Keuhkosyövän molekulaarinen patologia. Sakari Knuutila HY, Haartman Instituutti

Transkriptio

1 Keuhkosyövän molekulaarinen patologia Sakari Knuutila HY, Haartman Instituutti

2 Tänään Keuhkosyöpä: äärimmäisen komplisoituneen taudin kuvaaminen systeemibiologisella lähestymistavalla auttaa ymmärtämään, miksi pysyviä hoitotuloksia on niin vaikea saada Kaaoksen keskellä kuitenkin hoidossa hyödynnettäviä todellisia syntipukkeja: superaloittajia ja aloittajia (driver genes and super drivers) Millaisia kliinisesti hyödynnettäviä aloitusgeenejä ja niiden mutaatioita tunnetaan? EGFR- ja ALK-toimintaverkostot ja EGFR ja ALK-inhibiittorit Hoidon murentuminen: Toimintaverkoston uudelleen aktivointi: mutaatiot ja lukematon määrä muita tekijöitä Monien muutosten määrittämisen tarve edellyttää uuden teknologian hyödyntämistä erityisesti uuden polven sekvensointia. Missä ja miten mutaatiotestit tulisi tehdä Vähän omistakin tutkimustuloksista

3 Syövän systeemibiologiaa: molekyyli-, geeni-, solu- kudos-, yksilö- ja populaatiotaso (rakenne ja toiminta) ja ympäristö sekä evoluutio syövän syntyyn vaikuttavia tekijöitä jatkossa valotan vähän molekyyligeneettistä tasoa DNA DDDNA

4 Prot. Molekyylipatologian kytkentä

5 Proteiinin virheellinen toiminta Syöpä Prot.

6 Lähetti-RNA:n virheellinen toiminta Syöpä Prot. mrna

7 Säätelyn häiriö geenin luennassa Syöpä Prot. mrna EPIG Metyl./ Asetyl.

8 Geenin luennan jälkeinen säätelyn häriö Syöpä Prot. mrna EPIG Metyl./ Asetyl.

9 Geenin kopiomäärän muutos (mutaatio) Syöpä Prot. mrna EPIG Metyl./Asetyl.

10 Kromosomien uudelleen järjestyminen ja fuusiogeeni Fuusiogeeni Syöpä PROT mrna EPIG Metyl./Asetyl.

11 Emästason mutaatiot FUGE Syöpä PROT mrna EPIG Metyl./Asetyl.

12 Variaatio altistaa muutoksille FUGE Syöpä PROT mrna EPIG Metyl./Asetyl.

13 Variaatio ja sukusolumutaatiot aiheuttavat genomin instabiliteettiä FUGE Syöpä PROT mrna EPIG Metyl./Asetyl.

14 Epigeeneettiset häriöt oman lusikkkansa häriökeitokseen oravanpyörään FUGE Syöpä PROT mrna EPIG Metyl./Asetyl.

15 Tekevälle sattuu, ympäristö ja perinnöllisyys muutosten taustalla Sattuma FUGE Syöpä PROT mrna Altiste EPIG Metyl./Asetyl. Altiste

16 Populaation evoluutio synnyttänyt suojageeneja, mutta liian nopea/voimakas ympäristömuutos haitallinen Sattuma FUGE Populaatio Potilas Syöpä PROT mrna Altiste Ympäristö Kliininen kuva Patologia EPIG Metyl./Asetyl. Altiste

17 Kuvaillut tekijät mukana solun koneiston syöpään johtavissa häiriöissä Toimintaverkostojen komplisoituneisuudesta johtuen on suorastaan ihme, ettemme kaikki kuole syöpään

18

19 Solun sisäinen viestintä Vuorovaikutteista ja siis niin komplisoitunutta Miten ihmeessä yhden geenin yhdellä mutaatiolla voi olla hoidollista merkitystä? Superaloitusmutaatiot: - aktivoivat syöpägeenit (kaasuttajat) - estäjägeenit (jarrumiehet, korjaajat ja vahtikoirat) Hoidollinen merkitys toistaiseksi todettu kaasuttajilla (proteiinikinaaseilla kuten EGFR, ALK, BRAF ja RAS)

20 ligandi EGFR solukalvo RASreitti RAS P P PIP2 PI3K PIP3 PDK1/2 PTEN Ekspressio/ mutaatiot BRAF mutaatiot mutataatiot AKT1/2 mtor PI3K/AKTreitti MEK1 MEK2 p21 p27 GSK3 VEGF BAD p70s6k 4EBP1 eif4e ERK1/2 solun elinkyky angiogeneesi apoptoosi transduktio solun elinkyky proliferaatio angiogeneeesi migraatio transkriptio p53 Β-kateniini

21 Elenius K: Duodecim, 2006.

23 Millaisia EGFR-mutaatioita? Kinaasialueeseen vaikuttavia

24 The distribution of activating mutations among EGFR mutation positive patients is similar in Asian and Non Asian studies Regulatory domain C-lobe ATP binding cleft N-lobe Transmembrane region Extracellular domain TK domain A-loop Chelix P-loop

25 Mihin perustuu? Kohdistettu estohoito

27 EGFR-mutaatiot hoitoa ennakoivia (prediktiivisia) biomarkkereita Estohoidolla hoitotulokset merkittävästi parempia kuin kemoterapialla, jos syöpäsoluissa on aktivoiva mutaatio.

28 Tautivapaa ennuste EGFR-mutaatiopositiivisilla ja negatiivisilla EGFR-inhibiittorilla ja solusalpaajilla hoidetuilla ei-pienisoluisilla keuhkosyöpäpotilailla Tautivapaa ennuste Gefitinib EGFR M+ (n=132) Gefitinib EGFR M- (n=91) Carboplatin / paclitaxel EGFR M+ (n=129) Carboplatin / paclitaxel EGFR M- (n=85) Kuukausia Kuva muokattu: Mok et al. ESMO Abstract LBA2. Mok TS. et al. NEJM 2009;361(10):

29 Miksi hoitovastetta ei aina saada tai miksi hoitovaste hiipuu miltei kaikilla? Alavirran geenien aktivoivat mutaatiot EGFR:n resistenttimutaatiot Lukuisat muut tekijät : vrt. esitykseni johdanto: kaoottisista genomin poikkeavuuksista löytyy aina muutoksia, jotka tarjoavat solulle pakotien hoitokurimuksesta selektiopaine

30 ligandi EGFR solukalvo RASreitti RAS P P PIP2 PI3K PIP3 PDK1/2 PTEN Ekspressio/ mutaatiot BRAF mutaatiot mutataatiot AKT1/2 mtor PI3K/AKTreitti MEK1 MEK2 p21 p27 GSK3 VEGF BAD p70s6k 4EBP1 eif4e ERK1/2 solun elinkyky angiogeneesi apoptoosi transduktio solun elinkyky proliferaatio angiogeneeesi migraatio transkriptio p53 Β-kateniini

31 EGFR mutaatioiden jakautuminen geenissä Ainoastaan neljässä eksonissa: Eksonien 19 ja 21 mutaatiot kattavat noin 90 % kaikista mutaatioista EGFR Geeni Tyrosiinikinaasiaalue Eksonit Eksoni 18 Sensitiivinen Eksoni 19 Sensitiivinen Eksoni20 Resistentti Eksoni 21 Sensitiivinen G719C G719S G719A 5% Del E746-A750 Del E746_S752>V Del E746_T751>A Del E746_T751 Del L747_A750>P Del L747_E749 Del L747_P753>Q Del L747_P753>S Del L747_S752 Del L747_T751>P Del L747_T751 Del S752_I759 & muut deleetiot T790M D770_N771 (ins NPG) D770_N771 (ins SVQ) D770_N771 (insg) S768I ~5% L858R L861Q ~45% ~45%

32 Figure 4. Overall (A) and progression-free (B) survival curves in lung adenocarcinoma patients according to the mutational status of KRAS assessed by DS. Curve differences are statistically significant. All P values refer to log-rank tests. Months indicate months from the beginning of treatment. Neoplasia (2009) 11,

33 Neoplasia (2009) 11, Kuva muokattu: Mok et al. ESMO Abstract LBA2. Mok TS. et al. NEJM 2009;361(10):

34 Figure 5. Overall (A) and progression-free (B) survival curves in lung adenocarcinoma patients according to the mutational status of EGFR. Curve differences are statistically significant. All P values refer to log-rank tests. Months indicate months from the beginning of treatment. Neoplasia (2009) 11,

35 EML4-ALK -fuusio keuhkosyövässä Ei-pienisoluinen (2,3 %) Inversio kromosomin 2 lyhyessä haarassa Onkogeeninen TKfuusiokinaasi Oma tautikokonaisuus? Herkkä ALK-estäjille

36 ALK-fuusiosignalointi

37 Keuhkosyöpien aloitusmutaatioita ja estäjiä Geeni/muutos Histologia Yleisyys % Proteiini Estäjä käytössä Hoitokokeiluja meneillään Prekliinisiä tutkimuksia AKT1-mutaatiot AC < 1 Seriini-TK - Pan-AKT-estäjät ALK uudelleen AC 2,3 RTK Crizotinib, ceritinib Alectinib, PF , TSR-011, ALK estäjät järjestymät AP26113, ASP3026, X-396, Hsp90- estäjät BRAF-mutaatiot AC 1 Seriini-TK Vemurafenib, dafrafenib, MEKestäjät, dasatinib RAF-estäjät EGFR-mutaatiot AC 11,4 RTK Gefitinib, erlotinib, afatinib, icotinib CO1686, AZD9291, cetuximab + afatinib, Hsp90-estäjät Mutaatio-spesifiset EGFR-estäjät HER2 (ERBB2)- mutaatiot AC 2 RTK ERBB/HER2-estäjät, mtor/p13kestäjät HER2-estäjät, Hsp90- estäjät KRAS-mutaatiot AC 25 GTPase Sytotoksinen kemoterapia + MEKestäjät, P13K-estäjät, FAK-estäjät KRAS G12C-estäjät, KRAS-estäjät, MEK- ja P13K-estäjät, JAK/TBK1/1KK-estäjät MEK1 (MAPK2K1)- AC < 1 Seriini-TK - MEK-estäjät mutaatiot MET monistumat AC 1 RTK Crizotinib, tivantinib, onartuzumab, MET-estäjät muut MET-estäjät NRAS-mutaatiot AC 1 GTPase - MEK-estäjät NTRK1 uudelleen AC < 1 RTK Crizotinib TRKA-estäjät järjestymät RET uudelleen järjestymät AC 1 RTK Cabozantinib, vandetanib, sunitinib, ponatinib RET-estäjät, Hsp90- estäjät ROS1 uudelleen järjestymät AC 2 RTK Crizotinib, ceritinib, PF ROS-estäjät, Hsp90- estäjät DDR2-mutaatiot SCC 4 RTK Dasatinib DDR2-estäjät FGFR1 monistumat SCC 20 RTK FGFR-estäjät FGFR-estäjät FGFR2/3/4-mutaatiot SCC 7 RTK FGFR-estäjät FGFR-estäjät ja uudelleen järjestymät PIK3CA-mutaatiot SCC 7 (SCC) 1 (AC) Lipidikinaasi P13K-estäjät P13K-estäjät, mtorestäjät PTEN-mutaatiot SCC 6 (NSCLC) Lipidi/proteiini fosfataasi - P13K-estäjät

38

39 Mutaatiotestin suorittaminen Mitä halutaan selvittää? EGFR, ALK, KRAS, NRAS?, BRAF?, muita aloitusmutaatiota? Mitkä potilaat? Adenokarsinoomapotilaat, kaikki NSCLC:t vai kaikki keuhkosyövät? Miten? Yksi kerrallaan sarjassa perinteisillä menetelmillä KRAS (PCR) neg. EGFR (PCR) neg. - ALK (IHC) EGFR (PCR) neg. ALK (IHC) ALK (IHC) neg. EGFR (PCR) HUSin käytäntö ALK (IHC) pos. ALK (FISH) HUSin käytäntö Kaikki aloitusmutaatiot kohdistetulla NGS:llä

40 NGS:n edut Voidaan kohdistaa kaikkiin kliinisesti merkityksellisiin mutaatioihin; voidaan siis poimia vain etukäteen määritellyt hoitoon liittyvät mutaatiot kliiniseen käyttöön (minkäänlaiseksi ongelmaksi ei siis muodostu se, että menetelmä tuottaa valtavan määrän muuta tietoa) Luotettava Pienestä lähtömateriaalista: ng FFPE, ohutneulabiopsiat, seerumi, uloste (CRC), yskös?, hengitysilma?? Herkkä: < 1% Nopea: 2 vrk Halpa: < 200 euroa/analyysi Tuottaa samasta materiaalista tutkimuskäyttöön uutta tietoa, joka voi hyödyntää hetken päästä tutkittavaa potilasta, koska hoidollisesti uutta tietoa syntyy kiihtyvällä vauhdilla

41 Comparison of Targeted Next-Generation Sequencing (NGS) and Real-Time PCR in the Detection of EGFR, KRAS and BRAF Mutations on Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tumor Material of Non-Small Cell Lung Carcinoma Supreriority of NGS Tuononen, K., Maki-Nevala, S,. Sarhadi, V.K., Wirtanen, A., Rönty, M. J., Salmenkivi, K., Andrews, J.M., Telaranta-Keerie, A. I., Hannula, S., Lagstrom, s., Ellonen, P., Knuuttila, A. & Knuutila, S. Genes Chromosomes & Cancer. 52, 5:

42 Table 1. Comparison of EGFR, KRAS and BRAF mutation detection by targeted nextgeneration sequencing (NGS) and real-time PCR (RT-PCR) in non-small cell lung carcinoma (NSCLC) Gene No of cases compared Concordant Discordant Percentage of concordance (NGS/RT-PCR) (NGS/RT-PCR) (%) / +/+ /+ +/ EGFR s KRAS ss BRAF s No mutation detected by Sanger sequencing in 2 out of the 3 cases. Third case was not analyzed by Sanger sequencing ss No mutation detected by Sanger sequencing

43 Table 3. All non-synonymous SNVs and indels in EGFR gene (not in the panel of the PCR kit used) detected by targeted next-generation sequencing in non-small cell lung carcinoma (NSCLC) Gene Cases Protein change Exon Protein domain Variant previously described EGFR 1 NSCLC Leu62Arg 2 extracellular (receptor L domain) glioblastoma (Cancer Genome Atlas Research Network, 2008) EGFR 2 NSCLC Tyr275Phe 7 extracellular (furin-like Cys rich not previously described domain) EGFR 1 NSCLC Ala647Thr s 17 transmembrane not previously described EGFR 1 NSCLC Ala767_Ser768 ins SerValGly 20 protein kinase not previously described Our patient was resistant to erlonitinib EGFR 1 NSCLC His773Leu* 20 protein kinase lung carcinoma (Yang et al., 2005; Penzel et al., 2011) EGFR 3 NSCLC His773Pro 20 protein kinase not previously described EGFR 1 NSCLC Val774Met* 20 protein kinase lung carcinoma (Yang et al., 2005; Yokoyama et al., 2006; Zhang et al., 2006; Penzel et al., 2011) EGFR 1 NSCLC Pro848Leu ss 21 protein kinase lung carcinoma (Sequist et al., 2007; Beau-Faller et al., 2011; Chang et al., 2011; Han et al., 2011; Penzel et al., 2011; Zheng et al., 2011), salivary gland carcinoma (Clauditz et al., 2012), upper aerodigestive tract (Na et al., 2007; Szymanska et al., 2010) *2 different mutations present together on same haplotype at codons 773 and 774 in the same patient s Variant detected by Sanger sequencing in tumor and corresponding normal tissue ss Mutation validated by Sanger sequencing in tumor tissue

44 EGFR mutation: Leu858Arg in FFPE LAC sample

45 Mutaatio EGFR-eksonissa 21 ( Leu858Arg); keuhkojen adenokarsinooma; FFPE näyte; potilas hyötyi EGFR-estohoidosta

46 FFPE: KRAS GLY(12)ALA mutation in LAC

47 FFPE: BRAF mut V600E in CRC

48 Mutated Ephrin Receptor Genes in Non-Small Cell Lung Carcinoma and Their Occurrence with Driver Mutations Targeted Resequencing Study on Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tumor Material of 81 Patients Satu Mäki-Nevala 1, Virinder Kaur Sarhadi 1, Katja Tuononen 1, Sonja Lagström 2, Pekka Ellonen 2, Mikko Rönty 3, Aino Wirtanen 1, Aija Knuuttila 4, Sakari Knuutila 1,3 Genes Chromosomes & Cancer (2013) 52:

49 EML4-ALK -fuusio NSCLC (2-10 %) Inversio kromosomissa 2p Onkogeeninen TK TK-estäjille sensitiivinen Oma entiteetti

50 Targeted Resequencing Reveals ALK Fusions in Non-Small Cell Lung Carcinomas Detected by FISH, Immunohistochemistry, and Real-Time RT-PCR: A Comparison of Four Methods Tuononen, K., Sarhadi, V.K., Wirtanen, A., Rönty, M. J., Salmenkivi, K., Knuuttila, A., Remes, S., Telaranta-Keerie, A. I.,Bloor, S., Ellonen, P. & Knuutila, S. Bio Med Res Int (2013)2013:

51 Concordance of the results of ALK fusions by TDS, FISH, PCR, and IHC in LAC Results from 95 formalin-fixed paraffinembedded tumor tissue specimens from 87 patients with non-small cell lung carcinoma showed 100 percent concordance: six positive and 81 negative specimens were detected. Faculty of Medicine / Haartman Institute / Department of Pathology / Sakari Knuutila

52 Käytetyt menetelmät ALK-fuusion osoittamisessa FISH: Vysis ALK Break Apart FISH probe kit PCR: AmoyDx EML4-ALK Fusion Gene Detection Kit IHC: Novocastra clone 5A4 by BenchMark XT Faculty of Medicine / Haartman Institute / Department of Pathology / Sakari Knuutila

53 Positive cases detected by FISH, IHC, RT-PCR, and targeted next-generation sequencing (NGS) Sample ID Age Sex Smoking FISH IHC RT-PCR NGS Fusion type / % of positive cells Variant type Fusion /break position in ALK LC1 46 F Non-smoker Deletion /70% Strongly positive EML4-ALK variants 1/2/3a/3b chr2: LC11 48 M Non-smoker Inversion /46% Strongly positive EML4-ALK variants 1/2/3a/3b chr2: LC14* 44 M Non-smoker Inversion/74% Not studied EML4-ALK variants 1/2/3a/3b chr2: LC74* 44 M Non-smoker Inversion/46% Strongly positive EML4-ALK variants 1/2/3a/3b chr2: LC51 51 M Non-smoker Deletion/66% Strongly positive EML4-ALK variants 1/2/3a/3b chr2: M Non-smoker Deletion /40% Strongly positive EML4-ALK variants 1/2/3a/3b Not studied *LC14 and LC74 are samples from the same patient but from a different FFPE block.

54

55 Targeted Deep Sequencing of 9p Region in Acute Lymphoblastic Leukemia Yields Concordant Results with Array CGH and Reveals Novel Genomic Alterations. Sarhadi, V.K., Lahti, L., Scheinin, I., Tyybäkinoja, A., Savola, S., Usvasalo, A., Elonen, E., Ellonen, P., Saarinen-Pihkala, UM. & Knuutila, S. Genomics 102(3):182-8, 2013

56

57 Missä NGS analyysi tulisi tehdä vaikuttavia tekijöitä Logistiikka, näytteen käsittely, DNA:n eristys ja kysymyksen asettelu ja kokonaisnäkemys biomarkkerianalytiikasta Kytkeytyy perushistopatologiseen diagnostiikkaan Laitteiston hinta Ei maksa maltaita: Euroa Sisäänrakennetut ohjelmistot Perusbioinformatiikan osaaminen riittää Molekyyligenetiikan osaaminen tarpeen

58 Mikä erityisen tärkeää pohdittaessa missä NGS? Pysyä ajan hermolla: kansainvälinen ja kansallinen monitieteinen yhteistoiminta Uudet biomarkkerit Uusi teknologia Oikea-aikainen, joustavasti ja nopeasti muuntautuva uusiman tiedon ja kliinisen tarpeen mukaan (kerran jälkijunassa aina jälkijunassa) Tutkimustoiminta olla utelias uudesta tiedosta ja sen soveltamisesta potilaiden parhaaksi

59

60 Patients Chemonaïve Age 18 years Adenocarcinoma histology Never or light ex-smokers* Life expectancy 12 weeks PS 0-2 Measurable stage IIIB / IV disease Study design Gefitinib (250 mg / day) 1:1 randomisation Carboplatin (AUC 5 or 6) / paclitaxel (200 mg / m 2 ) 3 weekly # Endpoints Primary Progression-free survival (noninferiority) Secondary Objective response rate Overall survival Quality of life Disease-related symptoms Safety and tolerability Exploratory Biomarkers EGFR mutation EGFR-gene-copy number EGFR protein expression * Never smokers, <100 cigarettes in lifetime; light ex-smokers, stopped 15 years ago and smoked 10 pack years; # limited to a maximum of 6 cycles Carboplatin / paclitaxel was offered to gefitinib patients upon progression PS, performance status; EGFR, epidermal growth factor receptor Mok et al 2008