen jälkeen adhesiini on saostettu ammoniumsulfaattisaostuksella, minkä jälkeen adhesiinit on jatkopuhdistettu vaihtelevilla menetelmillä. Adhesiinien eristämisek- 15 si käytetyt tavanomaiset menetelmät eivät kuitenkaan so- pineet S. suis-bakteerien adhesiinien eristämiseksi. YHTEENVETO KEKSINNÖSTÄ Nyt on onnistuttu eristämään ja karakterisoimaan Streptococcus suis-bakteerin adhesiiniproteiini. Keksinnön 20 kohteena on näin ollen adhesiiniproteiini, jolle on tunnusomaista, se mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Mainitun adhesiiniproteiinin molekyylipaino on noin , isoelektrinen piste on noin 6,4 ja N-terminaalinen sekvenssi on Ala-Ser-Pro-Ala-Glu-Ile-Ala-Ser-Phe-Ser-Pro- 25 Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1). Keksinnön mukainen adhesiiniproteiini on valmistettavissa menetelmällä, jossa S. suis-bakteerikanta sonikoidaan ja irronnut adhesiiniproteiini esipuhdistetaan proteiinipuhdistuksessa tavanomaisella tavalla, minkä jälkeen se puhdistetaan elektrofo- 0 reettisesti tai kromatografisesti. Adhesiiniproteiinin puhdistuksen seurannassa käytetään edullisesti kyyhkyn ovomukoidia. Keksintö koskee myös adhesiiniproteiinin, sen johdannaisen tai fragmentin vastaista vasta-ainetta sekä diagnostista menetelmää, jossa tätä vasta-ainetta tai ad- 35 hesiiniproteiinia, sen johdannaista tai fragmenttia käy-

7 6 tetään immunomääritysmenetelmässä S. suis-bakteerien osoittamiseksi tai S. suis-bakteerien vastaisten vasta-aineiden osoittamiseksi. KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS 5 Keksinnön mukaista adhesiiniproteiinia pystytään irroittamaan S. suis-bakteerin pinnasta sonikoimalla. Sonikoinnin jälkeen on syytä lisätä proteaasi-inhibiittoria proteolyysin estämiseksi. Sitten sonikaatti sentrifugoidaan ja supernatantti otetaan talteen. Adhesiiniproteiinia 10 sisältävä supernatantti on hyvä esipuhdistaa, jollain proteiinipuhdistuksessa tavanomaisella tavalla, kuten esim. ultrafiltraatio, dialyysi, geelisuodatus, saostuminen suolalla. Edullisesti käytetään ammoniumsulfaattisaostusta ja erityisesti muita proteiineja voidaan poistaa noin 60 %- 15 :isesti kyllästetyllä ammoniumsulfaattiliuoksella, minkä jälkeen adhesiiniproteiini voidaan saostaa noin 70 %:isesti kyllästetyllä ammoniumsulfaattiliuoksella. Varsinainen puhdistus voidaan suorittaa elektroforeettisesti esim. geelielektroforeesilla tai kromatografi- 20 sesti esim. affiniteettikromatografialla tai immunoaffiniteettikromatografialla. Edullisesti käytetään preparatiivista natiivigeelielektroforeesia. Natiivielektroforeesilla ymmärretään elektroforeesia ilman natriumdodekyylisulfaattia eli SDS:ää. Erityisesti käytetään jatkuva-eluutio- 25 elektroforeesilaitetta, joka edullisesti on sylinterinmuotoinen. Laitteesta kerätään fraktiot ja otetaan talteen ne proteiinifraktiot, joissa on adhesiiniaktiivisuutta. Adhesiiniproteiinin puhdistuksen seurannassa voidaan käyttää hyväksi S. suis-bakteerin adhesiiniproteiinin 30 biologista aktiivisuutta. Adhesiiniproteiini liittyy S. suis-bakteerien hemagglutinaatiokykyyn, jota voidaan inhiboida tietyillä sokeriyhdisteillä, kuten galaktoosilla ja N-asetylgalaktosamiinilla tai vain galaktoosilla, millimolaarisissa pitoisuuksissa. Tutkittaessa galaktoosispesi- 35 fisiä adhesiiniproteiineja käytetään edullisesti sialidaa-

8 sikäsiteltyjä ihmisen punasoluja. Hemagglutinaatiokokeet ja hemagglutinaation inhibiitiokokeet kuvataan julkaisuissa Kurl, D.N., Haataja, S. ja Finne, J. (1989) Infect. Immun. 57, ja Haataja, S., Tikkanen, K., Liukko- 5 nen, J., Francois-Gerard, C. ja Finne, J., (1993) Characerization of a Novel Bacterial Adhesion Specificity of Streptococcus suis Recognizing Blood-Group P Receptor Oligosaccharides. J. Biol. Chem. 268, (painossa). Mono- ja oligosakkaridi-inhibitiokokeilla on ha- 10 vaittu, että S. suis-bakteerin reseptorirakenne on Gala1-4GalB1-4G1c. Tämä muodostaa oligosakkaridiosan P veriryhmän glykolipidien P k-antigeenissa. Toisaalta hemagglutinaation inhibitiokokeilla ja suoralla glykoproteiinien ja neoglykoproteiinien sitoutumisella on osoitettu, että ad- 15 hesiini tunnistaa myös P 1 -antigeenirakenteen, Gala1-4GalB1-4G1cNac. Tämä on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että adhesiini sitoutuu voimakkaasti Galal-4Gal-disakkaridirakenteeseen verrattuna al-3, al-6, a-galaktoosi-disakkaridi-johdannaisiin. Inhibitiokokeet oligosakkarideilla 20 osoittavat, että adhesiinin sitoutumiselle oleellista on terminaalinen a-galaktoosi. Nyt on keksitty, että kyyhkyn ovomukoidi on erityisen tehokas inhibiittori. 0,06 gg/ml kyyhkyn ovomukoidia inhiboi täysin S. suis-kannan 628 indusoiman hemaggluti- '25 naation. Kyyhkyn ovomukoidi on glykoproteiini, jonka glykaaniketjujen terminaalinen sekvenssi on Gala1-4Ga1B1-4G1cNAc ja jota on kuvattu julkaisussa Francois-Gerard C., Gerday C. ja Beeley, J.G. (1979) Biochem. J. 117, Tästä rakenteesta johtuu voimakas S. suis- adhesiiniprote- 0 sitoutuminen kyyhkyn ovomukoidiin ja tästä johtuen kyyhkyn ovomukoidilla on myös veriryhmä P 1 -aktiivisuus. Neoglykoproteiini Gala1-4GalB1-4G1c-O-CETE-BSA on myös osoittautunut hemagglutinaatio-inhibitiossa erittäin voimakkaaksi inhibiittoriksi. 35 Adhesiiniproteiinin puhdistumista voidaan helposti

9 ?) seurata yksinkertaisella kyyhkyn ovomukoidin sitoutumiskokeella. Puhdistuksen seurannassa käytettävä ovomukoidi voidaan leimata esim. radioaktiivisella merkkiaineella. Koe voi olla esim. täplätesti, jolloin adhesiiniproteiinia 5 sisältävä näyte pipetoidaan nitroselluloosapaperille, joka sitten peitetään radioaktiivisesti merkityllä kyyhkyn ovomukoidilla, inkuboidaan ja pestään se ja määritetään paperiin sitoutunut radioaktiivisuus. Sitoutumisen voimakkuus korreloi kannan hemagglutinaatioaktiivisuuteen. 10 Edullisesti adhesiiniproteiinin puhdistumista seurataan "western blot" -menetelmällä, jolloin näytteille suoritetaan polyakryyliamidigeelielektroforeesi, minkä jälkeen proteiinit siirretään sähkövirran avulla membraanille, jota sitten käsitellään kuten paperi yllä. S. suis- 15 bakteerisonikaatit antavat yhden adhesiiniproteiinivyöhykkeen, joka liikkuu samalla kohdalla eri kannoilla. Vyöhykkeen voimakkuus korreloi hemagglutinaatioaktiivisuuteen. Myös hemagglutinaationegatiivisilla kannoilla erottuu vyöhyke, vaikka yleensä heikommin. Syy siihen lienee adhesii- 20 niproteiiniin liittyvä faasivariaatio ts. bakteerit saattavat ilmentää adhesiinia eri tasolla eri olosuhteissa, tai muiden pintarakenteiden kuten kapselin inhiboiva vaikutus. Edellä kuvatulla menetelmällä voidaan valmistaa S. 25 suis-bakteerin adhesiiniproteiini, jonka molekyylipaino on noin , isoelektrinen piste on noin 6,4, N-terminaalinen sekvenssi on Ala-Ser-Pro-Ala-Glu-Ile-Ala-Ser-Phe- Ser-Pro-Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1) ja aminohappokoostumus on:

10 -; r- 7 s.4-) 9 Aminohappo nmol aminohappoa/nmol proteiinia Asx =asparagiini ja/tai aspargiinihappo 13 Thr =treoniini 8 Ser =seriini 6 5 Glx =glutamiini(glu) ja/tai glutamiinhappo 26 Gly =glysiini 22 Ala =alaniini 17 Vai =valiini 10 Cys =kysteiini 0 10 Met =metioniini 4 Ile =isoleusiini 11 Leu =leusiini 12 Tyr =tyrosiini 4 Phe =fenyylialaniini 6 15 Lys =lysiini 16 His =histidiini 7 Arg =arginiini 7 Pro =proliini Edellä kuvatun biologisen aktiivisuuden lisäksi adhesiiniproteiinin ominaisuuksiin kuuluu edelleen se, että se on immunologisesti aktiivinen, toisin sanoen se saa aikaan vasta-aineiden muodostuksen. Keksinnön mukaisen adhesiiniproteiinin piiriin kuu-. 25 luu näin ollen myös kuvatun proteiinin johdannaiset ja fragmentit, joilla on sama biologinen ja immunologinen aktiivisuus kuin kuvatulla adhesiiniproteiinilla. Johdannaisella ymmärretään proteiini, josta osa aminohapoista on korvattu, poistettu tai lisätty, mutta joka on säilyttänyt 30 oleelliset biologiset tai immunologiset ominaisuutensa. Korvaavat tai lisätyt aminohapot käsittävät sekä proteiineissa esiintyvät aminohapot että niiden johdannaiset. Mandolliset aggregaatit lasketaan myös keksinnön mukaisiin johdannaisiin. Fragmentilla ymmärretään kuvatun adhesiini- 35 proteiinin osaa, joka on säilyttänyt oleelliset biologiset

11 n r"? ' tai immunologiset ominaisuutensa. Johdannaiset ja fragmentit voidaan valmistaa proteiinikemiassa tavanomaisella tavalla. Fragmentit valmistetaan edullisesti peptidisynteesillä esim. kiinteäfaasimenetelmällä. Keksinnön piiriin 5 kuuluu edelleen adhesiiniproteiinin vastaiset vasta-aineet, joihin tässä yhteydessä lasketaan myös vasta-ainefragmentit, kuten esim. Fab-fragmentit tai faageissa ekspressoidut vasta-aineiden osat, jotka sitoutuvat keksinnön mukaiseen adhesiiniproteiiniin, sen johdannaiseen tai 10 fragmenttiin. Keksinnön piiriin kuuluu myös diagnostiset menetelmät S. suis-bakteerien osoittamiseksi tai S. suis-bakteerien vastaisten vasta-aineiden osoittamiseksi, sinänsä tunnetuilla immunomääritysmenetelmillä, joista mainitta- 15 koon esimerkiksi immunofluoresenssi-, ELISA- ja RIA-tekniikka. S. suis bakteerin läsnäolon osoittamiseksi näytteestä, näyte saatetaan kosketukseen keksinnön mukaisen vasta-aineen kanssa, ja määritetään muodostuneet antigeeni-vasta-ainekompleksit. Vastaavasti voidaan määrittää S. 20 suis-bakteerin vastaisia vasta-aineita saattamalla epäilty näyte reagoimaan keksinnön mukaisen adhesiiniproteiinin, sen johdannaisen tai fragmentin kanssa ja määrittämällä muodostuneet antigeeni-vasta-ainekompleksit. Antigeenivasta-ainekompleksit voidaan määrittää joko suoraan tai 25 epäsuorasti ja monella eri tavalla, jotka ovat alan ammattimiehelle varsin tunnetut. Usein joko antigeeni tai vasta-aine immobilisoidaan. Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit valaisevat keksintöä. 30 Esimerkki 1 Streptococcus suis-bakteerien kasvatus Tutkimuksissa käytettiin seuraavia S. suis-kantoja: Hemagglutinoivat: 628, TEW/2, R75/L1, 825 ja 752 Ei-hemagglutinoivat: 3027, 1045 ja 598/T5 35 Kannat 628, TEW/2, R75/L1 ja 825 on kuvattu julkaisussa

12 Kurl, D.N., Haataja, S. ja Finne, J., (1989) Infect. Immun. 57, Loput kannoista saatiin Dr. J. Hommez- 'ilta, Regional Veterinary Investigation Laboratory, Torhout, Belgia. 5 Kannat säilytettiin pakastettuina Todd-Hewitt-elatusaineessa -20 C:ssa. Bakteerit kasvatettiin anaerobisesti (Gas Pak-systeemi) tuoreilla lampaan veriagar-maljoilla 37 C:ssa yön yli. Bakteerit kerättiin maljoilta ja suspensoitiin fosfaattipuskuriin A (10 mm natriumfosfaat- 10 tipuskuri, 0,15 M NaC1, ph 7,4) siten, että konsentraatioksi saatiin 10 9 pesäkettä muodostavaa yksikköä/ml (A6~ Esimerkki 2 Adhesiiniproteiinin puhdistus 15 Adhesiiniproteiini irroitettiin bakteerin pinnalta sonikoimalla 5x15 sek. (jäähdytys jäissä 2x1 min. ja 1x2 min.) 2,5 ml:n erissä fosfaattipuskuriin A. Sonikoinnin jälkeen lisättiin proteaasi-inhibiittoria PMSF (fenyylimetyylisulfonyylifluoridi) 2 mm:ksi konsentraatioksi. Soni- 20 kaatit sentrifugoitiin x g, +8 C:ssa ja supernatantit otettiin talteen. Adhesiiniproteiini esipuhdistettiin seoksesta fraktioivalla ammoniumsulfaattisaostuksella. Ammoniumsulfaattisaostukseen käytettiin 16 ml supernatanttia. Muita proteiineja poistettiin seoksesta 60%:isesti kyllästetyllä ammoniumsulfaatilla ja adhesiini saostettiin 70 %:isesti kyllästetyllä ammoniumsulfaatilla. Adhesiiniproteiinia ei jäänyt merkittäviä määriä 70 %:iseen supernatanttiin. Kylmää kylläistä ammoniumsulfaattia tiputettiin pisaroittain liuokseen (0 C), seisotettiin 1 tun- 30 nin ajan jäähauteessa, sentrifugoitiin x g, 20 min. Sakat 70%:n saostuksesta otettiin talteen ja liuotettiin 16 ml:aan fosfaattipuskuria B (3,3 mm natriumfosfaattipuskuri, 0,05 M NaC1, ph 7,4). Sakat dialysoitiin yön yli +8 C, H20:ta vastaan, lyofilisoitiin ja liuotettiin 4 35 ml:aan fosfaattipuskuria A. Puhdistumista seurattiin 6 %- 5,0).

13 9, :isessa natiivissa polyakryyliamidigeelielektroforeesissa radioaktiivisella jodilla merkityn kyyhkyn ovomukoidin avulla Bio Rad-minigeelilaitteella (ks. esimerkki 3). Varsinainen puhdistus suoritettiin Bio Rad 491 Prep 5 Cell preparatiivisen elektroforeesilaitteen avulla. Sylinterinmuotoiseen geelilaitteeseen valettiin 6 %:inen natiivi polyakryyliamidigeeli (alageelin korkeus 6 cm, ylägeelin 2 cm). Näytteen kokonaistilavuus oli 4 ml, josta 3000 gl yllä valmistettua proteiiniliuosta, 920 gl näytepusku- 10 ria (ei SDS-liuosta) ja 80 gl merkkiväriä BPB (bromfenolisininen). Ajoliuoksena oli 25 mm Tris-192 mm glysiini, ph 8,3 ja eluutiopuskurina Tris-HC1, ph 8,3. Näytteistä kerättiin 4 ml:n fraktiot, jotka analysoitiin mittaamalla fraktioiden absorbanssi kandella eri aallonpituudella ( nm ja 280 nm), minkä jälkeen näytteet ajettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesissa Bio Rad-minigeelilaitteella, kuten esimerkissä 3 on kuvattu. Adhesiiniproteiinia oli fraktioissa Fraktiot yhdistettiin, dialysoitiin yön yli +8 C:ssa fosfaattipuskuria B vastaan ja 30 kylmäkuivattiin. Kuivattu sakka säilytettiin myöhempiä analyysejä varten -20 C:ssa. Esimerkki 3 Puhdistumisen seuranta Puhdistumisen seurannassa käytettiin hyväksi ha- 25 vaintoa, että S. suis-bakteerit sitoivat voimakkaasti kyyhkyn ovomukoidia, joka siis sisältää disakkaridirakenteen galaktosyyli-a1-4-galaktosidin. Tästä syystä kehitettiin adhesiiniproteiinin tunnistusmenetelmä merkitsemällä kyyhkyn ovomukoidi radioaktiivisesti merkkiaineella. 30 Radioaktiivisesti merkityn ovomukoidin sitoutumiskokeessa hemagglutinoivan S. suis 628-bakteerikannan lisäksi kontrollikantoina käytettiin negatiivista ts. ei-hemagglutinoivaa S. suis-kantaa 598/T5 sekä heikosti hemagglutinoivaa S. suis-bakteerikantaa 825 (S. suis 628-kannan hemag- 35 glutinaatiotiitteri oli 64, 825-kannan tiitteri 4 ja 598/

14 T5-kannan tiitteri 0). Ovomukoidi merkittiin radioaktiivisesti 125I-isotoopillaIodo-Bead-menetelmällä (Pierce Chemical Co, Rockford II) valmistajan ohjetta mukaillen. Ensi vaiheessa kehitettiin ns. täplätesti. Tässä 5 sitoutumiskokeessa kukin esimerkin 1 mukaisesti valmistettu bakteerisuspensio laimennettiin (1:1; 1:10; 1:50) fosfaattipuskuriin A. Suspensioita pipetoitiin 1 gl ruudutetulle nitroselluloosapaperille, minkä jälkeen ylimääräiset sitomispaikat peitettiin inkuboimalla 1,5 h fosfaattipus- 10 kurissa C (0,1 M natriumfosfaattipuskuri, 0,5% Tween 20, 150 mm NaCl, ph 5,3). Tämän jälkeen nitroselluloosa peitettiin 125 I-ovomukoidilla (6x10 5 cpm, spesifinen akt. 2,5x10 5 cpm/µg ovomukoidi) ja inkuboitiin lh, +8 C:ssa. Membraani pestiin 3x10 min. fosfaattipuskurilla C, kuivat- 15 tiin suodatinpaperien välissä ja valotettiin röntgenfilmille -80 C:ssa 24 h. Sitomista oli havaittavissa ainoastaan hemagglutinoivissa kannoissa jopa pienissä bakteeripitoisuuksissa, lisäksi sitoutumisen voimakkuus korreloi hemagglutinaatioaktiivisuuteen. 20 Toisessa vaiheessa edellä kuvattua menetelmää soveltaen, kehitettiin "western blot" tunnistusmenetelmä adhesiiniproteiinille polyakryyliamidigeelielektroforeesissa (Laemmli, U.K. (1970) Nature (London) 227, ). Käytettiin natiivia geelielektroforeesia; ilman SDS-li- 25 säystä, jolloin proteiinit säilyvät natiivissa muodossaan. Esimerkin 2 mukaisesti valmistetut bakteerisonikaatit eroteltiin useissa polyakryyliamidigeelielektroforeesisysteemeissä, jotka sisälsivät eri pitoisuuksia polyakryyliamidia (5-9 %). Lopuksi päädyttiin käyttämään 6 %. Erotta- 30 misen jälkeen sonikaatit siirrettiin sähkövirran avulla (60 ma, 30 min) PVDFp (Millipore) membraanille (Burnette, W.N. (1981) Anal. Biochem. 112, ) ja membraani merkittiin 125 I-ovomukoidilla kuten yllä. Kokeissa käytettiin S. suis-kantoja hemagglutinoivia kantoja: 628, TEW/2, R75/ 35 Ll, 825, 752 ja ei-hemagglutinoivia kantoja: 3027 ja

15 Sonikaateista erottui voimakkaasti yksi proteiinivyöhyke, joka liikkui elektroforeesissa hemagglutinoivilla bakteerikannoilla samalla kohdalla. Vyöhykkeen voimakkuus korreloi hemagglutinaatioaktiivisuuteen, mutta myös nega- 5 tiivisista kannoista erottui samalla kohdalla natiivissa geelielektroforeesissa liikkuva vyöhyke, yleensä heikommin. 10 varmistus Esimerkki 4 Adhesiiniproteiinin molekyylipaino ja puhtauden Adhesiinin puhtaus varmistettiin ja elektroforeettisen liikkuvuuden perusteella määritettiin molekyylipaino 15%:isessa SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa (Laemmli, U.K. (1970) Nature (London) 227, ). Kan- 15 nan 628 adhesiiniproteiinia (4 gg) keitettiin 5 min. ajan 2%:isessa SDS-liuoksessa, jossa oli joko 5% merkaptoetanolia tai 2,5 mm ditiotreitolia. Puhdistetusta adhesiiniproteiinista erottui yksi vyöhyke. Molekyylipainostandardeina käytettiin Pharmacian Low Molecular Weight Standards-stan- 20 dardiproteiineja. Adhesiinin molekyylipainoksi saatiin Esimerkki 5 Isoelektrinen piste Isoelektrinen fokusointi suoritettiin Phast geeli- 25 elektroforeesi-laitteella Phast isoelektristä systeemiä käyttäen (Pharmacia). Geelinä oli Phast Gel ja standardeina IEF standardi 3-10 (Pharmacia). Puhdistettua kannan 628 adhesiinia käytettiin määritykseen 0,2 gg. Isoelektrinen fokuscintigeeli värjättiin käyttäen Phast sys- 30 teemin Silver IEF-Method 6. Adhesiinin isoelektriseksi pisteeksi saatiin 6,4. Esimerkki 6 Aminohappoanalyysi Aminohappoanalyysiä varten 7 nmol kannan 628 puh- 35 distettua adhesiinia liuotettiin 100 gl:aan 6 M HC1-liuos-

16 15 9 2, _ 5 ta. Sisäiseksi standardiksi lisättiin 60 nmol norleusiinia. Hydrolysoitiin 110 C:ssa, 24 h, kylmäkuivattiin ja analysoitiin LKB 4151 Alpha Plus Aminoacid Analyzer-laitteen avulla valmistajan ohjeen mukaan. Aminohappokoostumus oli seuraava: Aminohappo nmol aminohappoa/ nmol proteiinia 1 Asx 13,2 2 Thr 8,1 3 Ser 5,8 4 Glx 26,4 5 Gly 22,3 6 Ala 16,9 7 Val 10,3 8 Cys 0,0 9 Met 3,9 10 Ile 11,4 11 Leu 12,3 12 Tyr 3,9 13 Phe 6,0 14 Lys 15,9 15 His 6,6 16 Arg 6,8 17 Pro 12,4 venssi Esimerkki 7 Adhesiiniproteiinin N-terminaalinen aminohapposek- Adhesiiniproteiinin N-terminaalinen aminohapposek- 30 venssi määritettiin Applied Biosystems 477A Pulsed Liquid Protein/Peptide Sequencer with 120A Amino Acid Analyzer -peptidisekvensaattorin avulla valmistajan ohjeen mukaan. Puhdistettua adhesiinia ajettiin 6%:iseen natiivipolyakryyliamidigeeliin, josta adhesiini siirrettiin sähkövirran 35 avulla PVDFp-membraanille, kuten esimerkissä 3. Membraani

17 värjättiin Coomassie Brilliant Blue -proteiinivärillä (10 min.), ylimääräinen väri poistettiin ja proteiinivyöhyke leikattiin peptidisekvensointia varten. Adhesiiniproteiinin N-terminaalinen sekvenssi pys- 5 tyttiin määrittämään myös sonikoitujen bakteerien supernatanteista: Adhesiiniproteiinin liikkuvuus natiivigeelielektroforeesissa tunnetaan, koska adhesiiniproteiinivyöhyke pystytään identifioimaan ' 25 I-kyyhkyn ovomukoidin avulla PVDFp-membraanilta. Viidestä eri hemagglutinoivasta 10 S. suis -kannasta (628, TEW/2, R75/L1, 825, 752) identifioitiin adhesiiniproteiinin liikkuvuus 6%:isessa natiivipolyakryyliamidigeelielektroforeesissa; näiden bakteerikantojen sonikaatit ajettiin elektroforeesissa ja vyöhykkeet siirrettiin PVDFp-membraanille. Tästä adhesiinivyö- 15 hykkeet leikattiin aminohapposekvensointia varten, kuten edellä. Saatu N-terminaalinen sekvenssi oli kaikilla kannoilla sama eli: Ala - Ser-Pro-Ala -Glu - Ile -Ala-Ser-Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Leu-Ala- 20 (sekvenssi 1) Esimerkki 8 Adhesiiniproteiinin vasta-aineen valmistaminen Kannan 628 adhesiiniproteiinin vasta-ainetta valmistettiin Balb/c-hiirissä. Hiiret immunisoitiin joko puh- 25 taalla adhesiinilla (10 gg/hiiri) tai S. suis-bakteerista valmistetulla sonikaatilla (80 gg/hiiri). Ensimmäisessä tapauksessa adhesiini injisoitiin kaksi kertaa Freundin täydellisessä adjuvantissa (F.C.A.) ja kerran Freundin epätäydellisessä adjuvantissa (F.I.C.A.). Jälkimmäisessä 30 tapauksessa proteiiniseos pistettiin hiiriin kerran F.C.A.:n kanssa ja kaksi kertaa sekoitettuna F.I.C.A.:iin. Immunisointi suoritettiin subkutaanisesti. Molemmissa tapauksissa vasta-aineita muodostui adhesiiniproteiinia vastaan. 35 Vasta-aineen muodostus tutkittiin PVDFp-membraanil-

18 ta, johon oli siirretty S. suis-bakteereiden sonikaattisupernatantteja (ks. esimerkki 2). Adhesiiniproteiinin vyöhyke tunnistettiin (vrt. esimerkki 3) ja vasta-aineen muodostus S. suis-bakteerikannan 628 adhesiiniproteiinia 5 vastaan oli voimakasta. Vasta-aine kykeni spesifisesti tunnistamaan adhesiiniproteiinin vielä laimennoksessa 1:5x10 5. (Vasta-aineen epäspesifinen sitoutuminen estettiin inkuboimalla membraania 1,5 h, 1,5 % maitojauhe-0,5 % Tween 20- liuoksessa, joka oli tehty puskuriin D (10 mm 10 Tris, 150 mm NaCl, ph 7.8). Membraani pestiin kolmesti puskurilla D, johon oli lisätty 0,05 % Tween 20. Vastaainelaimennokset lisättiin yhden tunnin ajaksi, jonka jälkeen membraani pestiin 5x puskurilla D, johon oli lisätty 0,05 % Tween 20. Membraania inkuboitiin alkaalisella fos- 15 fataasilla merkityn hiiren vasta-aineen kanssa tunnin ajan (1:1000 laimennos), pestiin viidesti puskurilla D ja lisättiin alkaalisen fosfataasin substraattia värireaktion aikaansaamiseksi (bromikloori-indolyylifosfaatti-nitrosinitetratsoliumi). 20 Aminohapposekvenssi nro 1: Ala Ser Pro Ala Glu Ile Ala Ser Phe Ser Pro Ala Pro Leu Ala

19 Patenttivaatimukset 1. Streptococcus suis-bakteerin adhesiiniproteiini ei-terapeuttiseen käyttöön, tunnettu siitä, että 5 sillä on galaktoosilla inhiboituva hemagglutinaatioaktiivisuus, se sitoutuu kyyhkyn ovomukoidiin ja se saa aikaan vasta-aineiden muodostuksen ja sen molekyylipaino on noin , isoelektrinen piste on noin 6,4 ja N-terminaalinen sekvenssi on Ala-Ser-Pro-Ala-Glu-Ile-Ala-Ser-Phe-Ser-Pro- 10 Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1) ja sillä on seuraava amino- happokoostumus Aminohappo nmol aminohappoa/nmol proteiinia Asx Thr 8 Ser 6 Glx 26 Gly 22 Ala Val 10 Cys 0 Met 4 Ile 11 Leu Tyr 4 Phe 6 Lys 16 His 7 Arg 7 30 Pro 12 tai sen johdannainen tai fragmentti, jolla on sama biologinen ja immunologinen aktiivisuus. 2. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen Strep- 35 tococcus suis-bakteerin adhesiiniproteiinin valmistamisek-

20 si, tunnettu siitä, että S. suis-bakteerikanta sonikoidaan, ja irronnut adhesiiniproteiini esipuhdistetaan proteiinipuhdistuksessa tavanomaisella tavalla, minkä jälkeen se puhdistetaan elektroforeettisesti tai kromato- 5 grafisesti. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään preparatiivista natiivigeelielektroforeesia. 4. Kyyhkyn ovomukoidin käyttö Streptococcus suis- 10 bakteerin adhesiiniproteiinin tunnistamisessa. 5. Vasta-aine ei-terapeuttiseen käyttöön, t u n - nettu siitä, että se on patenttivaatimuksen 1 mukaisen adhesiiniproteiinin vastainen. 6. Diagnostinen menetelmä, tunnettu siitä, 15 että patenttivaatimuksen 5 mukaista vasta-ainetta tai patenttivaatimuksen 1 mukaista adhesiiniproteiinia käytetään immunomääritysmenetelmässä S. suis-bakteerien osoittamiseksi tai S. suis-bakteerien vastaisten vasta-aineiden osoittamiseksi Patenttivaatimuksen 1 mukaisen adhesiiniproteiinin tai patenttivaatimuksen 5 mukaisen vasta-aineen käyttö diagnostisesti.

21 Patentkrav 1. Adhesinprotein av bakterien Streptococcus suis för icke-terapeutiskt bruk, k ä n n e t e c k n a t där- 5 av, att det har hemagglutinationsaktivitet som inhiberas av galaktos, det binds vid ovomukoid av duva och det ger upphov till bildning av antikroppar och dess molekylvikt är ca , isoelektriska punkt är ca 6,4 och N-terminala sekvens är Ala - Ser -Pro-Ala-Glu-Ile-Ala-Ser-Phe-Ser-Pro- 10 Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvens 1) och det har följande aminosy- rasammansättning Aminosyra nmol aminosyra/nmol protein Asx Thr 8 Ser 6 Glx 26 Gly 22 Ala Val 10 Cys 0 Met 4 Ile 11 Leu Tyr 4 Phe 6 Lys 16 His 7 Arg 7 30 Pro 12 eller ett derivat eller fragment därav med samma biologiska och immunologiska aktivitet. 2. Förfarande för framställning av adhesinproteinet 35 av bakterien Streptococcus suis enligt patentkrav 1,

22 k ä n n e t e c k n a t därav, att man sonikerar en S. suis-bakteriestam och renar det frigjorda adhesinproteinet på ett inom proteinrening sedvanligt sätt, varefter det renas elektroforetiskt eller kromatografiskt Förfarande enligt patentkrav 2, känne- tecknat därav, att man använder preparativ nativgelelektrofores. 4. Användning av ovomukoid av duva för att identifiera Streptococcus suis-bakteriens adhesinprotein Antikropp för icke-terapeutiskt bruk, k ä n - netecknaddärav, att den är riktad mot adhesinproteinet enligt patentkrav Diagnostiskt förfarande, känneteckn a t därav, att man i ett immunbestämingsförfarande an- 15 vänder antikroppen enligt patentkrav 5 eller adhesinproteinet enligt patentkrav 1 för att påvisa S. suis-bakterier eller antikroppar mot S. suis-bakterier. 7. Användning av adhesinproteinet enligt patentkrav 1 eller antikroppen enligt patentkrav 5 diagnostiskt.